孫文武 馬壯

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·綜述·

呼吸系統(tǒng)霧化基因治療研究進(jìn)展

孫文武 馬壯

呼吸系統(tǒng)疾??； 霧化治療； 基因治療

基因治療作為新的分子治療手段對(duì)人類疾病的治療有重大影響，然而基因治療的安全性和有效性是其應(yīng)用于臨床治療的主要障礙[1]。呼吸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生理功能使其內(nèi)表面與外界環(huán)境充分接觸，這樣以霧化形式進(jìn)行基因治療為呼吸道疾病治療提供了一種新的手段。這種霧化吸入性非侵入的轉(zhuǎn)基因方式逐漸被重視起來(lái)，近20年在這一領(lǐng)域取得了一些成果，也遇到了一些有待解決的難點(diǎn)。現(xiàn)對(duì)呼吸系統(tǒng)霧化吸入基因治療研究進(jìn)展作一綜述。

一、霧化設(shè)備

呼吸系統(tǒng)霧化轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在機(jī)體整體給藥基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，在呼吸系統(tǒng)基因霧化吸入轉(zhuǎn)染研究之初，對(duì)動(dòng)物整體給予載體修飾后的基因，觀察在靜脈和呼吸道氣溶膠給藥后肺部局部的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以在肺臟有基因表達(dá)，但經(jīng)靜脈方式多在動(dòng)脈分岔部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而霧化吸入的基因表達(dá)多在肺呼吸道上皮細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞表達(dá)[2-3]。Gautam等[4]研究表明霧化吸入的方式給予的轉(zhuǎn)基因方法只在肺局部有目的基因中表達(dá)，在機(jī)體其他部位沒(méi)有表達(dá)。

為了使目的基因很好地與液體一起形成氣溶膠，Lentz等[5]研究了多種霧化方法，主要包括：氣體流動(dòng)噴射霧化方式、超聲波霧化方式、高頻機(jī)械震動(dòng)方式和靜電射流方式等。氣流噴射式霧化機(jī)是應(yīng)用壓縮后的空氣，使氣體通過(guò)溶液，使溶液在霧化小室內(nèi)產(chǎn)生霧滴，并隨氣流飄散[6]。超聲霧化機(jī)是應(yīng)用超聲的震動(dòng)使溶液表面獲得能量后，霧滴飄散脫離液體表面[7]。靜電式霧化機(jī)是噴嘴處設(shè)置高壓靜電，使液滴帶電荷而飄散[8]。石英振蕩式霧化機(jī)是將液體放置在多孔小室內(nèi)，經(jīng)石英高頻振蕩后，在多孔噴嘴處形成霧滴，經(jīng)外加流動(dòng)空氣帶入患者呼吸道[9]。這些霧化手段在小分子(非基因性)藥物霧化中已取得較好的霧化治療效果，但對(duì)基因藥物的霧化效果并不理想。

