劉旭暉 張愛梅 盧水華

?

·論著·

Xpert MTB/RIF 試驗用于肺結核快速檢測的臨床研究

劉旭暉 張愛梅 盧水華

目的探討Xpert MTB/RIF 試驗用于肺結核病快速檢測的診斷價值。 方法對上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科2014年7月至2015年4月收治的402例肺部疾病患者的呼吸道標本進行Xpert MTB/RIF 試驗檢測，選取以下四組人群進行分析研究：①高度支持肺結核診斷的人群；②臨床排除肺結核診斷的人群；③常規(guī)細菌培養(yǎng)以及Xpert MTB/RIF 試驗提示利福平耐藥的人群；④留取下呼吸道樣本(支氣管鏡檢)的人群。所有患者都進行了常規(guī)細菌學涂片、培養(yǎng)檢測進行對照分析。結果Xpert MTB/RIF試驗在本研究中總的敏感性為84.7% (95%CI, 0.81～0.88), 特異性為65.5% (95%CI, 0.51～0.78), 陽性預測值為93.9% (95%CI, 0.91～0.96), 陰性預測值為40.4% (95%CI, 0.30～0.51)。 Xpert MTB/RIF試驗比常規(guī)的細菌涂片+培養(yǎng)的方法敏感性更好 (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Xpert MTB/RIF試驗發(fā)現(xiàn)了11.8%的利福平耐藥，與常規(guī)的細菌學培養(yǎng)結果無顯著差異。本研究中Xpert MTB/RIF試驗對114例下呼吸道灌洗標本的檢出率為79.8%(91例)，略高于上呼吸道標本(70.2%，P=0.126)。結論Xpert MTB/RIF 試驗用于快速檢測肺結核病，其敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的細菌學檢測方法，并且能準確預測利福平耐藥的出現(xiàn)，是一種值得推薦的新檢測手段。Xpert MTB/RIF 試驗對下呼吸道標本中結核菌的檢出率略高于上呼吸道標本，兩者未見明顯統(tǒng)計學差異。

Xpert MTB/RIF 試驗； 聚合酶鏈式反應； 肺結核； 耐藥性

對于發(fā)展中國家來說，結核病的負擔依舊沉重?？菇Y核藥物的耐藥率逐年上升，但是菌株耐藥性的檢測效率依然低下，結核病的快速診斷及耐藥性檢測是公共衛(wèi)生領域的世界性難題[1-4]。對于結核菌及其耐藥性的傳統(tǒng)檢測方法是抗酸染色鏡檢和結核分枝桿菌培養(yǎng)。在實際臨床應用中，抗酸染色的陽性率低，敏感性差，結核桿菌培養(yǎng)周期長且陽性率低，不能滿足快速診斷的需要。Xpert MTB/RIF試驗以全自動半巢式實時PCR技術為基礎，以rpoB基因為靶基因，可在2h內(nèi)同時檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥，對于結核病的快速診斷有重要意義。本研究將不同臨床背景的人群進行分組比較，旨在對Xpert MTB RIF試驗的臨床診斷價值進行評估。

對象和方法

一、 研究對象

對上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科從2014年7月至2015年4月收治的肺部疾病患者進行篩選，納入標準如下：①未進行抗結核治療，能夠留取足夠的呼吸道標本，有細菌學檢測結果; ②所有患者臨床資料、影像資料完整，最終診斷由臨床醫(yī)生、影像科醫(yī)生共同完成;③所有患者完成2個月隨訪對出院診斷進行評估; ④排除HIV感染者。結核病診斷標準按照中華醫(yī)學會結核病學分會2013年發(fā)布的《肺結核診斷和治療指南》制定。

二、 樣本收集及檢測流程

留取患者清晨深部痰液標本檢測，8 h內(nèi)進行Xpert MTB/RIF試驗檢測及常規(guī)細菌涂片培養(yǎng)。下呼吸道灌洗液標本處理方法同痰液。

1. Xpert MTB/RIF試驗[5-7]：用勻漿器將痰液在生物安全柜條件下充分勻漿后，按1︰2比例加入標配處理液，震蕩混勻(若混勻液粘稠，可適當加大比例至呈均勻、無懸浮物液體)，室溫靜置15 min，取2 ml混合液轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應盒中。樣品自動洗滌和過濾，自動超聲破碎樣品，釋放核酸，DNA與PCR試劑混合，半巢式熒光定量PCR擴增和檢測，打印結果。

2. 常規(guī)細菌學檢測：痰標本進行抗酸涂片熒光顯微鏡檢測以及BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。

