姜廣路 黃海榮

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中國(guó)結(jié)核分枝桿菌表型藥物敏感性試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)回顧

姜廣路 黃海榮

中國(guó)耐藥結(jié)核病疫情依然嚴(yán)峻，結(jié)核分枝桿菌表型藥物敏感性檢測(cè)方法在耐藥結(jié)核病的診斷中占有重要地位。鑒于目前國(guó)內(nèi)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南中同時(shí)規(guī)定絕對(duì)濃度法和比例法為標(biāo)準(zhǔn)方法，且兩者操作步驟有很大不同，對(duì)患者治療、耐藥監(jiān)測(cè)造成困惑。因此，有必要了解國(guó)內(nèi)耐藥結(jié)核病檢測(cè)方法的發(fā)展過程，以利于檢測(cè)方法的規(guī)范化。作者回顧了我國(guó)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的歷史，總結(jié)問題并提出建議，以期為結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)臨床檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化提供有價(jià)值的信息。

分枝桿菌，結(jié)核； 結(jié)核, 抗多種藥物性； 微生物敏感性試驗(yàn)； 參考標(biāo)準(zhǔn)

我國(guó)結(jié)核病控制目前面臨的主要挑戰(zhàn)為耐藥、人口流動(dòng)、MTB和HIV雙重感染，其中結(jié)核病耐藥問題尤為突出。自2006年開展耐多藥結(jié)核病控制項(xiàng)目以來(lái)，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性測(cè)定日益發(fā)揮著重要作用。雖然近年來(lái)以檢測(cè)耐藥基因突變?yōu)槭侄蔚哪退幏肿釉\斷技術(shù)發(fā)展迅猛，但已知耐藥基因突變無(wú)法完全解釋結(jié)核分枝桿菌耐藥現(xiàn)狀。這就決定其無(wú)法完全替代表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)具有直觀和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，因此，表型藥敏試驗(yàn)仍是目前診斷結(jié)核分枝桿菌耐藥的“金標(biāo)準(zhǔn)”。國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍主要采用以羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)。目前，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的方法尚未統(tǒng)一，包括絕對(duì)濃度法、比例法、分枝桿菌生長(zhǎng)指示管(Mycobacteria growth indicator tube，MGIT)法等，甚至同一實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不同目的也采用了不同方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，有必要對(duì)抗結(jié)核藥物敏感性檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；仡櫸覈?guó)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)方法發(fā)展的歷史，有助于深入了解各種方法的由來(lái)，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，從而提高藥敏試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

一、1963年以前中國(guó)抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)方法回顧

異煙肼于1912年被合成，鏈霉素和對(duì)氨基水楊酸均在1944年被發(fā)現(xiàn)、合成。這些藥物隨之用于治療結(jié)核病。隨著藥物應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，臨床觀察到的抗結(jié)核藥物療效降低的情況越來(lái)越多，了解結(jié)核分枝桿菌抗藥性的臨床需求越來(lái)越大，因此耐藥性檢測(cè)方法得以建立和發(fā)展。最初的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)主要是針對(duì)上述3種藥物。

1946年，Youmans和Williston[1]即開始對(duì)鏈霉素的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株進(jìn)行研究。1952年，Wilking等[2]通過對(duì)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥菌株的研究，將鏈霉素耐藥界限定為10 μg/ml。1953年，中國(guó)學(xué)者何長(zhǎng)清[3]將相關(guān)文章翻譯并發(fā)表，在我國(guó)首次提出鏈霉素耐藥界限應(yīng)設(shè)定為10 μg/ml。

1954年，北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)菌免疫系王鳳連教授參考Youmans、Fairbrother等的方法，開展了鏈霉素和異煙肼耐藥性檢測(cè)的研究[4]。其方法是將標(biāo)本處理后直接接種于豌豆瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中鏈霉素濃度分別為100、10、1、0.1 μg/ml，如發(fā)現(xiàn)有菌落生長(zhǎng)報(bào)告高度耐藥、中度耐藥、中度敏感、高度敏感，其中低度耐藥界限設(shè)定為10 μg/ml；培養(yǎng)基中異煙肼的濃度分別為10、1、0.1、0.01 μg/ml，其中低度耐藥界限設(shè)定為1 μg/ml。這是國(guó)內(nèi)開展的最早的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)。

