樊　華, 李　文

第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 上海　200003

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·綜述·

雄性生殖氧化應(yīng)激損傷的研究進(jìn)展

樊華, 李文*

第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心, 上海200003

[關(guān)鍵詞]抗氧化劑;活性氧簇；超氧陰離子;睪丸

Research progress of oxidative stress injury in male reproduction

FAN Hua, LI Wen*

Center of Reproductive Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

[Key Words]antioxidant; reactive oxygen species; superoxide anion; testis

近年來，每年都有許多研究專注于不同病理條件下的抗氧化劑的影響。這些研究結(jié)果顯示大多數(shù)疾病中都有自由基(活性氧和氮自由基)的參與。有明確的證據(jù)顯示，活性氧(氧化應(yīng)激)和活性氮(硝化應(yīng)激)數(shù)量的增加是許多急、慢性疾病(包括衰老過程)的突出特點。氧化/硝化應(yīng)激與以下疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)：心血管功能障礙，如高血壓、腦血管意外、心力衰竭；生殖功能障礙；感染性休克；衰老和許多與年齡有關(guān)的慢性疾病，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性疾病。

1男性生殖系統(tǒng)

男性生殖系統(tǒng)由睪丸和附屬器官組成。睪丸是主要的男性生殖器官，它主要負(fù)責(zé)精子生成和雄激素的產(chǎn)生。精子生成是雄性生殖細(xì)胞向精子轉(zhuǎn)變的過程，主要發(fā)生在曲細(xì)精管中。精子發(fā)生是一個連續(xù)的過程，包括生殖細(xì)胞的有絲分裂。該過程導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生廣泛變化，并最終進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生單倍體精子[1]。這個過程需要睪丸內(nèi)較高水平的睪酮激素，該激素由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生[2]。已經(jīng)證明睪酮的分泌直接依賴于促黃體生成激素(LH)的循環(huán)水平，LH是由垂體前葉分泌的[2-4]。腦垂體也分泌卵泡刺激素FSH[3-4]，F(xiàn)SH與附著于生精小管支持細(xì)胞上的特異性FSH受體結(jié)合，引起這些細(xì)胞的生長并分泌多種生精物質(zhì)，如精子細(xì)胞正常發(fā)育所需的營養(yǎng)、礦物質(zhì)和生長因子。此外，垂體前葉還分泌催乳激素，支持細(xì)胞分泌抑制素，這兩種激素已被證明在精子細(xì)胞的正常發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用[3-5]。此外，一個涉及下丘腦的反饋機(jī)制調(diào)控著這些激素的釋放。眾所周知，睪丸功能的啟動依賴于下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)，該激素刺激FSH和LH作用于睪丸[3-4]。睪丸反過來又通過在Sertoli細(xì)胞(如抑制素)和Leydig細(xì)胞中產(chǎn)生激素，對促性腺素(FSH和LH)的生成負(fù)反饋控制。因此，通過下丘腦、垂體和睪丸(下丘腦-垂體-睪丸軸)之間的相互關(guān)系，睪丸的功能受到局部細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞的嚴(yán)格控制。

正常的生殖功能對人類生殖和性滿足至關(guān)重要。因此，生殖功能障礙(不育)是一個重大的健康挑戰(zhàn)，正確理解其病理生理對此類疾病的有效治療也至關(guān)重要。雖然生育能力會隨著年齡的增加而下降，但不育通常是生殖功能障礙引起的，在男性中比女性中更為常見[6]，其中至少有20% 的患者患有內(nèi)分泌紊亂，包括睪酮和FSH[6]。從目前的幾項研究報告中可以看出男性生殖功能障礙與氧化/硝化應(yīng)激有關(guān)聯(lián)[7]。正常精子發(fā)生和精子功能受損是男性因素性不孕最常見的原因[6-7]。正常精子的數(shù)量和質(zhì)量，包括運動、獲能、頂體反應(yīng)、穿透卵子和精子頭部解聚，是實現(xiàn)受精必不可少的過程。然而，大量的研究表明，這些過程的障礙與氧化應(yīng)激相關(guān)的機(jī)制有關(guān)[8]。