三、分組方法

根據(jù)研究對象的臨床資料及隨訪結果取以下四類人群的檢測結果進行分析：①高度支持肺結核診斷的人群，包括菌陽肺結核和菌陰肺結核；②臨床排除肺結核診斷的人群，包括確診其他肺部疾病并治療有效者，以及不符合結核診斷標準并在隨訪過程中未發(fā)現(xiàn)任何結核病依據(jù)者；③常規(guī)細菌培養(yǎng)以及Xpert MTB/RIF 試驗提示利福平耐藥的人群；④取下呼吸道樣本的人群，指通過纖維支氣管鏡留取支氣管灌洗液標本的人群。

四、 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行檢測分析，以中華醫(yī)學會結核病學分會2013制定的結核病臨床診斷標準為本研究的主要診斷標準，計算敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及其95%置信區(qū)間。

結 果

本研究共納入402例患者，年齡15～84歲(中位年齡49歲)，男性257例，女性145例，其中114例支氣管灌洗液標本獲得檢測結果。125例(31.1%)患者痰抗酸桿菌涂片(3次)陽性；222例(55.2%)符合菌陰肺結核的診斷標準，189例(47.0%)患者細菌培養(yǎng)為結核分枝桿菌復合群；55例(13.7%)患者排除結核病診斷。Xpert MTB/RIF試驗共檢測出了313例陽性標本，其中真陽性294例，假陽性19例，敏感性為84.7%(95%CI, 0.81～0.88)，特異性65.5%(95%CI, 0.51～0.78)，陽性預測值為93.9%(95%CI, 0.91～0.96)，陰性預測值40.4%(95%CI, 0.30～0.51)。Xpert MTB/RIF試驗檢出率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)方法[84.7%(294/347)vs. 54.5%(189/347)，P<0.001]，同時顯著高于痰抗酸桿菌涂片+細菌培養(yǎng)的聯(lián)合檢出率[84.7%(294/347)vs. 58.8%(204/347)，P<0.001]。MTB/RIF試驗在痰抗酸涂片陽性患者中的檢出率高于在抗酸涂片陰性患者中的檢出率[91.2%(114/125)vs. 81.1%(180/222)，P=0.013]。

Xpert MTB/RIF試驗檢測出利福平耐藥率11.8%(41/347)，同時進行的細菌培養(yǎng)檢出利福平耐藥率10.7%(37/347)，兩種檢測方法均檢出利福平耐藥者30例，MTB/RIF試驗檢出而細菌培養(yǎng)未檢出耐藥11例，細菌培養(yǎng)檢出而MTB/RIF試驗未檢出耐藥7例，兩種方法的檢出率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。30例吻合的結果中，同時合并異煙肼耐藥的菌株共有11株(36.7%)。

Xpert MTB/RIF試驗對114例下呼吸道灌洗標本中結核菌的檢出率為79.8%(91例)，略高于上呼吸道標本(70.2%，P=0.126)。

討 論

一、Xpert MTB/RIF試驗的原理及優(yōu)越性

Xpert MTB/RIF試驗以Gene Xpert系統(tǒng)平臺及以半巢式實時定量PCR技術為基礎，將rpoB基因做為靶基因，自動提取DNA后擴增rpoB基因的192 bp片段進行檢測，采用6種分子信標同時檢測6種探針，其中5個相互重疊的分子探針(分別以探針A-E命名)選擇性覆蓋rpoB基因的8l bp核心區(qū)，檢測結核分枝桿菌存在的同時可以探知利福平是否耐藥。Gene Xpert系統(tǒng)是一種封閉性及自動化程度極高的檢測平臺，將標本放入一次性反應容器后不需要再次接觸檢測標本，系統(tǒng)可自動完成標本純化、離心、DNA提取、DNA擴增、DNA特異序列檢測、結果自動讀出等多個程序，2 h內(nèi)可以完成檢測。這些特點都顯示出了超過傳統(tǒng)檢測方法的優(yōu)越性，因此有潛在的推廣價值，目前世界衛(wèi)生組織已向全世界推廣這種檢測手段[8]。

