田苗苗，郭春娜，懷彬彬，郜　進(jìn)，黃顯會(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

鹽酸氯苯胍灌服后在兔尿液和糞便中的排泄規(guī)律

田苗苗，郭春娜，懷彬彬，郜進(jìn)，黃顯會
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

摘要:【目的】建立氯苯胍在兔尿液和糞便中的高效液相色譜檢測方法，以測定氯苯胍在兔排泄物中的排泄量.【方法】12只健康新西蘭大白兔灌服鹽酸氯苯胍15 mg·kg－1后，于不同時(shí)間間隔收集其所有糞便和尿液，糞便稱質(zhì)量、尿液定容后凍存.稱取0.2 g糞便，用體積比為2∶1的三氯甲烷－甲醇混合液提取，氮?dú)獯蹈?量取1 mL兔尿，用體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸酸化的乙酸乙酯提取，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)靡译妫?體積比30∶70)溶液復(fù)溶，CNW HLB柱凈化，濃縮后用甲醇定容，上機(jī)檢測.【結(jié)果和結(jié)論】氯苯胍在兔尿中的檢測限與定量限分別為0.005和0.01 μg·mL－1，通過尿液排泄的氯苯胍占給藥總量的比例為0.56%;在兔糞便中的檢測限與定量限分別為0.01和0.05 μg·g－1，通過糞便排泄的氯苯胍占給藥總量的比例為87.17%.氯苯胍在兔尿和糞便中排出高峰期分別在給藥后0～6和6～12 h，占給藥后累積排泄總量的比例分別為28.37%和38.46%.結(jié)果顯示，該檢測方法滿足測定氯苯胍在兔尿和糞便中排泄量的要求，內(nèi)服鹽酸氯苯胍后大部分氯苯胍隨尿液和糞便排出體外.

關(guān)鍵詞:兔;排泄物;氯苯胍;高效液相色譜法;殘留檢測

田苗苗，郭春娜，懷彬彬，等.鹽酸氯苯胍灌服后在兔尿液和糞便中的排泄規(guī)律［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(3) : 8-12.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-04-14

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氯苯胍(Robenidine)又稱雙氯芐氨胍、羅苯嘧啶，是一種人工合成的抗球蟲藥，常用其鹽酸鹽，分子式為C15H13Cl2N5·HCl，相對分子質(zhì)量為370.66，化學(xué)名: 1，3-雙－對氯苯叉氨基胍鹽酸鹽.我國批準(zhǔn)的制劑有鹽酸氯苯胍片和預(yù)混劑，用于預(yù)防和治療雞、兔的急性、慢性球蟲病.農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定:氯苯胍在雞體內(nèi)的殘留標(biāo)示物為氯苯胍，皮與脂肪中的最大殘留限量為200 μg·kg－1，其他可食組織為100 μg·kg－1［1］，目前為止，大鼠和雞體內(nèi)氯苯胍代謝和排泄也已有文獻(xiàn)報(bào)道［2-3］.本研究參考國內(nèi)外報(bào)道的氯苯胍的HPLC、HPLC-MS/MS檢測方法［4-11］，通過多次試驗(yàn)，最終建立了氯苯胍在兔尿液和糞便中的高效液相色譜分析方法，并探討了兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍后體內(nèi)的排泄情況，并對排泄物中氯苯胍所占總給藥量比例以及不同時(shí)間段的排泄率進(jìn)行了分析，以期對制定氯苯胍在兔體內(nèi)的殘留標(biāo)示物和最大殘留限量提供基礎(chǔ)性資料.

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

鹽酸氯苯胍對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號H0041110)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;鹽酸氯苯胍原料藥(鹽酸氯苯胍質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.99%)，由廣州綠州生物技術(shù)有限公司提供.

乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、三乙胺、磷酸二氫銨均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(Sigma公司)

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀: ALLIANCE Waters e2695，配備四聯(lián)泵、脫氣泵、色譜工作站、紫外檢測器、自動進(jìn)樣器，美國WATERS公司.高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman-Coulter公司Avanti?J-26 XP型.臺式冷凍離心機(jī)，ThermoFisher德國Sorvall公司，LEGEND Mach1.6R型.旋渦混合儀，上海青浦滬西儀器廠XW-80A.電子分析天平:日本/島津AUW120型.

