王俊貴州省食品藥品檢驗所，貴州　貴陽　550004

葡萄糖酸鈣鋅顆粒微生物限度檢查方法驗證

王俊
貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽550004

【摘要】目的:建立葡萄糖酸鈣鋅顆粒微生物限度檢查方法.方法:按照《中國藥典》2010版微生物限度檢查法，采用平皿法對各試驗菌的回收率逐一進(jìn)行驗證以建立細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法;采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌大腸埃希菌的方法驗證.結(jié)果:葡萄糖酸鈣鋅顆粒菌落計數(shù)采用常規(guī)平皿法驗證時，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉五株菌的回收率分別都是在70%以上，控制菌大腸埃希菌采用直接接種法時試驗組能夠檢出試驗菌.結(jié)論:葡萄糖酸鈣鋅顆粒的細(xì)菌計數(shù)方法可采用常規(guī)平皿法進(jìn)行計數(shù)檢測，霉菌及酵母菌計數(shù)方法可采用常規(guī)平皿法進(jìn)行計數(shù)檢測，控制菌大腸埃希菌可采用常規(guī)直接接種法進(jìn)行檢測.

【關(guān)鍵詞】葡萄糖酸鈣鋅顆粒;微生物限度檢查法;常規(guī)法

1　儀器與材料材料

1.1供試品葡萄糖酸鈣鋅顆粒(批號: 140101、140102、140103，1g/袋，每袋含葡萄糖酸鈣600mg，葡萄糖酸鋅30mg，鹽酸賴氨酸100mg)貴州聯(lián)盛藥業(yè)有限公司生產(chǎn).

1.2儀器LMQ. C型高壓蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械有限公司); SW－CJ－2FD潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); AC2－4S1生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司); HHS型電熱恒溫水浴箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠); HP250電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京恒裕電子儀器廠); MJ－250－1霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司).

1. 3培養(yǎng)基pH7. 0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡糖苷酸均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn).

1. 4菌種大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]第3代;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]第3代;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]第3代;白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]第3代，黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]第3代[1].

2　方法與結(jié)果

2.1菌液制備方法接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1ml，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23 ～28℃培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)物1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23 ～28℃培養(yǎng)5～7d，加入5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80 用0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，取原液1ml，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含孢子數(shù)為50～100cfu的孢子懸液[1－2].

2.2供試液制備按規(guī)定稱取供試品葡萄糖酸鈣鋅顆粒10g于含玻璃珠的滅菌三角燒瓶內(nèi)，加入pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖溶液中，放置40℃水浴鍋溫浴20min，用振蕩器振蕩至少30min，待充分溶解后混勻作為1∶10供試液[1]備用.

2. 3菌落計數(shù)方法的驗證

2.3.1試驗組取1∶10供試液1ml含50～100cfu的試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌同時制備2個平皿，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養(yǎng)3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培養(yǎng)5d，測定其菌數(shù).

2.3.2菌液組分別吸取含50～100cfu的試驗菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，注入滅菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(白色念珠菌和黑曲霉)，每株試驗菌平行制備2個平皿，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養(yǎng)3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培養(yǎng)5d，測定其菌數(shù).

2. 3. 3供試品對照組取1∶10供試液1ml注入滅菌平皿，同時制備4個平皿，其中兩個立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)3d，計數(shù)細(xì)菌本底菌數(shù)，另外兩個立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)5d，測定霉菌及酵母菌本底菌數(shù).

2. 3. 4培養(yǎng)與計數(shù)試驗重復(fù)3次，計算各試驗菌株的回收率[回收率=(實驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組平均菌落數(shù)×100%]，結(jié)果見表1.

表1　細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證測定結(jié)果(%)

由表1可知，常規(guī)平皿法3次試驗5株菌株回收率分別都是在70%以上，說明該方法可用于葡萄糖酸鈣鋅顆粒細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計數(shù)檢測.

2. 4控制菌檢查方法的驗證

2. 4. 1實驗組取供試液10ml和含50～100cfu大腸埃希菌的試驗菌液分別加入100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，放置30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，用無菌吸管吸取0. 2ml加入盛裝5ml 4－甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基管內(nèi)，放置30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在5h和24h在366nm紫外燈下觀察結(jié)果，然后沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液觀察結(jié)果，結(jié)果見表2.

2.4.2陽性對照組取含50～100cfu大腸埃希菌的實驗菌液加入100ml膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，按照實驗組的操作方法同法操作.

2.4.3陰性對照組用pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖溶液替代供試液，不加試驗菌液，按照實驗組的操作方法同法操作.

由表2可知，葡萄糖酸鈣鋅顆粒可用直接接種法進(jìn)行控制菌檢查.

表2　直接接種法控制菌方法驗證結(jié)果

3　結(jié)論

從驗證結(jié)果來看，菌落計數(shù)方法的驗證采用常規(guī)平皿法時大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別都是在70%以上，控制菌檢查方法的驗證采用直接接種法時，實驗組檢出了試驗菌，說明本品對這幾株菌是沒有抑菌作用的.

在生產(chǎn)廠家不改變原輔料、生產(chǎn)工藝、檢驗及處方等條件下，葡萄糖酸鈣鋅顆粒的細(xì)菌計數(shù)方法可采用常規(guī)平皿法進(jìn)行計數(shù)檢測，霉菌及酵母菌計數(shù)方法可采用常規(guī)平皿法進(jìn)行計數(shù)檢測，控制菌大腸埃希菌可采用常規(guī)直接接種法進(jìn)行檢測.

此微生物限度檢查方法用于葡萄糖酸鈣鋅顆粒微的微生物限度檢查時，是有效可行的，能保證藥品檢測的可靠性和準(zhǔn)確性.

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)[S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 107－116．

[2]中國藥品生物制品檢定所．中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 351－407．

收稿日期:( 2014. 12. 06)

【文章編號】1007－8517(2015)05－0006－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R921. 2