1955年，郭均[5]使用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行異煙肼間接法耐藥性檢測(cè)，培養(yǎng)基內(nèi)異煙肼濃度分別為0.1、1、10、100 μg/ml，耐藥界限設(shè)定為1 μg/ml，并報(bào)告了異煙肼與鏈霉素、異煙肼與對(duì)氨基水楊酸聯(lián)合用藥出現(xiàn)耐藥較少的現(xiàn)象。1957年，吳紹青[6]在討論結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥菌株與致病力關(guān)系中提及，英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)于1953年規(guī)定結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)異煙肼的濃度界限為0.2 μg/ml。

二、絕對(duì)濃度法和比例法的溯源

1963年，世界衛(wèi)生組織(WHO)公報(bào)提出了結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)比例法、絕對(duì)濃度法、比率法等3種方法的概念[7]，并提出國(guó)際防癆聯(lián)盟推薦以不加淀粉的羅氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在此公報(bào)中，Gertrud Meissner(德國(guó))提出了絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)方法，含藥培養(yǎng)基中藥物濃度為：異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)濃度為5 μg/ml和10 μg/ml、對(duì)氨基水楊酸濃度為0.5 μg/ml和2 μg/ml，不同的藥物濃度代表細(xì)菌不同的耐藥程度；耐藥濃度界限為：異煙肼0.2 μg/ml、鏈霉素5 μg/ml、對(duì)氨基水楊酸0.5 μg/ml。培養(yǎng)基凝固溫度為82～85 ℃，時(shí)間為40～60 min，只凝固1次。接種方法為麥?zhǔn)?號(hào)管稀釋50倍，取一接種環(huán)(約10 μl)接種培養(yǎng)基，理論上接種量為2000～10 000 個(gè)菌，即10-4mg/ml。孵育4周，如生長(zhǎng)不良則延長(zhǎng)1～2周。如含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)的絕對(duì)數(shù)少于20個(gè)，即2000個(gè)細(xì)菌的1%，則報(bào)告敏感。文中特別提出，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室制定耐藥界限濃度應(yīng)以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)。

Canetti等[7-8]分別在1963年和1969年WHO 公報(bào)中2次報(bào)道了比例法藥敏試驗(yàn)方法，該方法常規(guī)檢測(cè)含藥培養(yǎng)基中的藥物濃度：異煙肼為0.2 μg/ml和1 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)為4 μg/ml和10 μg/ml、對(duì)氨基水楊酸為0.5 μg/ml和1 μg/ml；耐藥濃度界限為：異煙肼為0.2 μg/ml、鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)為4 μg/ml、對(duì)氨基水楊酸為0.5 μg/ml。當(dāng)含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落數(shù)達(dá)到或大于對(duì)照培養(yǎng)基的1%時(shí)，即為耐藥。如果用于研究待測(cè)菌不同藥物濃度的耐藥情況時(shí)，才將含藥濃度范圍擴(kuò)大，異煙肼濃度分別為0.1、0.2、1、5 μg/ml，鏈霉素(雙氫硫酸鏈霉素)分別為2、4、10、100 μg/ml，對(duì)氨基水楊酸分別為0.25、0.5、1、10 μg/ml。由此可見，從創(chuàng)立之初，絕對(duì)濃度法和比例法常規(guī)檢測(cè)的原理和含藥濃度是相同或相近的。只有用于科研時(shí)，異煙肼濃度才大于1 μg/ml，鏈霉素濃度可達(dá)到100 μg/ml，對(duì)氨基水楊酸濃度可達(dá)到10 μg/ml，這些濃度恰恰成為了中國(guó)絕對(duì)濃度法的藥物高濃度。1969年的WHO公報(bào)又進(jìn)一步明確了比例法的地位，并豐富了測(cè)定藥物的種類，提出了“原發(fā)耐藥、獲得性耐藥”的概念，并重點(diǎn)論述了確定濃度界限的方法[8]。這成為了1996年WHO和國(guó)際防癆和肺部疾病聯(lián)合會(huì)組織的結(jié)核病耐藥性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中藥敏試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)[7]。