2睪丸中的ROS生成和抗氧化系統(tǒng)

有充分的證據(jù)表明，需要低水平的內(nèi)源性ROS對必要的精子功能進(jìn)行調(diào)控，如獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合[9]等。然而，生精細(xì)胞是高度敏感的，容易受到高濃度ROS的影響[7]。因此，通過自由基清除/抗氧化系統(tǒng)的參與來維持睪丸環(huán)境中的氧化還原平衡對正常的睪丸功能是至關(guān)重要的。

正如在男性不育患者的精子中觀察到的[10]，通過在精子質(zhì)膜水平的NADPH氧化酶系統(tǒng)參與的反應(yīng)、或通過線粒體中的NADH依賴的氧化還原酶(心肌酶)，均可以產(chǎn)生ROS。不同的研究者已經(jīng)確定了高ROS產(chǎn)生的來源，包括未成熟的和異常的精子[9]，這些精子中有白細(xì)胞[11]污染，血清和精漿中有低的清除/抗氧化活性[12]。作為對包括炎癥和感染等不同刺激的應(yīng)答，通過幾種機(jī)制精液中白細(xì)胞被激活，可以產(chǎn)生比正常精液相對更高(高達(dá)100倍)的ROS[13]。通過己糖磷酸支路，激活的白細(xì)胞使NADPH的生成增加，而兩種被激活的多形核(PMN)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的代謝過程引起呼吸爆發(fā)和高水平的ROS生成。在精子分析過程中，精液也可能通過精子處理方法在體外產(chǎn)生ROS，如過度離心、冷凍/解凍等，以及當(dāng)精子處理液中有低清除/抗氧化活性存在時[8，12]。

為了保持睪丸內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)精子免受氧化損傷，精漿中含有大量有效的酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)。已確定的精漿中的酶促抗氧化劑包括SOD[14]、谷胱甘肽過氧化物酶/谷胱甘肽還原酶(GPx/GSR)系統(tǒng)[15]和過氧化氫酶[15]。在類似的研究中，在精漿中已確定的非酶抗氧化劑包括抗壞血酸[16]、維生素E、尿酸[17-18]、丙酮酸[19]、谷胱甘肽、?；撬岷蛠喤；撬?。據(jù)報道，一些抗氧化劑還可以提高精子活力/運動性[19]以及正常的精子形態(tài)[18]。此外，與不育男性相比，可育男性精漿中抗氧化劑的濃度顯著更高[16-17]。

3睪丸功能障礙的發(fā)病機(jī)制

通過與膜脂、蛋白質(zhì)和線粒體DNA相互作用，高水平的ROS(超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、一氧化氮和過氧亞硝基陰離子)對正常精子的生成和質(zhì)量(活動性、活力和功能)產(chǎn)生不利影響[20]。

3．1精子膜脂質(zhì)的過氧化哺乳動物精子的膜含有豐富的不飽和脂肪酸(PUFA)，它負(fù)責(zé)精子的流動性，但同時也使精子對自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷非常敏感[20]。細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸的取向產(chǎn)生了精子執(zhí)行其正常生理功能所必需的流動性(例如，在受精過程中的頂體反應(yīng)和精卵融合)，其中涉及到各種分泌事件。類似的研究還表明，膜結(jié)合的ATP酶(離子泵)維持正常細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和離子(如鈉或鈣)濃度的功能嚴(yán)重依賴于細(xì)胞膜的流動性。這意味著ROS誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)/功能的擾動引起膜流動性損失，從而損害膜泵功能，導(dǎo)致細(xì)胞的離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞鈣的利用受到干擾。據(jù)報道，細(xì)胞Ca2+平衡受損影響精子的活力[21]，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。缺陷精子面對氧化應(yīng)激反應(yīng)尤其脆弱，因為他們包含了過多的不飽和脂肪酸，誘發(fā)精子線粒體發(fā)生高水平的脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生ROS。更糟糕的是，脂質(zhì)過氧化作用的小分子質(zhì)量產(chǎn)物的親電醛，如4HNE或丙烯醛等，也能進(jìn)一步引起精子線粒體ROS生成[22]。