在霧化過(guò)程中保持質(zhì)粒類長(zhǎng)鏈的基因藥物的完整性是影響肺轉(zhuǎn)基因治療的重要環(huán)節(jié)之一。臨床常用的是機(jī)械噴射的霧化機(jī)，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其他的霧化機(jī)較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，但在基因霧化中，在保持質(zhì)粒完整性環(huán)節(jié)，這些霧化機(jī)都表現(xiàn)出對(duì)質(zhì)粒的破壞作用[10]。霧化機(jī)對(duì)基因轉(zhuǎn)染霧化應(yīng)用效果的研究表明:在沒(méi)有修飾的質(zhì)粒載體霧化中，氣流噴射，機(jī)械振蕩及超聲方式對(duì)質(zhì)粒的完整性都有較大的破壞。并且DNA越長(zhǎng)，分子量越大，經(jīng)這些方法霧化后完整性越差[5]。而靜電噴射方式的霧化對(duì)基因破壞性要小一些[8]。另外，在霧化環(huán)節(jié)改變了基因藥物其他的理化性質(zhì)也會(huì)影響霧化治療效果。首先，無(wú)論采用什么樣的霧化機(jī)或霧化手段，直接霧化的效果表現(xiàn)在對(duì)液滴直徑大小的影響，直徑越大的液滴，越不易飄散，而直徑小的液滴更容易進(jìn)入到呼吸道末端，在肺內(nèi)分散性也越好。其次，基因性藥物為質(zhì)粒DNA柔性大分子，在霧化環(huán)節(jié)容易被沖擊破壞，可影響基因完整性和目的蛋白的表達(dá)。雖然霧化后產(chǎn)生的霧滴越小，對(duì)于肺內(nèi)藥物分布效果越好，但越小的霧滴在產(chǎn)生過(guò)程中，DNA分子受到的沖擊力也越大，分子的完整性也越容易招到破壞。同時(shí)質(zhì)粒等基因藥物，在機(jī)械性霧化機(jī)中時(shí)間越長(zhǎng)，被霧化的次數(shù)也就越多，受破壞的機(jī)會(huì)也就越大，長(zhǎng)鏈的片段化也就越加明顯[11]。為此兼顧兩種作用新型霧化機(jī)的研制是基因霧化治療中急需解決的問(wèn)題。但無(wú)論應(yīng)用什么樣的手段或儀器，霧化的效果最好是產(chǎn)生的霧滴越小，同時(shí)DNA破壞性越小，就越能達(dá)到臨床基因霧化需要。

在基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程研究中，無(wú)論哪種方式對(duì)基因治療的定量問(wèn)題都是難題，傳統(tǒng)的霧化機(jī)是將動(dòng)物放入密閉的容器內(nèi)或用面罩給患者進(jìn)行霧化，這種方式不僅浪費(fèi)，而且定量較為不準(zhǔn)確。為此瑞典的研究組設(shè)計(jì)了氣管內(nèi)給予霧化的給藥方式，采用微量霧化噴頭，經(jīng)呼吸道在氣管內(nèi)進(jìn)行霧化，并且在短時(shí)間內(nèi)(如吸氣時(shí)段期間)給予霧化，該方法不僅有節(jié)約效果，而且給予基因治療能夠定量相對(duì)精確[12]。王虹等[13]研究表明，利用這種氣道內(nèi)霧化方式可提高基因轉(zhuǎn)然效率至300倍。對(duì)于病毒性載體可利用激光對(duì)溶液照射后產(chǎn)生蒸汽后霧化[14]。此外，霧化之后，對(duì)基因藥物顆粒的大小和表面電荷的影響也應(yīng)被考慮，有可能基因完整性可以保持完好，而基因藥物的顆粒性質(zhì)包括納米級(jí)粒徑和顆粒表面電勢(shì)出現(xiàn)變化也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果。

二、基因修飾物

肺臟轉(zhuǎn)基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體。病毒類載體包括腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。雖然病毒類載體對(duì)呼吸道內(nèi)皮能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染，但病毒類載體具有抗原性和對(duì)機(jī)體潛在的威脅，會(huì)影響其在臨床上的應(yīng)用，重復(fù)使用病毒類載體會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[15]。病毒載體對(duì)質(zhì)粒大小有限制，而非病毒載體可以攜帶相對(duì)大的基因質(zhì)粒[16]。但是，非病毒類基因載體必須克服物理，化學(xué)和生物性屏障，這是轉(zhuǎn)基因治療的主要障礙。非病毒性載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體等高分子聚合物。目前，對(duì)基因載體修飾的高分子聚合物研究較為深入，已成為肺霧化基因治療的主要基因載體修飾手段。

研究發(fā)現(xiàn)由DOTMA和DOPE組成的脂質(zhì)體可以將基因性物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，由于DOTMA的脂質(zhì)體表面擁有正電荷，同基因等物質(zhì)的負(fù)電荷結(jié)合，與生物膜接觸后可以與膜融合或內(nèi)化方式將基因物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，DOTMA是人工合成的去垢劑，有18個(gè)炭原子、疏水鏈和一個(gè)氨基離子，摻入DOPE后可形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體[17-18]。Crook等[19]發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以應(yīng)用到霧化吸入轉(zhuǎn)基因治療中，以保護(hù)基因不被核酸酶破壞。在動(dòng)物肺中可以檢測(cè)到目的基因表達(dá)，但也有研究表明應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體修飾的基因質(zhì)粒在霧化過(guò)程中造成基因損壞。Schwarz等[20-21]發(fā)現(xiàn)改變陽(yáng)離子脂質(zhì)體多種不同組分可以增加基因藥物穩(wěn)定性，從而增加基因轉(zhuǎn)染效果。Colonna等[22]研究表明陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹的干粉可以攜帶基因物質(zhì)進(jìn)行霧化基因治療。