二、Xpert MTB/RIF試驗診斷活動性肺結核病的價值

Xpert MTB/RIF試驗的敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的細菌涂片及細菌培養(yǎng)檢測，而且檢測速度快，有利于結核病的早期診斷。尤其值得一提的是Xpert MTB/RIF試驗在痰結核菌抗酸染色陰性的患者中具有高達81.1%的陽性率，顯著提高了此類患者的診斷效率，減少了結核病的漏診率。本研究獲得的特異度、陰性預測值均不理想，分別為65.5%和40.4%。這個結果可能源于非結核病組人群中Xpert MTB/RIF試驗的陽性例數(shù)偏高(19/55)。這19例患者包括11例肺部感染，2例胸腔積液,2例肺部腫瘤， 4例非特異性炎癥。肺部感染及胸腔積液病例均在未使用抗結核藥物的情況下治療好轉(zhuǎn)并隨訪2月未復發(fā)，肺部腫瘤及肺部非特異性炎癥均有肺穿刺診斷。目前發(fā)表的多項研究中均提示Xpert MTB/RIF試驗的假陽性率極低[9-17]，因此在本研究中發(fā)現(xiàn)的“假陽性”病例有更可能是真的存在結核感染而目前的臨床診斷標準尚不能確診的病例。對于這一點，可能與國內(nèi)高結核感染的背景有關，這些陽性結果可能需要更長時間的隨訪才能最終確定。

三、非結核分枝桿菌對于Xpert MTB/RIF試驗的影響

目前我國常見的非結核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)包括堪薩斯分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌等，這些細菌廣泛存在自然界，并可能定植于肺部疾病患者的呼吸道中。部分非結核分枝桿菌中也存在rpoB基因或類似基因，理論上有可能造成假陽性結果。目前在已發(fā)表的多項關于Xpert MTB/RIF試驗檢測報道中，非結核分枝桿菌造成假陽性的比例僅為0.6%[9]，因此本研究中未將其作為結果影響因素進行分析。

四、利福平耐藥性檢測

利福平作為最重要的抗結核藥物之一，其作用原理是抑制菌體上rpoB基因編碼的RNA聚合酶。幾乎所有利福平敏感菌株在該區(qū)域均具有相同的核酸序列，而95%以上的利福平耐藥菌株都有rpoB基因變異。rpoB基因變異引起利福平耐藥后，異煙肼出現(xiàn)耐藥的風險也明顯升高[18]。當細菌對兩種最主要的抗結核藥物都出現(xiàn)耐藥時，肺結核的治療難度會極大增加。傳統(tǒng)的利福平耐藥檢測依賴于細菌培養(yǎng)，平均耗時超過15 d以上(本研究中的平均藥敏檢出時間為33 d)，而Xpert MTB/RIF試驗可在2 h內(nèi)提供檢測結果，對于耐藥的早發(fā)現(xiàn)有積極意義。本研究中，兩種方法檢測利福平耐藥的敏感性無明顯差異，有4例耐藥結果不吻合。此類不吻合結果可能歸昝于表型耐藥檢測(細菌培養(yǎng))和基因耐藥檢測(Xpert MTB/RIF試驗)的差異性。表型檢測耐藥而基因檢測敏感的可能原因包括：①存在非rpoB編碼的耐藥位點、菌株細胞膜通透性改變、存在膜外排泵等；②表型敏感而基因檢測耐藥的可能由于基因的無明顯突變。

五、呼吸道標本的選擇

本研究中下呼吸道灌洗液的結核菌陽性檢出率略高于上呼吸道標本，兩者未見明顯統(tǒng)計學差異。由于本研究中選取的樣本量有限，而且進行支氣管灌洗的患者多有明顯支氣管病變，不能完全代表一般肺部疾病患者的情況，本研究不能充分判斷灌洗液是否有更好的檢測價值，需要更多相關研究證實。同時應認識到肺結核病是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，如何提高肺結核的診斷率，防止誤診、漏診是臨床上不可忽視一個重要問題，特別注意加強肺結核的防治工作[19-20]。

1 World Health Organization. Global tuberculosis report[C]. 2013.

2 Udwadia ZF. Tuberculosis control in India[J]. Lancet Infect Dis, 2003, 3(9): 535-536.

3 World Health Organization. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response[C]. 2010.

4 World Health Organization. Policy statement: automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF system[C]. 2011.

5 Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance[J]. N Engl J Med, 2010, 363(11): 1005-1015.

6 宋世森. 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術檢測菌株和痰標本的結果分析[J]. 結核病與肺部健康雜志, 2014, 3(2): 110-114.

7 高漫, 鄒遠嫵, 白廣紅, 等. Xpert MTB/RIF Assay在結核病診斷中的應用[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2015, 36(3)：413-414.

8 World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneousdetection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF system for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children: policy update[C]. 2013.

9 Steingart KR, Schiller I, Horne DJ, et al. Xpert MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults (Review) [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2014, 21(1): CD009593.

10 Reither K, Manyama C, Clowes P, et al. Xpert MTB/RIF assay for diagnosis ofpulmonary tuberculosis in children: A prospective, multi-centre evaluation[J]. J Infect, 2015, 70(4): 392-399.