1.3藥液配制

儲備液的配制:稱取適量的鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，制成含氯苯胍1 000 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.置4℃冰箱保存，使用期為1個(gè)月.

內(nèi)服液配制:稱取適量的鹽酸氯苯胍原料藥，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋成15 mg·mL－1的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.4試驗(yàn)動物

14只健康的4月齡大的新西蘭大白兔，體質(zhì)量為(2.00±0.12) kg，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(生產(chǎn)許可證號20110015).

1.5給藥與采樣

14只兔分為2組(每組公母各半)，試驗(yàn)組12只，空白組2只.試驗(yàn)組按15 mg·kg－1體質(zhì)量劑量單次灌胃給藥，給藥后分別于0～6、6～12、12～24、24～36、36～48、48～60、60～72、72～84、84～96、96～108、108～120、120～132、132～144 h時(shí)間段收集其全部糞便和尿液，記錄糞便總質(zhì)量和尿液總體積，取部分于－20℃冰箱保存，待測.空白組不給藥，飼喂不含藥的空白飼料，收集糞便和尿液用于氯苯胍檢測的方法學(xué)研究.

1.6尿液和糞便中氯苯胍的測定

1.6.1樣品前處理精密量取尿液(1.00±0.01) mL，加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸酸化的乙酸乙酯3 mL，渦旋1 min，280 r·min－1振蕩10 min，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液，重復(fù)提取2次，于45℃水浴N2流下吹干，加入6 mL乙腈－水［V(乙腈)∶V(水) = 30∶70］溶液復(fù)溶備用，過HLB小柱.HLB小柱用3 mL甲醇活化，3 mL水平衡，之后將備用液過柱，用5 mL水淋洗之后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液并于45℃水浴N2流下吹干，殘?jiān)? mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析.

精密稱取糞便(0.200±0.001) g，加入3 mL三氯甲烷－甲醇混合液［V(三氯甲烷)∶V(甲醇) =2∶1］渦旋1 min，于280 r·min－1振蕩10 min，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液，重復(fù)提取2次，于45℃水浴N2流下吹干，加入6 mL乙腈－水［V(乙腈)∶V(水) = 30∶70］溶液復(fù)溶備用，過HLB小柱.HLB小柱用3 mL甲醇活化，3 mL水平衡，之后將備用液過柱，用5 mL水淋洗之后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液并于45℃水浴N2流下吹干，殘?jiān)? mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析.

1.6.2色譜條件色譜柱: Gemini C18100 A(250 mm×4.0 mm，5 μm)，美國Penomenex公司;紫外檢測波長: 317 nm;流動相: V(磷酸二氫銨溶液)∶V (乙腈) = 35∶65;柱溫: 25℃;流速: 1 mL·min－1;進(jìn)樣量為20 μL.

1.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍取(1.00±0.01) mL空白尿液和(0.20±0.001) g空白糞便若干，分別置于15 mL離心管中，依次加入100 μL系列質(zhì)量濃度的氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋混勻，使得尿液樣品中的氯苯胍質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、2.00 μg·mL－1;糞便樣品中制得的氯苯胍質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.10、0.50、2.00、10.00、40.00 μg·g－1.按“1.6.1”方法處理并按“1.6.2”液相條件進(jìn)行測定，將氯苯胍的色譜峰面積(A)與相對應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度(C)作直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù).

1.6.4回收率和變異系數(shù)準(zhǔn)確稱取(0.200± 0.001) g空白糞便和量取(1.00±0.01) mL空白尿液，分別加入氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得糞便中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05、1.00、40.00 μg·g－1，尿液中藥物質(zhì)量濃度分別為0.01、0.10、2.00 μg·mL－1.按“1.6.1”方法處理，計(jì)算回收率和變異系數(shù).

1.6.5檢測限與定量限稱取(0.200±0.001) g空白糞便和取空白尿液(1.00±0.01) mL，加入氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)液，使尿液樣品中的氯苯胍質(zhì)量濃度為0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.200 μg·mL－1，糞便樣品中氯苯胍質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.005、0.010、0.050、0.200、1.000，2.000 μg·g－1，按“1.6.1”方法處理，并按“1.6.2”液相條件進(jìn)行測定，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，分3個(gè)批次，以S/N≥3計(jì)算檢測限(LOD)，以S/N≥10計(jì)算定量限(LOQ).