另一種較為有代表性的高分子聚合物是PEI，是一種陽(yáng)離子聚合物，它修飾后的基因具有在體外培養(yǎng)的細(xì)胞或組織中均轉(zhuǎn)染效率，因其每三個(gè)原子中有一個(gè)是質(zhì)子化的氮原子，因此具有較高的緩沖能力，并且可以將基因引導(dǎo)入核，PEI也可以保護(hù)基因不被酶降解[23-24]。Thomas等[25]研究表明，由于這種結(jié)合很牢固，PEI/DNA復(fù)合物一同進(jìn)入細(xì)胞，甚至一同進(jìn)入到細(xì)胞核，乃至在細(xì)胞內(nèi)的基因和高分子聚合物不能完全被分開(kāi)，從而可影響細(xì)胞內(nèi)的生物利用效率，因此有研究對(duì)PEI進(jìn)行多種方式的修飾改造，以增加生物利用度和減少細(xì)胞毒性。不同于PEI作用機(jī)制，陽(yáng)離子脂質(zhì)體和基因性物質(zhì)結(jié)合后，具有細(xì)胞膜的相似性特征，其部分與生物膜結(jié)合，內(nèi)容物進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，也有部分是以內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞[26]。

三、基因載體溶液物化性質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因效率的影響

在研究高分子聚合物對(duì)組織轉(zhuǎn)染效果的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因的溶液某些性質(zhì)改變可以影響轉(zhuǎn)染效率，如改變?nèi)芤旱乃釅A度可以影響基因轉(zhuǎn)染效率， pH值可能改變高分子聚合物和基因復(fù)合物顆粒的表面電勢(shì)，從而影響復(fù)合物與細(xì)胞表面的關(guān)系[27]。也有研究表明低滲透壓增加基因轉(zhuǎn)染，滲透壓可改變基因復(fù)合物顆粒的粒徑，因此影響進(jìn)入細(xì)胞的效率[28]。Sun等[29]研究推測(cè)低滲透壓還可以通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度環(huán)節(jié)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)基因物質(zhì)的攝取，從而增強(qiáng)細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)方式，增加細(xì)胞內(nèi)化活動(dòng)，這樣的推測(cè)符合已有報(bào)道[30]。Elfinger等[31-33]發(fā)現(xiàn)在溶液中加入細(xì)胞受體的配體后，可以增加細(xì)胞對(duì)基因物質(zhì)的吸收利用度。推測(cè)可能是增強(qiáng)細(xì)胞相應(yīng)的功能后增加了細(xì)胞的內(nèi)化作用，但其機(jī)理沒(méi)有作更深入研究。在動(dòng)物模型上，霧化環(huán)節(jié)增加二氧化碳的濃度可以增強(qiáng)組織對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率，但其具體原因尚不清楚[4]。推測(cè)二氧化碳與興奮呼吸中樞有關(guān)，但也不排除與改變酸堿度引起的納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)變化有關(guān)。Li等[34]在霧化中適當(dāng)添加氨基酸，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果，但機(jī)理仍不清楚。細(xì)胞功能可以影響細(xì)胞對(duì)外來(lái)基因物質(zhì)的攝取過(guò)程，而細(xì)胞功能改變多伴隨細(xì)胞能量的代謝改變，自由基產(chǎn)生量會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)氧自由基對(duì)基因物質(zhì)攝取的影響研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基促進(jìn)細(xì)胞對(duì)基因物質(zhì)的攝入，這種增加攝入是依賴于鈣調(diào)素激酶的活化引起細(xì)胞骨架變化而突現(xiàn)的。這一過(guò)程并不依賴于自由基引起的細(xì)胞鈣信號(hào)升高。該結(jié)果支持自由基直接誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變[35]。此外，細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)也可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)染效率。