3.2精子蛋白的過氧化除了影響膜組分和流動性，ROS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)關(guān)鍵硫基的過氧化也可以改變精子的結(jié)構(gòu)和功能，使其對巨噬細(xì)胞攻擊的易感性增加[23]。Turner等[8]在關(guān)于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的睪丸功能障礙的綜述中報道稱，H2O2可以擴(kuò)散通過精子膜，進(jìn)入細(xì)胞并抑制酶的活性，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)。G-6-PD通過己糖磷酸支路控制葡萄糖流量速率，從而控制細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的可用性。精子使用NADPH作為電子來源，為從已知的NDPH氧化酶系統(tǒng)生成ROS提供燃料。氧化性谷胱甘肽(GSSG)經(jīng)谷胱甘肽還原酶轉(zhuǎn)換為還原型谷胱甘肽(GSH)時也需要NADPH。G-6-PD的抑制導(dǎo)致NADPH可用性的降低以及隨之而來的GSSG的積累和GSH水平的降低，從而降低精子的抗氧化防御能力，增加膜磷脂的過氧化作用。

3.3精子DNA的過氧化已證明睪丸組織中的氧化應(yīng)激可以引起精子DNA完整性的過氧化損傷，這已成為男性不育的熱點研究領(lǐng)域。類似的研究已經(jīng)確定了不育男性精子中的DNA損傷，其特征是高發(fā)生率的堿基修飾、DNA片段化、染色質(zhì)交聯(lián)和DNA鏈斷裂[24]。在這些研究中觀察到的DNA損傷是由精子中高水平的ROS引起的。Duran等[25]和Meseguer等[26]已經(jīng)表明，精子細(xì)胞的DNA損傷可以引起精子質(zhì)量下降和受精問題，因為在受精過程中精子需要完整的DNA。已知精子和其他富含線粒體的有氧細(xì)胞也可以發(fā)生線粒體DNA(mtDNA)的氧化損傷，在精原細(xì)胞階段發(fā)生的自由基驅(qū)動的事件可以引起精子中多個mtDNA缺失，這與一些男性生殖障礙有關(guān)。精子DNA的破壞程度與細(xì)胞本身修復(fù)能力相關(guān)。在精核亞結(jié)構(gòu)和線粒體中包含1種8-氧化鳥嘌呤糖基化酶，稱為8-oxoguanine glycosylase 1 (OGG1)。當(dāng)精子DNA受到氧化攻擊時，OGG1立即在DNA中剪切8OhdG，并將其氧化形式排出細(xì)胞外，同時產(chǎn)生一個堿基空位。這時需要APE1酶在堿基切除修復(fù)通路中發(fā)揮作用，而精子不具備這種酶。這個過程需要進(jìn)入卵母細(xì)胞后完成，一旦出錯，將會對子代造成深遠(yuǎn)影響。盡管各種原因?qū)е碌木覦NA損害不可避免，但在體外嚴(yán)重的DNA損害可能不會發(fā)生在體內(nèi)。

ROS誘導(dǎo)的DNA損傷增加了生殖細(xì)胞的凋亡率[24],凋亡也被描述為細(xì)胞程序性死亡。凋亡產(chǎn)生于引起細(xì)胞死亡但不發(fā)生炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)程序的激活，這種誘導(dǎo)與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的應(yīng)激激酶對睪丸血管內(nèi)皮細(xì)胞的E-選擇素的刺激有關(guān)聯(lián)，這導(dǎo)致睪丸中性粒細(xì)胞的募集和睪丸內(nèi)ROS的增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的過氧化損傷和生殖細(xì)胞凋亡的啟動[27]。雖然，在正常的精子發(fā)生過程中，生殖細(xì)胞凋亡對消除多余的未成熟精子是非常重要的，但如在氧化應(yīng)激條件(例如，毒素暴露、隱睪、睪丸扭轉(zhuǎn)等)下可以看到，當(dāng)進(jìn)程被上調(diào)時，睪丸功能受到高度破壞[28]。Cudicini等[29]和Lysiak等[30]報道稱，生殖細(xì)胞凋亡特別影響生精上皮，在重度誘導(dǎo)過程中，Sertoli細(xì)胞吞噬大量瀕死的生殖細(xì)胞，可能會超過正常Sertoli細(xì)胞的過程，啟動了NF- κB參與的促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的開關(guān)，如IL-1和IL-6。