1963年，《中國(guó)防癆雜志》刊登了1963年6月3日的全國(guó)結(jié)核病學(xué)術(shù)會(huì)議《關(guān)于測(cè)定結(jié)核菌對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)方法的意見》(簡(jiǎn)稱《意見》)一文[9]，文中沿用含淀粉的羅氏培養(yǎng)基，間歇加熱2次，分別為85 ℃ 40 min和80 ℃ 30 min，細(xì)菌接種量為0.1 mg, 即1 mg/ml接種0.1 ml，異煙肼濃度為0.1、1、10 μg/ml，鏈霉素(未強(qiáng)調(diào)使用雙氫硫酸鏈霉素，但強(qiáng)調(diào)鏈霉素加熱后易失效，要求培養(yǎng)基加熱凝固前鏈霉素實(shí)際濃度雙倍于規(guī)定濃度，即加入雙倍量的鏈霉素)濃度分別為1、10、100 μg/ml，對(duì)氨基水楊酸濃度分別為0.1、1、10 μg/ml。孵育4周報(bào)告結(jié)果，是否耐藥待后期與臨床進(jìn)行比對(duì)決定。此意見存在以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)羅氏培養(yǎng)基含有淀粉；(2)培養(yǎng)基制備藥物因二次加熱而導(dǎo)致?lián)p耗大；(3)細(xì)菌接種量大；(4)含藥物濃度介于WHO規(guī)定耐藥界限的兩側(cè)。以上幾個(gè)特點(diǎn)導(dǎo)致將來(lái)確定藥物濃度界限時(shí)會(huì)選擇高濃度。另外，實(shí)驗(yàn)室并不進(jìn)行獨(dú)立判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果，而是與臨床治療結(jié)果比對(duì)后決定，這導(dǎo)致后期(1996年)國(guó)內(nèi)絕對(duì)濃度法的應(yīng)用指南中未規(guī)定耐藥判讀標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)臨床醫(yī)生造成一定困擾。

1964年，高東哲和鄭翼宗[10-11]就結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定方法中的細(xì)菌接種量進(jìn)行了研究。該研究使用的羅氏培養(yǎng)基仍沿用凝固2次的方法，提出了使用0.5%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(Tween-80)均勻液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)方法制備的菌液較瑪瑙乳缽研磨法和錐形瓶玻璃珠振蕩法更均勻，并認(rèn)為1963年《意見》中提出的細(xì)菌接種量0.1 mg的數(shù)值過大，細(xì)菌接種量在10-3～10-4mg較為適合。

1965年，陳惠蘭和王小天[12]使用11例初治患者的分離菌株，對(duì)1963年《意見》規(guī)定方法進(jìn)行研究。研究中，羅氏培養(yǎng)基凝固2次，鏈霉素量加倍但效價(jià)為1，對(duì)氨基水楊酸效價(jià)為0.72；菌液濃度為1 mg/ml，分別以滴管和直徑3 mm接種環(huán)接種0.1 ml 和一環(huán)(近0.01 ml)，孵育4～8周。研究結(jié)論為報(bào)告時(shí)間以4周為宜，菌量高低的影響不大，異煙肼、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸濃度界限分別為0.5、2、1 μg/ml為宜。

1980年，吳愛棣[13]對(duì)利福平耐藥性方法進(jìn)行研究，以確定利福平藥敏試驗(yàn)濃度界限。研究使用的羅氏培養(yǎng)基凝固2次(85 ℃ 1 h，隔日后80 ℃ 1 h)，所用菌株分別來(lái)自從未用過利福平的患者(45例)，以及使用利福平1個(gè)月至3年的患者(43例)，接種量為10-3mg(10-2mg/ml接種0.1 ml)，含藥培養(yǎng)基菌落超過10個(gè)為耐藥。研究結(jié)論認(rèn)為，利福平耐藥的濃度界限應(yīng)設(shè)定為50和200 μg/ml。