1.6.6尿液和糞便中氯苯胍濃度測定給藥后不同時(shí)間段的樣品，按“1.6.1“方法處理后作HPLC分析，記錄氯苯胍峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中氯苯胍的質(zhì)量.

2　結(jié)果

2.1尿液和糞便中氯苯胍檢測的方法學(xué)

2.1.1氯苯胍的色譜行為氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白樣品、空白添加樣品色譜分析見圖1.

圖1　各樣品的HPLC圖Fig.1 The HPLC of samples

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及精密度按“1.6.1”方法處理并按“1.6.2”液相條件進(jìn)行測定，兔尿液中添加氯苯胍0.01～2.00 μg·mL－1線性關(guān)系良好，線性方程為C =8.5×10－3A–12.53，r2=0.999 8;兔糞便中添加氯苯胍0.05～40.00 μg·g－1線性關(guān)系良好，線性方程為C =9.7×10－3A +77.74，r2=0.999 9.

2.1.3回收率與變異系數(shù)在兔的尿液樣品中，氯苯胍的質(zhì)量濃度為0.01、0.10、2.00 μg·mL－1時(shí)平均回收率分別為79.8%、77.6%、79.1%;糞便中氯苯胍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05、1.00、40.00 μg·g－1時(shí)，平均回收率分別為84.3%、82.6%、78.8%.批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10.0%.

2.1.4檢測限與定量限兔尿液中氯苯胍的檢測限為0.005 μg·mL－1，定量限為0.01 μg·mL－1;兔糞便中氯苯胍的檢測限為0.01 μg·g－1，定量限為0.05 μg·g－1.

2.2兔尿液和糞便中氯苯胍的定量分析

兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍15 mg·kg－1后，記錄每只兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍的總質(zhì)量，計(jì)算氯苯胍的總物質(zhì)的量.內(nèi)服鹽酸氯苯胍后，收集每只兔各時(shí)間段所有的糞便和尿液，用高效液相色譜法測出代謝物氯苯胍在各時(shí)間段的濃度，根據(jù)糞便和尿液的總質(zhì)量(或體積)最終分別求出糞便和尿液中氯苯胍的量，然后與兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍總的質(zhì)量相比.從表1可以看出，兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍后，兔尿中氯苯胍排出高峰在0～6 h，占排泄累積總量的28.371%;糞便中排出高峰在6～12 h，占排泄累積總量的38.462%.主要排泄時(shí)間在給藥后的60 h之內(nèi)，占總排泄量的90%以上，給藥后72 h基本排泄完畢，累積排泄達(dá)99.25%.糞便和尿液中排泄出的氯苯胍所占兔內(nèi)服總量的比例分別為87.17%和0.56%，合計(jì)為87.73%.通過糞便排泄的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于尿液排泄的比例.給藥后120 h排泄完畢.

表1　不同時(shí)間段尿液和糞便中氯苯胍的排泄量1)Tab.1 Excretion of robenidine in urine and feces at different time intervals

3　討論與結(jié)論

3.1處理方法的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)［3-9］，對甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中乙酸乙酯的提取效果比較好.鹽酸氯苯胍屬于弱酸性化合物，理論上講，用酸化有機(jī)試劑提取效果優(yōu)于有機(jī)試劑提取.考察了鹽酸、乙酸等酸化乙酸乙酯的提取效果，兩者提取回收率相當(dāng)，考慮鹽酸的揮發(fā)性，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸酸化的乙酸乙酯作為尿液中氯苯胍提取溶劑.由于糞便和尿液中基質(zhì)差異較大，同樣的提取劑在糞便中滿足不了檢測要求，參考飼料中氯苯胍的提取方法［10-11］，加以改進(jìn)最終確定糞便的提取溶劑為三氯甲烷－甲醇［V(三氯甲烷)∶V(甲醇) =2∶1］混合液.

3.2氯苯胍在兔尿液和糞便中的排泄

藥物的排泄回收試驗(yàn)是研究藥物體內(nèi)代謝過程的一個(gè)重要方面，通過對不同排泄物中藥物及其代謝物含量測定，可以驗(yàn)證藥物進(jìn)入體循環(huán)及其主要的代謝途徑.外源性藥物通過內(nèi)服給藥后，一部分通過小腸等部位吸收進(jìn)入體循環(huán)，其他在腸道隨糞便排出體外.進(jìn)入體循環(huán)的藥物消除一般有2種方式，一是不經(jīng)任何代謝轉(zhuǎn)化而直接以原藥的形式排出體外，另一種是在肝臟等組織中經(jīng)代謝酶催化作用，代謝轉(zhuǎn)化為其他代謝物的形式經(jīng)膽汁或腎排出體外.