四、霧化基因治療的應(yīng)用

在臨床或動(dòng)物模型上進(jìn)行的霧化基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)進(jìn)行了多方面探討?；蜉d體有多種高分子聚合物，治療性的基因物質(zhì)分為環(huán)形質(zhì)粒和短鏈核苷酸。對(duì)動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行的研究首先應(yīng)明確的是外加基因能否表達(dá)、表達(dá)部位及機(jī)體安全性問(wèn)題。Stribling等[36]指出：應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鼠肺臟組織中，表達(dá)部位在氣管上皮，肺泡部位，同時(shí)強(qiáng)調(diào)該種方法不會(huì)引起組織學(xué)破壞。后來(lái)的研究表明，應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體脂微球，進(jìn)行肺組織基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效果表明不受血清的影響，并可以保護(hù)DNA不被NDA酶破壞[13]。動(dòng)物肺應(yīng)用PEI進(jìn)行基因修飾后可以得到更好的基因轉(zhuǎn)染效果[4]，Vaysse等[37]研究表明，氣管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用脂質(zhì)體DOPAP將DNA與多肽P2結(jié)合，可使P2具有更高的基因表達(dá)。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將重組人抗胰蛋白酶進(jìn)行霧化吸入，7 d后可以在肺組織內(nèi)檢測(cè)到mRNA和蛋白水平的表達(dá)[3]。McLachlan等[38]通過(guò)DOPT進(jìn)行霧化吸入目的基因， 8～9 d后可以矯正基因的缺失，起到治療肺纖維化的作用。Gautam等[39]應(yīng)用PEI包裹FITC標(biāo)記的基因霧化后，檢測(cè)其在肺組織中的分布，發(fā)現(xiàn)24 h～28 d均有藥物分布。Jia 等[40]研究表明，PEI包裹的基因藥物可以12 h后表達(dá)IL，并在7 d后抑制腫瘤生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和PPDObREG可以增加轉(zhuǎn)染，抑制腫瘤生長(zhǎng)。而新的方法表明PEGDA和分子PEI可以視基因在組織中的表達(dá)保持7 d左右[41]。

轉(zhuǎn)基因的表達(dá)時(shí)間大致在24 h到兩周時(shí)間內(nèi)，其后有表達(dá)量逐漸減少趨勢(shì)。在研究在轉(zhuǎn)質(zhì)粒類基因轉(zhuǎn)染治療疾病種類中對(duì)腫瘤疾病研究較多，研究人員應(yīng)用PEI-P53復(fù)合物質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物模型腫瘤生長(zhǎng)的抑制[42]。Mitchell等[43]研究表明：通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體可使HIV-1表面質(zhì)粒在肺上皮細(xì)胞表達(dá)，引起體液免疫和細(xì)胞免疫，但不引起DNA抗體，應(yīng)用該方法可以作為一種免疫治療手段。Ma等[44]研究表明：霧化干擾素質(zhì)?？梢哉{(diào)節(jié)小鼠肺部其他細(xì)胞因子的表達(dá)，推測(cè)通過(guò)該方法可以調(diào)節(jié)肺部局部免疫功能。Dames等[45]通過(guò)非病毒載體轉(zhuǎn)染糖皮質(zhì)激素受體后可增加該類激素的治療效果。應(yīng)用細(xì)胞周期調(diào)節(jié)信號(hào)的基因霧化方式PDCD4可以像抑制AP1方式一樣抑制腫瘤生長(zhǎng)[46]。