11 Bates M, O′Grady J, Maeurer M, et al. Assessment of the Xpert MTB/RIF assay for diagnosis of tuberculosis with gastric lavage aspirates in children in sub-Saharan Africa: a prospective descriptive study[J]. Lancet Infect Dis, 2013, 13(1): 36-42.

12 Bates M, Ahmed Y, Chilukutu L, et al. Use of the Xpert(?) MTB/ RIF assay for diagnosing pulmonary tuberculosis comorbidity and multidrug-resistant TB in obstetrics and gynaecology inpatient wards at the University Teaching Hospital, Lusaka, Zambia[J]. Trop Med Int Health, 2013, 18(9): 1134-1140.

13 O′Grady J, Bates M, Chilukutu L, et al. Evaluation of the Xpert MTB/RIF assay at a tertiary care referral hospital in a setting where tuberculosis and HIV infection are highly endemic[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(9): 1171-1178.

14 Detjen AK, DiNardo AR, Leyden J, et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Respir Med, 2015, 3(6): 451-461.

15 Singh S, Singh A, Prajapati S, et al. Xpert MTB/RIF assay can be used on archived gastric aspirate and induced sputum samples for sensitive diagnosis of paediatric tuberculosis[J]. BMC Microbiol, 2015, 15: 191.

16 Zar HJ, Workman L, Isaacs W, et al. Rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis in African children in a primary care setting by use of Xpert MTB/RIF on respiratory specimens: a prospective study[J]. Lancet Glob Health, 2013, 1(2): e97-104.

17 Moussa HSh, Bayoumi FS, Ali AM. Evaluation of GeneXpert MTB/RIF assay for direct diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. Saudi Med J, 2016, 37(10): 1076-1081.

18 World Health Organization. Rapid implementation of the Xpert MTB/ RIF diagnostic test. Technical and operational ‘How-to’. Practical considerations[C]. 2011.

19 李王平, 潘蕾, 傅恩清, 等. 315例瘢痕狹窄型支氣管結核的臨床分析[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(1)： 5-9.

20 方源揚, 劉國強, 黃顯聰, 等. 景東縣2004-2013年肺結核防治的衛(wèi)生經(jīng)濟學分析[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(1)： 36-40.

(本文編輯：王亞南)

劉旭暉，張愛梅，盧水華. Xpert MTB/RIF 試驗用于肺結核快速檢測的臨床研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 524-527.

LiuXuhui,Email:liuuhui@shaphc.org

Objective To evaluate the clinical performance of Xpert MTB/RIF Assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods During July, 2014 to April, 2012, 402 cases with pulmonary diseases were involved in this study and respiratory tract specimens were carefully tested. Four groups were identified to analyze: (1) patients with clinical diagnosis of pulmonary tuberculosis; (2) patients clinically excluded from pulmonary tuberculosis; (3) patients with rifampin resistance; (4) patients with bronchial larvae specimen tested. All cases were not treated with anti-tuberculosis drugs before specimen collection and paired specimens were acid fast stained and cultured by Bactec MGIT 960 system. Result The overall sensitivity of Xpert MTB/RIF Assay in this study is 84.7% (95%CI, 0.81 to 0.88), specificity is 65.5% (95%CI, 0.51 to 0.78), positive predict value is 93.9% (95%CI, 0.91 to 0.96), negative predict value is 40.4% (95%CI, 0.30 to 0.51). Xpert MTB/RIF Assay is more sensitivity than traditional culture and acid fast stain method (84.7%vs. 58.8%,P<0.001). Rifampin resistance identified by Xpert MTB/RIF Assay is 11.8%, which shows no significant difference with culture method (10.7%,P=0.72). Lower respiratory tract specimens have relatively higher MTB/RIF Assay positive rate than upper respiratory tract specimens, but no significant difference (P=0.126). Conclusion Xpert MTB/RIF test for rapid detection of tuberculosis bacteriology detection method of the sensitivity is better than the traditional, and can accurately predict the emergence of Rifampicin resistance, it can be recommended as a new means of detection. Xpert MTB/RIF test of Mycobacterium tuberculosis in lower respiratory tract specimens detection rate is slightly higher than that of the upper respiratory tract specimens, while there is no significant difference.

Xpert MTB/RIF Assay; PCR; Tuberculosis; Drug resistance

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.012

201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心呼吸科

劉旭輝，Email: liuuhui@shaphc.org

R563

A

2015-08-10)

Clinical evaluation of using Xpert MTB/RIF assay as a rapid diagnosis of tuberculosisLiuXuhui,ZhangAimei,LuShuihua.Respiratorydepartment,ShanghaiPublicHealthClinicalCenterAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201508,China