Zulalian等［2］以14C標(biāo)記法對氯苯胍在大鼠體內(nèi)代謝的研究結(jié)果顯示，氯苯胍在大鼠體內(nèi)最終以70.4%原形隨糞便排出體外，隨尿液排出的氯苯胍占給藥總劑量的2.0%，以對氯苯甲酰氨基乙酸和對氯苯甲酸為主要代謝物形式隨尿液排出體外，代謝物占總放射活性的12%，其中對氯苯甲酰氨基乙酸占該代謝物形式的98%.Zulalian等［3］以14C標(biāo)記形式對氯苯胍在雞體內(nèi)的研究結(jié)果表明，糞便中存在有99%的放射活性物質(zhì)，這些放射性物質(zhì)中大部分是氯苯胍原藥，部分以代謝物形式存在.

本研究表明，兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍后，隨糞便排泄出的氯苯胍占內(nèi)服總量的87.17%，尿液中氯苯胍占內(nèi)服總量的0.56%.尿液中氯苯胍排出峰值在0～6 h，糞便中氯苯胍排出峰值在6～12 h.兔內(nèi)服氯苯胍后120～132 h，糞便和尿液中氯苯胍濃度已低于檢測限.表明兔內(nèi)服氯苯胍后主要以原藥的形式排出體外，這與大鼠和雞體內(nèi)氯苯胍的排泄規(guī)律結(jié)果一致.根據(jù)相關(guān)研究［2-3］以及試驗(yàn)結(jié)果分析推測，兔內(nèi)服氯苯胍后，大部分藥物沒有被吸收，隨著糞便排出體外，而約12%的藥物被吸收后，在體內(nèi)經(jīng)代謝后轉(zhuǎn)化成結(jié)合物形式或其他小分子化合物隨尿液排出體外，是否和鼠中一樣，以對氯苯甲酰氨基乙酸和對氯苯甲酸為主要代謝物形式排出還需要進(jìn)一步深入研究.

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【責(zé)任編輯柴焰】

Studies on the excretion of robenidine hydrochloride in rabbit urine and feces

TIAN Miaomiao，GUO Chunna，HUAI Binbin，GAO Jin，HUANG Xianhui
(National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】In order to investigate the excretion quantitation of robenidine in rabbit urine and feces，a high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed to detect the concentrations of robenidine hydrochloride.【Method】Twelve healthy rabbits were administered robenidine hydrochloride orally with a dose of 15 mg·kg－1.After administration，all of their urine and feces were collected at different time intervals and mass were achieved.Feces 0.2 g was extracted using chloroform-methanol［V(chloroform)∶V(methanol) =2∶1］; urine 1 mL was extracted with φ=0.2% acidified ethyl acetate，and the organic phase was separated and evaporated.The residue was redissolved with acetonitrilewater［V(acetonitrile)∶V(water) = 30∶70］solution，and cleaned up by solid-phase extraction using CNW HLB after being evaporated to dryness; the residue was redissolved in methanol，and then analyzed by HPLC.【Result and conclusion】The results showed that the limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ) of robenidine in urine were 0.005 and 0.01 μg·mL－1respectively，with the proportion of the total administered robenidine being 0.56%; the LOD and the LOQ of robenidine in feces were 0.01 and 0.05 μg·g－1respectively，with the proportion of the total administered robenidine being 87.17%.The excretion peak time of robenidine in urine and feces was 0－6 and 6－12 h respectively，and the total amount of accumulated excretion was 28.37% and 38.46% respectively after administration.The results indicate that this method can be used to detect the concentration of robenidine in rabbitbook=9,ebook=13urine and feces，and most of the administered drug is excreted in the original form of urine and feces.

Key words:rabbit; excrement; robenidine; HPLC; residue determination

基金項(xiàng)目:農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目(201391194)

作者簡介:田苗苗(1988—)，女，碩士研究生，E-mail: 382802372@ qq.com;通信作者:黃顯會(1969—)，男，高級獸醫(yī)師，博士，E-mail: xhhuang@ scau.edu.cn

收稿日期:2014-04-20

文章編號:1001-411X(2015) 03-0008-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S859.795