4睪丸血管功能

睪丸內(nèi)正常的微血管血流量對睪丸的功能是非常重要的，因為據(jù)報道，缺乏充足血流量可導(dǎo)致缺血和細(xì)胞壞死[30]。在大多數(shù)實驗動物中，血管舒縮功能引起微血管血流量的變化[31]。血管舒縮被定義為血管張力有節(jié)奏的振蕩，它是由血管和許多組織的局部變化引起的。雖然血管舒縮的生理學(xué)意義尚不確定，但有一些證據(jù)表明，當(dāng)灌注受損時，即，在缺血的條件下，它可能作為一種保護(hù)機(jī)制。Lysiak等[32]報道稱，在他們的研究中，在ROS介導(dǎo)的缺血性再灌注(IR)中發(fā)生的睪丸損傷可以引起大鼠睪丸血管舒縮的改變。另外，Collin等[31]表明，在大鼠中，ROS誘導(dǎo)的睪酮下降可以抑制睪丸血管舒縮。此外，Lysiak等[32]也表明，通過睪丸中iNOS和 eNOS的上調(diào)，IR事件會增加血管舒張復(fù)合物(NO)的表達(dá)。已經(jīng)證實，一旦NO產(chǎn)生，它也會影響血管舒縮。NO參加其他可以促進(jìn)睪丸損傷的事件，如在大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔表面的細(xì)胞黏附分子(CAMS)的表達(dá)以及過氧亞硝酸鹽的生成[33-35]。因為CAMs是白細(xì)胞募集的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們在睪丸和其他組織中的IR誘導(dǎo)的損傷中起著關(guān)鍵作用。已普遍認(rèn)為，在器官中，特別是在睪丸中，白細(xì)胞募集是許多后續(xù)IR病理學(xué)變化的先導(dǎo)。

5睪丸內(nèi)分泌功能

睪丸氧化應(yīng)激導(dǎo)致睪丸內(nèi)睪酮量的減少，這可能是Leydig細(xì)胞損傷的結(jié)果，也可能是內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)，如垂體前葉的損傷引起的[33]。類固醇生成的正常過程中產(chǎn)生ROS，這主要是線粒體呼吸和類固醇細(xì)胞色素P450酶的催化反應(yīng)生成的。已經(jīng)確認(rèn)，如果不通過細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑加以控制，以這種方式產(chǎn)生的ROS可以引起精子細(xì)胞的線粒體膜的氧化損傷，并有助于抑制后續(xù)的類固醇生成[34]。在另一項研究中，已經(jīng)證明睪丸中NO量的增加(隨之形成過氧亞硝酸鹽)可以降低睪酮的分泌[35]。

6誘導(dǎo)睪丸氧化應(yīng)激的條件

已經(jīng)確認(rèn)有幾種條件可以促進(jìn)睪丸內(nèi)的氧化應(yīng)激并導(dǎo)致不育，包括老化、病理狀態(tài)和暴露于一些有毒物質(zhì)。