針對(duì)寡核苷酸反義序列進(jìn)行霧化也有報(bào)道，如：蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)的反義霧化治療可以抑制炎癥，推測(cè)該方法可以治療類似哮喘樣的炎性疾病[47]。Molet等[48]研究了反義藥物霧化后在肺組織中的分布，其主要分布于支氣管核肺泡的上皮細(xì)胞，同時(shí)也研究了其毒性作用。近些年，小RNA干擾技術(shù)的研究也在霧化吸入基因治療中得到應(yīng)用，如應(yīng)用霧化方式針對(duì)熒光酶素報(bào)告基因的干擾可以抑制80%～90%的基因表達(dá)[49]。針對(duì)Akt1 的干擾，應(yīng)用siRNA可以抑制肺腫瘤的生長(zhǎng)[50]。

肺臟的霧化基因吸入治療是系統(tǒng)性治療方法，需要更有利于基因完整性和產(chǎn)生更小顆粒的霧化機(jī)，以及具有組織深層滲透能力的基因物質(zhì)載體。深入研究具有靶向性組織或細(xì)胞定位的轉(zhuǎn)染方式，對(duì)肺霧化吸入治療具有重要意義。無(wú)論是針對(duì)基因缺少的外源補(bǔ)充基因治療，還是反義或小RNA干擾技術(shù)，目的基因治療環(huán)節(jié)的選擇對(duì)正常組織和病變組織都是至關(guān)重要的，需要對(duì)機(jī)體和疾病更深入的了解，才能滿足臨床治療的需求。

1 Verma IM, Somia N. Gene therapy-promises, problems and prospects [J]. Nature, 1997, 389(6648): 239-342.

2 Bragonzi A, Dina G, Villa A, et al. Biodistribution and transgene expression with nonviral cationic vector/DNA complexes in the lungs[J]. Gene Ther, 2000, 7(20): 1753-1760.

3 Canonico AE, Conary JT, Meyrick BO, et al. Aerosol and intravenous transfection of human alpha 1-antitrypsin gene to lungs of rabbits[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10(1): 24-29.

4 Gautam A, Densmore CL, Xu B, et al. Enhanced gene expression in mouse lung after PEI-DNA aerosol delivery[J]. Mol Ther, 2000, 2(1): 63-70.

5 Lentz YK, Anchordoquy TJ, Lengsfeld CS. Rationale for the selection of an aerosol delivery system for gene delivery[J]. J Aerosol Med, 2006, 19(3): 372-384.

6 Kleemann E, Dailey LA, Abdelhady HG, et al. Modified polyethy- lenimines as non-viral gene delivery systems for aerosol gene therapy: investigations of the complex structure and stability during air-jet and ultrasonic nebulization[J]. J Control Release, 2004, 100(3): 437-450.

7 Lentz YK, Anchordoquy TJ, Lengsfeld CS. DNA acts as a nucleation site for transient cavitation in the ultrasonic nebulizer[J]. J Pharm Sci, 2006, 95(3): 607-619.

8 Davies LA, Hannavy K, Davies N, et al. Electrohydrodynamic comminution: a novel technique for the aerosolisation of plasmid DNA[J]. Pharm Res, 2005, 22(8): 1294-1304.

9 Smart J, Stangl R, Frtiz E. Touchspray technology: A preliminary in vitro evaluation of plasmid DNA of different size and topology[M]. Proc Respiratory Drug Delivery VIII I，2002:529-531.

10 Arulmuthu ER, Williams DJ, Baldascini H, et al. Studies on aerosol delivery of plasmid DNA using a mesh nebulizer[J]. Biotechnol Bioeng, 2007, 98(5): 939-955.

11 楊慧瑛, 孫文武, 馬壯. 機(jī)械噴射式霧化機(jī)對(duì)質(zhì)粒DNA完整性的影響及保護(hù)性研究[J].中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(10): 44-48.

12 K?ping-H?gg?rd M, Issa MM, K?hler T, et al. A miniaturized nebulization catheter for improved gene delivery to the mouse lung[J]. J Gene Med, 2005, 7(9): 1215-1222.

13 王虹, 孫文武, 馬壯. 氣道內(nèi)微量霧化機(jī)對(duì)質(zhì)粒DNA完整性和基因轉(zhuǎn)染效率的影響[J].中國(guó)生物工程雜志, 2012, 32(3): 63-68.