1980年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)總結(jié)1979年11月的“全國(guó)結(jié)核病防治學(xué)術(shù)會(huì)議”的專家意見，出版了《抗結(jié)核藥物耐藥性測(cè)定暫行規(guī)定》[14]，規(guī)定所用培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基，測(cè)定藥物種類和濃度(單位為μg/ml)分別是：鏈霉素(10、100)、異煙肼(1、10)、利福平(50、250)、乙胺丁醇(5、50)、卷曲霉素(10、100)、對(duì)氨基水楊酸(1、10)、卡那霉素(10、100)、乙硫異煙胺(25、100)、環(huán)絲氨酸(50、200)、氨硫脲(10、100)，接種量為10-2mg，含藥培養(yǎng)基生長(zhǎng)11個(gè)菌落及以上判定為耐藥，低濃度含藥培養(yǎng)基耐藥即認(rèn)為耐藥。特別注明制備鏈霉素含藥培養(yǎng)基要加入2倍于規(guī)定濃度的鏈霉素，卡那霉素和卷曲霉素含藥培養(yǎng)基加入10倍于規(guī)定濃度的藥物。

中國(guó)防癆協(xié)會(huì)于1996年制定了《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[15]，涉及藥敏試驗(yàn)方法的內(nèi)容中去除了環(huán)絲氨酸，但鏈霉素仍為加入2倍量藥物，卡那霉素和卷曲霉素仍為加入10倍量藥物；接種量降低為10-3mg。此規(guī)程未明確指出耐藥結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，最大的變更是羅氏培養(yǎng)基不再加熱2次，但并無(wú)相應(yīng)的藥物濃度改變和微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證。中國(guó)防癆協(xié)會(huì)2006年版的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[16]關(guān)于絕對(duì)濃度法結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定的判讀，將“耐藥”定義為含藥培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)面積達(dá)到“+”及以上，最大的變更是制備含藥培養(yǎng)基時(shí)鏈霉素不再加倍，但卡那霉素和卷曲霉素仍加10倍量。許多結(jié)核病?？漆t(yī)院仍沿用此絕對(duì)濃度法的規(guī)程。

三、藥敏試驗(yàn)方法的應(yīng)用及比例法的引進(jìn)推廣

20世紀(jì)60—90年代，國(guó)內(nèi)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，包括預(yù)防體系的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)療體系的實(shí)驗(yàn)室，普遍應(yīng)用絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，而且1990和2000年的全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法均采用了絕對(duì)濃度法，其數(shù)據(jù)更便于與國(guó)內(nèi)耐藥數(shù)據(jù)比較。自1996年起，河南、山東等多個(gè)省份在WHO支持下開展了結(jié)核病耐藥性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，所采用的是基于1963年和1969年WHO公報(bào)的比例法[17]，從此比例法藥敏試驗(yàn)開始在結(jié)核病預(yù)防體系的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，由于結(jié)核病預(yù)防體系實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)一步統(tǒng)一，且較多國(guó)際合作和國(guó)際交流項(xiàng)目的開展，促使了比例法藥敏試驗(yàn)的普及。2007年全國(guó)結(jié)核病耐藥基線調(diào)查和2010年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查采用比例法藥物敏感性測(cè)定方法，其結(jié)果更便于同世界各國(guó)的耐藥數(shù)據(jù)比較。

四、絕對(duì)濃度法和比例法的差異及相關(guān)研究

由于絕對(duì)濃度法和比例法同時(shí)在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，甚至同一實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不同工作目的，采用不同方法。造成諸多耐藥結(jié)果不可比較，是否統(tǒng)一方法也成為爭(zhēng)論的熱點(diǎn)，因此國(guó)內(nèi)很多學(xué)者就藥敏試驗(yàn)方法的改良、絕對(duì)濃度法和比例法一致性進(jìn)行過多項(xiàng)研究。張莉等[18]、楊立濤等[19]、陳裕等[20]均認(rèn)為最佳菌液濃度是10-2和10-4mg/ml。劉宇紅等[21]研究表明，比例法和絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)的異煙肼和乙胺丁醇結(jié)果存在明顯差異，但結(jié)果有差異的菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均在兩種方法耐藥濃度界限之間。丁北川等[22]研究顯示，采用WHO推薦的比例法和絕對(duì)濃度法測(cè)定的耐藥結(jié)果一致，但比較WHO推薦的比例法和我國(guó)普遍采用的絕對(duì)濃度法獲得的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、利福平等結(jié)果均有差異，且異煙肼差異明顯。黎友倫等[23]研究認(rèn)為，接種量10-3和10-4mg對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果影響差異不明顯。