6.1老化氧化應(yīng)激被認(rèn)為參與有氧生物的老化過程[10]。隨著年限年齡的增長，生殖細(xì)胞經(jīng)歷了反復(fù)多次的減數(shù)分裂復(fù)制，突變發(fā)生的風(fēng)險是復(fù)制錯誤逐漸疊加的結(jié)果。通過激活對氧化還原敏感的轉(zhuǎn)綠因子，年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激可以引起促炎癥基因表達(dá)的上調(diào)，并建立了ROS與男性不育和年齡相關(guān)的病理的關(guān)聯(lián)[2，10，14，35]。Luo等[34]和Cao等[36]在他們的研究表明，老化與睪丸抗氧化能力降低有關(guān)，而Zirkin等[33]報道稱老化與睪酮或類固醇生成的下降有關(guān)。

6.2病理狀態(tài)各種研究表明，某些病理條件下睪丸的病理生理過程與睪丸中的氧化應(yīng)激增加有關(guān)。睪丸炎、睪丸扭轉(zhuǎn)、精索靜脈曲張和隱睪是已經(jīng)被確認(rèn)的幾種可以引起睪丸內(nèi)ROS水平上升的疾病[37,39]。睪丸炎的特征是局部睪丸感染或全身性炎癥，而睪丸扭轉(zhuǎn)是精索扭轉(zhuǎn)的結(jié)果，可導(dǎo)致缺血。精索靜脈曲張是由睪丸上部及周圍的蔓狀靜脈叢擴(kuò)張(尤其是左側(cè)睪丸)引起的，其特點是由于循環(huán)障礙而導(dǎo)致的陰囊溫度升高。隱睪是睪丸未降，發(fā)生時伴睪丸溫度陰性升高。睪丸的基因組研究表明，局部睪丸感染或炎癥過程引起人類生精障礙[37]。在其他研究中，在試驗睪丸扭轉(zhuǎn)和精索靜脈曲張的大鼠對側(cè)睪丸中觀察到睪丸的氧化應(yīng)激和損傷。Ishikawa等[38]和Misro等[39]也表明在試驗性隱睪中發(fā)生了自由基的過表達(dá)和精子細(xì)胞的損傷。

6.3暴露于外源性化學(xué)物質(zhì)有資料證明，當(dāng)暴露于殺蟲劑、工業(yè)化學(xué)品包括環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[39]和金屬，如高劑量的鐵、鎘[6]和鉛[40]時，睪丸發(fā)生氧化應(yīng)激。此外，已報道一些治療藥物，如抗腫瘤藥物、抗菌藥物、抗瘧藥、鈣通道阻滯劑和抗抑郁藥可以通過增加睪丸中的OS損害睪丸功能。也觀察到照射、過量飲酒和煙草煙霧[41]干擾氧化還原平衡。

7結(jié)論

過量的ROS會影響氧化還原平衡并導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可以通過不同方式對細(xì)胞功能產(chǎn)生不利影響，并明顯與睪丸功能障礙和其他疾病的發(fā)展相關(guān)?？寡趸瘎┛梢允辜?xì)胞保持足夠的功能，抵抗穩(wěn)態(tài)紊亂，其中包括氧化應(yīng)激參與的過程。此外，補(bǔ)充抗氧化劑理論上可以保護(hù)或防止睪丸結(jié)構(gòu)的過氧化損傷，可能對男性不育有幫助。在過去對通過某些抗氧化劑提高氧化應(yīng)激引起的不育患者的生育能力這一概念有爭議，但現(xiàn)在，在睪丸功能障礙并進(jìn)行人工生殖治療的情況下，這一概念得到了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。因此，對強(qiáng)效抗氧化劑和重要的促炎癥介質(zhì)的開發(fā)和專利申請以及對適當(dāng)?shù)乃幬镙斔拖到y(tǒng)的開發(fā)可能使醫(yī)學(xué)普遍深度受益。

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[本文編輯]葉婷，賈澤軍

[中圖分類號]R 737.21

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡介]樊華，主治醫(yī)師. E-mail: fanhua20056@163.com*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-81885872, E-mail: lyyliwen@sina.com

[基金項目]軍隊創(chuàng)新重點課題(13cxz006). Supportedyoy Key Project of PLA (13cxz006).

[收稿日期]2016-01-08[接受日期]2016-04-10