14 Ziegler BL,Thomas CA, Meier T, et al. Generation of infectious retrovirus aerosol through medical laser irradiation[J]. Laser Surg Med,1998, 22(1): 37-41.

15 Bragonzi A, Boletta A, Biffi A, et al. Comparison between cationic polymers and lipids in mediating systemic gene delivery to the lungs[J]. Gene Ther, 1999, 6(12): 1995-2004.

16 Bajaj A, Kondaiah P, Bhattacharya S. Gene transfection efficacies of novel cationic gemini lipids possessing aromatic backbone and oxyethylene spacers[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(3): 991-999.

17 Felgner PL, Gadek TR, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(21): 7413-7417.

18 Pinnaduwage P, Schmitt L, Huang L. Use of a quaternary ammonium detergent in liposome mediated DNA transfection of mouse L-cells[J]. Biochim Biophys Acta, 1989, 985(1): 33-37.

19 Crook K,Mclachlan G, Stevenson BJ, et al. Plasmid DNA molecular complexed with cationic liposomes are protected from degradation by uncleases and shearing by aerosolisation[J]. Gene Ther, 1996, 3(9): 834-839.

20 Schwarz A, Jonson JL, Black M, et al. Delivery of DNA-cationic liposome complexes by small-partical aerosol[J]. Hum Gene Ther, 1996, 7(6): 731-741.

21 Nguyen J, Reul R, Betz T, et al. Nanocomposites of lung surfactant and biodegradable cationic nanoparticles improve transfection efficiency to lung cells[J]. J Control Release, 2009, 140(1): 47-54.

22 Colonna C, Conti B, Genta I, et al. Non-viral dried powders for respiratory gene delivery prepared by cationic and chitosan loaded liposomes[J]. Int J Pharm, 2008, 364(1): 108-118.

23 Boussif O, Lezoualc′h F, Zanta MA, et al. versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(16): 7297-7301.

24 Ngankam AP, Van Tassel PR. Continuous polyelectrolyte adsorption under an applied electric potential[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 104(4): 1140-1145.

25 Thomas M, Lu JJ, Ge Q, et al. Full deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery efficiency and specificity to mouse lung[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(16): 5679-5684.

26 Friend DS, Papahadjopoulos D, Debs RJ. Endocytosis and intracellular processing accompanying transfection mediated by cationic liposomes[J]. Biochim Biophys Acta, 1996, 1278(1): 41-50.

27 You JO, Auguste DT. Nanocarrier cross-linking density and pH sensitivity regulate intracellular gene transfer[J]. Nano Lett, 2009,9(12): 4467-4473.

28 Rudolph C, Schillinger U, Ortiz A, et al. Aerosolized nanogram quantities of plasmid DNA mediate highly efficient gene delivery to mouse airway epithelium[J]. Mol Ther, 2005, 12(3): 493-501.

29 Sun W, Pan L, Ma Z. Hypo-osmotic stress enhances the uptake of polyethylenimine oligonucleotide complexes in A549 cells via Ca2+mobilization from intracellular stores[J]. Oligonucleotides, 2010, 20(2): 111-115.

30 Suh J, Wirtz D, Hanes J. Efficient active transport of gene nanocarriers to the cell nucleus[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(7): 3878-3882.

31 Elfinger M, Maucksch C, Rudolph C. Characterization of lactoferrin as a targeting ligand for nonviral gene delivery to airway epithelial cells[J]. Biomaterials, 2007, 28(23): 3448-3455.

32 Geiger J, Aneja MK, Hasenpusch G, et al. Targeting of the prostacyclin specific IP1 receptor in lungs with molecular conjugates comprising prostaglandin I2 analogues[J]. Biomaterials, 2010, 31(10): 2903-2911.

33 Elfinger M, Geiger J, Hasenpusch G, et al. Targeting of the beta(2)-adrenoceptor increases nonviral gene delivery to pulmonary epithelial cells in vitro and lungs in vivo[J].J Control Release, 2009, 135(3): 234-241.