五、絕對(duì)濃度法與比例法的差異原因分析

回顧我國(guó)絕對(duì)濃度法和比例法的發(fā)展歷史，不難發(fā)現(xiàn)，這兩種方法原理均基于細(xì)菌的MIC。兩種藥敏試驗(yàn)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。比例法設(shè)計(jì)從原理上對(duì)細(xì)菌接種量進(jìn)行了矯正，一定程度上減少了細(xì)菌接種量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，但操作相對(duì)復(fù)雜；絕對(duì)濃度法操作簡(jiǎn)單，但容易受到細(xì)菌接種量的影響，可重復(fù)性相對(duì)要差。絕對(duì)濃度法可以認(rèn)為是一種簡(jiǎn)化了濃度選擇的MIC法，也可認(rèn)為是一種在精確細(xì)菌接種量情況下的比例法，兩種方法原理上完全相同，并無(wú)對(duì)立之處。

縱觀國(guó)內(nèi)結(jié)核分枝桿菌耐藥性試驗(yàn)絕對(duì)濃度法的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展歷史，對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選擇、培養(yǎng)基制作、藥粉的效價(jià)和加入量、細(xì)菌接種量等因素存在與WHO公報(bào)不同之處，而且變更時(shí)缺乏微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

在臨床病例方面，參考WHO公報(bào)和國(guó)際防癆聯(lián)盟公報(bào)，藥敏試驗(yàn)方法的菌株來(lái)源是未治療患者菌株和治療失敗患者菌株，確定濃度界限是能將兩組菌株最大限度區(qū)分的濃度，才能被認(rèn)為是源于臨床并指導(dǎo)臨床用藥的實(shí)驗(yàn)室方法。因此，在確定藥敏試驗(yàn)方法時(shí)，選擇患者標(biāo)準(zhǔn)方面需要進(jìn)一步統(tǒng)一。

在實(shí)驗(yàn)室方面，可能受間歇滅菌觀念的影響，最初國(guó)內(nèi)羅氏培養(yǎng)基凝固規(guī)定為2次，造成對(duì)溫度敏感的藥物在培養(yǎng)基制備過程中大量降解。雖然通過增加藥量加以彌補(bǔ)，但用量增加的程度缺乏數(shù)據(jù)支持。1996年制定的《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[15]將羅氏培養(yǎng)基凝固次數(shù)改為1次，但藥物濃度并未改變，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)藥物含量偏高，因此實(shí)際應(yīng)用中耐藥率降低。藥粉加倍是基于化學(xué)反應(yīng)的考慮，并無(wú)微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，導(dǎo)致與比例法的結(jié)果差異較大。

因結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁脂質(zhì)較多，其在懸濁液中不易分散，早期缺乏統(tǒng)一的理想的細(xì)菌研磨器材。少數(shù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌研磨使用瑪瑙研缽，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用玻璃滴管在普通玻璃試管管壁研磨，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌分散度不夠，接種后生長(zhǎng)菌落數(shù)較少，這可能是提高接種量的原因之一。

以上因素導(dǎo)致國(guó)內(nèi)絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果存在較大的偏差，表現(xiàn)為重復(fù)性差，與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果有較大差異。諸多學(xué)者對(duì)兩種方法的研究表明，兩種方法的差異主要原因集中于濃度界限差別較大的藥物，即藥物濃度差異所導(dǎo)致，而接種量在一定范圍內(nèi)變化對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果影響不大[20-22]。

六、藥敏試驗(yàn)方法面臨挑戰(zhàn)

第一，目前表型藥敏試驗(yàn)方法在疾病控制體系實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)療體系實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)兩種方法并行的現(xiàn)象。疾病控制體系實(shí)驗(yàn)室多采用比例法；醫(yī)院體系部分實(shí)驗(yàn)室采用比例法，部分實(shí)驗(yàn)室采用絕對(duì)濃度法。方法與結(jié)果的差異使臨床醫(yī)生對(duì)患者治療產(chǎn)生困惑，對(duì)公共衛(wèi)生醫(yī)生連續(xù)比較流行病學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)造成困難。

