李　香1于　琳2彭小冰2*　梁光義21.貴州省黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州　都勻　558000; 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550000

RP－HPLC法同時測定梔子柏皮湯不同劑型甘草苷與甘草酸銨的含量

李香1于琳2彭小冰2*梁光義2
1.貴州省黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558000; 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550000

【摘要】目的:建立RP－HPLC同時測定梔子柏皮湯傳統(tǒng)湯劑、經(jīng)方顆粒劑及單味配方顆粒劑中甘草苷、甘草酸銨含量的分析方法.方法:采用Agilent Extend－C18色譜柱(250mm×4. 6mm，5μm)，以乙腈－0. 05%磷酸水溶液－甲醇為流動相梯度洗脫，流速為0. 8ml/min，檢測波長為237nm，柱溫30℃.結(jié)果:甘草苷及甘草酸銨進(jìn)樣量分別在0. 10～0. 80μg和0. 10～0. 50μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率(n =9)分別為100. 36%(RSD =0. 76%)、100. 43%(RSD = 1. 10%).結(jié)論:本法適用于不同劑型梔子柏皮湯中甘草苷、甘草酸銨的同時測定.

【關(guān)鍵詞】梔子柏皮湯;不同劑型;反相高效液相色譜法;甘草苷;甘草酸銨

RP－HPLC Simultaneous Determination of the Content of Liquiritin and Glycyrrhetinic in Different Dosage Form of Zhizi Baipi Soup

LI Xiang1，YU Lin2，PENG Xiao-bing2*，LIANG Guang-yi2
1. Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China;
2. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550000，China

Abstract:Objective To establish the analytical method for RP－HPLC simultaneous determin ation of the content of liquiritin and glycyrrhetinic acid in traditional Zhizi Baipi soup，the granule of classical prescription and the granule of single herb．Method The operating conditions were Agilent Extend－C18column(250mm×4. 6mm，5μm)at 30℃and gradient elution of mobile phase which was composed of acetonitrile－0. 05% phosphoric acid solution－methanol at a flow of 0. 8ml·min－1and wavelength at 237nm．Result The sample size of liquiritin and glycyrrhetinic acid respectively in 0. 10－0. 80μg and 0. 10－0. 50μg had a good linear relationship with peak area．The average recoveries(n =9)were 100. 36%(RSD = 0. 76%)and 100. 43%(RSD = 1. 10%)．Conclusions The method applies for simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhetinic in different dosage form of Zhizi Baipi soup．

Key words:Zhizi Baipi soup; different dosage form; RP－HPLC; liquiritin; glycyrrhetinic acid

梔子柏皮湯始載于漢代名醫(yī)張仲景的《傷寒論》，由梔子、黃柏和炙甘草三味藥材組成，用于治療濕熱發(fā)黃、熱重于濕之陽黃癥[1].甘草的主要有效成分甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草酸銨，均具有保肝作用[2].為了更好的控制該方的質(zhì)量，保證臨床用藥安全，實(shí)驗(yàn)以甘草苷、甘草酸銨為考察指標(biāo)，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[3－8]，同時測定梔子柏皮湯傳統(tǒng)湯劑、經(jīng)方顆粒劑、單味配方顆粒劑中甘草苷、甘草酸銨含量.結(jié)果表明，供試品在反相高效液相色譜中分離效果較好，陰性樣品溶液對測定無干擾，方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于不同劑型梔子柏皮湯中甘草苷、甘草酸銨的同時測定.

1　儀器與材料

1. 1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀(Agilent Chem-Station色譜工作站); WS205電子天平(十萬分之一，瑞士梅特公司); HS10260D超聲波清洗機(jī)(天津市恒奧科技有限公司).

1. 2材料甘草苷對照品(批號: 111610－200604)、甘草酸銨對照品(批號: 110731－200408)均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純.

藥材均購自貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院賀祝英主任藥師鑒定，梔子是茜草科植物山梔Gardenia jasminoides Ellis.的果實(shí);黃柏為蕓香科植物黃皮Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”;甘草為豆科植物甘草Glycxycrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，均符合2010版《中國藥典》的規(guī)定.

2　方法與結(jié)果

2. 1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)采用Agilent Extend－ C18色譜柱(250mm×4. 6mm，5μm)，以乙腈(A)－0. 05%磷酸水溶液(B)－甲醇(C)為流動相梯度洗脫(表1)，檢測波長為237nm，流速為0. 8ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μl，理論板數(shù)不低于3000.在此色譜條件下，甘草苷、甘草酸銨與其他組分的分離效果較好.

2. 2溶液制備

2. 2. 1對照品溶液的制備分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨對照品1. 3mg和1. 0mg，加70%甲醇溶解，分別定容至25ml和50ml，制成52μg/ml的甘草苷對照品溶液、20μg/ml的甘草酸銨鹽對照品溶液.

2. 2. 2供試品溶液的制備

2.2.2.1傳統(tǒng)湯劑供試品溶液的制備處方:梔子10g，黃柏6g，甘草3g.按處方比例稱取各味藥材粗粉(10倍處方量).加水6000ml煮至約2400ml，過濾，濃縮，定容至1000ml備用(傳統(tǒng)方法).精密吸取湯劑20ml于水浴上蒸干，殘?jiān)尤?0%甲醇定容至25ml，超聲30 min，過濾，濾液備用.

表1　流動相梯度洗脫程序表

2. 2. 2. 2復(fù)方顆粒供試品溶液的制備按傳統(tǒng)湯劑制備方法制備得湯劑，進(jìn)一步濃縮，常壓80℃烘干，粉碎，得干浸膏粉備用.精密稱取經(jīng)方干浸膏粉約0. 7251g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超聲處理30 min，過濾，濾液備用.