34 Li HY, Seville PC, Williamson IJ, et al. The use of amino acids to enhance the aerosolisation of spray-dried powders for pulmonary gene therapy[J]. J Gene Med, 2005, 7(3): 343-353.

35 Ma Z, Sun WW, Wang X. Hydrogen peroxide enhances the uptake of polyethylenimine/oligonucleotide complexes in A549 cells by activating CaMKII independent of (Ca2+) c elevation[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(2): 2914-2921.

36 Stribling R, Brunette E, Liggitt D, et al. Aerosol gene delivery in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1992, 89(23): 11277-11281.

37 Vaysse L, Guillaume C, Burgelin I, et al. Proteolipidic vectors for gene transfer to the lung[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290(5): 1489-1498.

38 McLachlan G, Ho LP, Davidson-Smith H, et al. Laboratory and clinical studies in support of cystic fibrosis gene therapy using pCMV-CFTR-DOTAP[J].Gene Ther, 1996, 3(12): 1113-1123.

39 Gautam A, Densmore CL, Golunski E, et al. Transgene expression in mouse airway epithelium by aerosol gene therapy with PEI-DNA complexes[J]. Mol Ther, 2001, 3(4): 551-556.

40 Jia SF, Worth LL, Densmore CL, et al. Aerosol gene therapy with PEI: IL-12 eradicates osteosarcoma lung metastases[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(9): 3462-3468.

41 Bhattarai SR, Kim SY, Jang KY, et al. Amphiphilic triblock copolymer poly(p-dioxanone-co-L-lactide)-block-poly(ethylene glycol), enhancement of gene expression and inhibition of lung metastasis by aerosol delivery[J]. Gene Ther, 2007,14(6): 476-483.

42 Zou Y, Tornos C, Qiu X, et al. Perez-Soler R p53 aerosol formulation with low toxicity and high efficiency for early lung cancer treatment[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(16): 4900-4908.

43 Mitchell WM, Rosenbloom ST, Gabriel J.Induction of mucosal anti-HIV antibodies by facilitated transfection of airway epithelium with lipospermine/DNA complexes[J]. Immunotechnology, 1995, 1(3-4): 211-219.

44 Ma Z, Sun W. The effect of aerosol polyethylenimine/interferon-γ plasmid complexes on expression of inflammatory cytokines in mouse lung[J]. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv, 2014, 27(2): 117-124.

45 Dames P, Laner A, Maucksch C, et al. Targeting of the glucocorticoid hormone receptor with plasmid DNA comprising glucocorticoid response elements improves nonviral gene transfer efficiency in the lungs of mice[J]. J Gene Med, 2007, 9(9): 820-829.

46 Hwang SK, Jin H, Kwon JT, et al. Aerosol-delivered programmed cell death 4 enhanced apoptosis, controlled cell cycle and suppressed AP-1 activity in the lungs of AP-1 luciferase reporter mice[J]. Gene Ther, 2007, 14(18): 1353-1361.

47 Stenton GR, Ulanova M, Déry RE, et al. Inhibition of allergic inflammation in the airways using aerosolized antisense to Syk kinase[J]. J Immunol, 2002, 169(2): 1028-1036.

48 Molet S, Ramos-Barbón D, Martin JG, et al. Adoptively transferred late allergic response is inhibited by IL-4, but not IL-5, antisense oligonucleotide[J]. J Allergy Clin Immunol, 1999, 104(1): 205-214.

49 Nguyen J, Steele TW, Merkel O, et al. Fast degrading polyesters as siRNA nano-carriers for pulmonary gene therapy[J]. J Control Release, 2008, 132(3): 243-251.

50 Xu CX, Jere D, Jin H, et al. Poly(ester amine)-mediated, aerosol-delivered Akt1 small interfering RNA suppresses lung tumorigenesis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2008, 178(1): 60-73.

(本文編輯：黃紅稷)

孫文武，馬壯. 呼吸系統(tǒng)霧化基因治療研究進(jìn)展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(5)： 554-557.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.022

軍隊(duì)“十五”基金資助課題(01MB001)

110016 沈陽(yáng)，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科

馬壯，Email: Ma-tianyi@163.com

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2016-07-16)