第二，如前文所述，對(duì)于采用或者不采用某種藥敏試驗(yàn)方法，多為相關(guān)規(guī)定所影響，或是WHO采用的方法，或是國(guó)內(nèi)規(guī)定的方法，而國(guó)內(nèi)相關(guān)規(guī)定卻缺乏足夠的適合我國(guó)實(shí)際情況的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的支持。

第三，即使是WHO推薦的比例法，仍有值得探討之處。張健源等[24]研究認(rèn)為，增大接種量可以發(fā)現(xiàn)更多耐藥菌株。張楠等[25]通過檢測(cè)基因突變，認(rèn)為乙胺丁醇的濃度界限應(yīng)從2 μg/ml降為1.6 μg/ml。

此外，目前比例法的鏈霉素的藥物種類和濃度界限也有值得討論之處。WHO和國(guó)際防癆和肺部疾病聯(lián)合會(huì)公報(bào)最初規(guī)定的鏈霉素比例法藥敏試驗(yàn)應(yīng)用的藥粉為雙氫硫酸鏈霉素，耐藥濃度界限為4 μg/ml。而目前因雙氫硫酸鏈霉素不良反應(yīng)大，臨床已經(jīng)放棄使用，制藥企業(yè)已經(jīng)不再生產(chǎn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室難以獲得雙氫硫酸鏈霉素藥物純粉，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室只能以硫酸鏈霉素替代，這可能會(huì)導(dǎo)致鏈霉素假耐藥增多。比例法鏈霉素藥物濃度界限是否恢復(fù)到10 μg/ml，以及鏈霉素和乙胺丁醇實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)符合率不高的原因值得進(jìn)一步研究[26]。

第四，許多臨床醫(yī)生和預(yù)防人員認(rèn)為藥敏試驗(yàn)方法由實(shí)驗(yàn)室專家確定即可，這種觀點(diǎn)忽略了藥敏試驗(yàn)的實(shí)際意義，不利于耐藥檢測(cè)方法的建立和評(píng)估。在臨床治療和流行病學(xué)調(diào)查中涉及的耐藥，則是指WHO規(guī)定的耐藥標(biāo)準(zhǔn)，即“明顯不同于未接觸藥物的野生菌株，治療反應(yīng)性下降”。而對(duì)于實(shí)驗(yàn)室人員，只要細(xì)菌能在含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，即認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室耐藥。兩者的差異及藥敏試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)的特點(diǎn)，導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值降低。

第五，針對(duì)藥物敏感性檢測(cè)的方法目前多集中于分子生物學(xué)的快速檢測(cè)方法和液體培養(yǎng)基法，如文獻(xiàn)所言，對(duì)耐藥結(jié)核病的研究多注重于流行病學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)測(cè)定方法的基礎(chǔ)性研究很少[27-30]。作為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基藥敏試驗(yàn)方法仍有諸多問題沒有解決。

綜上所述，有必要進(jìn)一步研究我國(guó)現(xiàn)有的耐藥性檢測(cè)方法與臨床治療、基因突變的相關(guān)性，確定耐藥濃度界限，將耐藥性檢測(cè)與“治療反應(yīng)性下降”相關(guān)聯(lián)，提高實(shí)驗(yàn)室結(jié)果對(duì)臨床治療結(jié)果的預(yù)示作用，更好地為結(jié)核病患者服務(wù)。

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(本文編輯：李敬文)

Review of the criteria on drug susceptibility test ofMycobacteriumtuberculosisin China

JIANGGuang-lu,HUANGHai-rong.

TuberculosisClinicalLaboratory,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

The epidemic situation of drug-resistant tuberculosis in China is still severe．The phenotypic drug susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisplays an important role in diagnosis of drug-resistant tuberculosis. A lot of differences between absolute concentration method and proportion method of domestic guideline of labora-tory testing of tuberculosis cause confusion in treatment and drug-resistance monitoring. It is necessary to know the development of drug-resistant test in China, as it is helpful to standardize the detection method. This paper reviews the history of criterion of drug susceptibility test on tuberculosis in China, summarizes problems and puts forward some suggestions, in order to provide useful information for optimization drug susceptibility test.

Mycobacteriumtuberculosis； Tuberculosis, multidrug-resistant； Microbial sensitivity tests； Reference standards

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.002

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室

黃海榮，Email: huanghairong@tb123.org

2016-07-11)