2. 2. 2. 3配方顆粒供試品溶液的制備稱取各味藥材(粗粉)適量，各加8倍量水浸泡20min，煎煮60min，過濾，濾液另器收集，藥渣再加6倍量水煎煮60min，過濾，合并兩次煎液，制備成各藥材的煎液，常壓80℃烘干，粉碎，得各單味藥干浸膏粉.按處方比例稱取適量干浸膏粉配研混合，得單味配方干浸膏粉備用.精密稱取單味配方干浸膏粉約1. 1472g置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇定容至

圖1　空白溶劑（A）、陰性對照（B）、甘草酸銨對照品（C）樣品溶劑（D）

2. 3. 2線性關(guān)系考察分別精密稱取甘草苷對照品，甘草酸銨對照品各2. 0mg，定容至10ml，作對照品儲備液.取甘草苷對照品儲備液，分別稀釋成濃度為10、20、40、60、80μg/ml;取甘草酸銨對照品儲備液，分別稀釋成濃度為10、20、30、40、50μg/ml，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定、以甘草苷，甘草酸銨對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，計(jì)算甘草苷、甘草酸銨的回歸方程分別為: Y =19. 787X－16. 037(r = 0. 9995); Y = 6. 02X－4. 4(r = 0. 9997).結(jié)果表明甘草苷進(jìn)樣量在0. 10～0. 80μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，甘草酸銨進(jìn)樣量在0. 10～0. 50μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2. 3. 3精密度試驗(yàn)精密吸取“2. 2. 1”項(xiàng)下甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定.重復(fù)進(jìn)樣測定6次，測得甘草苷峰面積值的RSD為0. 75%，甘草酸銨峰面積值的RSD為0. 74%，數(shù)據(jù)表明精密度良好.

2. 3. 4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)依據(jù)“2. 2. 2. 1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h時進(jìn)樣，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，測定其峰面積.甘草苷RSD為1. 51%，甘草酸銨RSD為0. 68%.說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定.

2. 3. 5重復(fù)性試驗(yàn)依據(jù)“2. 2. 2. 1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別制備6份，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定.甘草苷RSD為1. 96%，甘草酸銨RSD為2. 09%，結(jié)果表明重復(fù)性良好.

2. 3. 6加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取甘草苷及甘草酸銨對照品3. 2mg、1. 7mg，加70%甲醇定容至5ml.按照“2. 2. 1”項(xiàng)下的制備方法減半取樣平行制備樣品9份，分別置錐形瓶中，按高、中、低濃度精密加入甘草苷對照液0. 84、1. 01、1. 26ml，甘草酸銨對照液0. 74、0. 88、1. 1ml，分別按“2. 2. 2. 1”項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，分別測得樣品中甘草苷及甘草酸銨的含量，計(jì)算加樣回收率.結(jié)果甘草苷、甘草酸銨的平均回收率(n = 9)分別為100. 36%(RSD = 0. 76%)、100. 43%(RSD =1. 10%).

2. 4樣品含量測定按“2. 2. 2”項(xiàng)下方法制備傳統(tǒng)湯劑供試液、復(fù)方顆粒供試液及單味配方顆粒供試液，各3份，分別按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，樣品溶液中甘草苷及甘草酸銨的含量結(jié)果見表2.

表2　傳統(tǒng)湯劑、復(fù)方顆粒、配方顆粒甘草苷，甘草酸銨含測結(jié)果(n =3)

3　結(jié)果與討論

探討采用反相高效液相色譜法同時測定梔子柏皮湯中傳統(tǒng)湯劑、復(fù)方顆粒、配方顆粒中甘草苷、甘草酸銨的含量，從而摸索這2個指標(biāo)成分含量測定方法.進(jìn)一步對梔子柏皮湯配方顆粒、湯劑和復(fù)方顆粒中甘草苷及甘草酸銨的含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示甘草苷含量(配方＞湯劑＞復(fù)方)，甘草酸銨含量(配方＞復(fù)方＞湯劑)，甘草苷和甘草酸銨在配方顆粒中含量均比其他劑型高，可能是因?yàn)閮煞N成分在復(fù)方中煎煮時發(fā)生反應(yīng)，減少含量.

實(shí)驗(yàn)考查了多種色譜條件，分別有乙腈－0. 05%磷酸、甲醇－0. 05%磷酸，并分別用不同洗脫程序分離;同時對流速、柱溫等方面也進(jìn)行考察選擇最優(yōu)條件.但是上述多種條件在分離甘草苷的時候都具有拖尾現(xiàn)象，且分離不好，而在流速為0. 8ml/min，柱溫為30℃，乙腈－甲醇－0. 05%磷酸梯度洗脫色譜條件最好.

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2. 2. 3陰性供試品溶液的制備

2. 2. 3. 1空白溶液的制備取70%甲醇溶液25ml，超聲處理30 min，過濾，濾液備用.

2. 2. 3. 2缺甘草溶液的制備按“2. 2. 2. 1”項(xiàng)下方法制備不含甘草的空白對照溶液，備用.

2. 3方法學(xué)考察

2. 3. 1專屬性考察精密吸取對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10μl，按“2. 1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定.結(jié)果見圖1，陰性對照樣品色譜圖中在甘草苷、甘草酸銨相應(yīng)保留時間位置未見吸收峰，表明其他成分對甘草苷、甘草酸銨含量測定無干擾.

收稿日期:( 2014. 12. 14)

通信作者:彭小冰(1955－)，女，漢族，碩士，副教授，主要從事中藥復(fù)方配伍及新藥研究.

作者簡介:李香(1982－)，女，漢族，碩士，講師，主要從事中藥質(zhì)量控制及復(fù)方研究.

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(No．30860364).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0024－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R284. 1