劉良燚　劉　凱　張景石　李木衛(wèi)　王　瑒深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院，廣東　深圳　518116

大鼠同種異體神經(jīng)支架修復(fù)神經(jīng)缺損的實驗研究

劉良燚劉凱張景石李木衛(wèi)王瑒
深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院，廣東深圳518116

【摘要】目的:比較經(jīng)脫細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與自體神經(jīng)移植修復(fù)效果的區(qū)別.方法: 32只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組16只，分別為脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損組(A組)和自體移植組(B組).術(shù)后利用HE染色和透射電鏡觀察支架內(nèi)結(jié)締組織重塑情況和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變.結(jié)果:與自體移植組相比，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組細(xì)胞分布較紊亂，說明支架內(nèi)結(jié)締組織已有增生重塑現(xiàn)象.通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單純脫細(xì)胞支架組的髓鞘形態(tài)與自體移植組的顯微結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異.結(jié)論:脫細(xì)胞異體神經(jīng)支架異體移植后，能與自體神經(jīng)移植修復(fù)缺損神經(jīng)產(chǎn)生相似的移植效果.

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)支架;神經(jīng)缺損;大鼠

周圍神經(jīng)損傷在臨床上十分常見，尤其長段距離的神經(jīng)缺損修復(fù)一直是困擾臨床的難題，目前自體神經(jīng)移植的修復(fù)方式是臨床首選[1].然而自體移植手術(shù)存在供區(qū)有限、供區(qū)感覺或運動的失神經(jīng)障礙、神經(jīng)束錯位、神經(jīng)活力隨時間衰減以及無血管生成能力等問題[2－3]，也是目前臨床應(yīng)用無奈之舉.鑒于此，本研究擬通過比較同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與運用自體神經(jīng)移植修復(fù)的效果的差異，以期為異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架作為自體神經(jīng)移植替代治療提供部分研究基礎(chǔ).

1　材料與儀器

1. 1儀器3131型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司); H－7650型透射電鏡(日本日立公司);熒光顯微鏡DM4000(德國Leica公司).手術(shù)器械及顯微手術(shù)器械(寧波成和醫(yī)療器械有限公司).

1. 2材料清潔級雄性SD大鼠，體重(300±42)g，購于中山大學(xué)實驗動物中心;實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(粵)2011－0029，實驗動物使用許可證: SYXK(粵)2011－0112.脫氧膽酸鈉、Triton X－100(美國sigma公司);其余試劑均為分析純.

2　方法

2. 1坐骨神經(jīng)取材準(zhǔn)備SD大鼠8只，作為制備脫細(xì)胞支架的神經(jīng)供體來源，先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸潤麻醉充分后，再用75%酒精溺斃大鼠，并充分浸泡消毒10分鐘，將消毒后的大鼠置于超凈臺，無菌操作下逐層解剖雙下肢至顯露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，完整切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)干，8只大鼠共取出坐骨神經(jīng)16條.

2. 2神經(jīng)支架的制備將大鼠坐骨神經(jīng)干在手術(shù)顯微鏡下小心去除神經(jīng)干周圍筋膜和血管組織，并用無菌PBS緩沖液反復(fù)清洗.在常溫下進(jìn)行如下步驟[4－5]:①在無菌蒸餾水中靜置6h;②3% TritonX－100中靜置12h;③無菌蒸餾水漂洗3次，然后用無菌PBS緩沖液漂洗3次;④4%脫氧膽酸鈉溶液靜置12h;⑤無菌蒸餾水漂洗3次，然后無菌PBS緩沖液漂洗3次.上述步驟完成以后得到大鼠脫細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架，將該支架置于PBS緩沖液4℃保存?zhèn)溆?

2. 3動物分組與坐骨神經(jīng)缺損橋接實驗?zāi)Ｐ椭苽淠Ｐ椭苽?按照隨機(jī)的原則將SD大鼠分為:單純脫細(xì)胞支架對照組(A組)和自體移植組(B組)，每組16只.常規(guī)消毒術(shù)野，鋪無菌巾，于后肢外側(cè)中上1/3處做橫行切口，切開皮膚約4. 5cm剪開筋膜組織，沿肌間隙由淺入深小心的鈍性分離，充分顯露坐骨神干經(jīng)后，快刀切取長度為1. 5cm的坐骨神經(jīng).形成右坐骨神經(jīng)干缺損動物模型，將脫細(xì)胞神經(jīng)支架在10倍手術(shù)顯微鏡下修剪為長度1. 5cm，植于坐骨神經(jīng)干缺損處，用10－0無創(chuàng)縫線，兩定點外膜縫合法吻合坐骨神經(jīng)近端斷端于神經(jīng)支架近端，縫合6針，依法吻合遠(yuǎn)端斷端于神經(jīng)支架遠(yuǎn)端，創(chuàng)面充分止血，關(guān)閉創(chuàng)面.自體移植組以左右兩側(cè)坐骨神經(jīng)干相互交換的方法進(jìn)行，術(shù)中注意標(biāo)記切取神經(jīng)干的遠(yuǎn)近端，以便正確回植.

2. 4神經(jīng)再生的組織學(xué)觀察

2. 4. 1 HE染色取各組支架中段石蠟包埋切片，行常規(guī)HE染色.觀察再生神經(jīng)中的細(xì)胞、軸突、髓鞘的形態(tài).

2. 4. 2超薄切片透射電鏡觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)的變化情況.

3　結(jié)果

3. 1一般觀察術(shù)后1. 5個月，兩組營養(yǎng)不良性改變均減輕，兩組再生神經(jīng)外觀均接近正常神經(jīng)組織，B組肌肉萎縮程度較A組輕，A組皮膚感覺及運動功能差于B組.術(shù)后2個月，兩組營養(yǎng)不良性改變均減輕，自體神經(jīng)移植組肌肉萎縮程度輕，對針刺的反應(yīng)敏感度及運動功能恢復(fù)較好.術(shù)后6個月，神經(jīng)取材前觀察神經(jīng)外觀情況，兩組神經(jīng)連續(xù)性良好，與周圍組織無明顯粘連，無纖維神經(jīng)瘤形成，移植段表面均有不同程度的血管化，A組中段較B組略細(xì)，B組形態(tài)結(jié)構(gòu)基本接近正常神經(jīng)組織.

3. 2神經(jīng)支架的光鏡觀察實驗組和對照組的移植物段及其兩端未見肉芽組織，在其橫切面上移植物中段顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束，并有完整的外膜包裹，兩組之間在光鏡觀察無明顯差異.

3. 3神經(jīng)支架的HE染色分析由蘇木素－伊紅染色結(jié)果可見圖1，在移植物遠(yuǎn)段神經(jīng)組織橫切片上，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組、自體神經(jīng)移植組標(biāo)本均可見成束狀排列的神經(jīng)樣組織、藍(lán)染的細(xì)胞核、新生毛細(xì)血管及少量的纖維組織增生，說明神經(jīng)纖維已經(jīng)生長至遠(yuǎn)端.此外，自體神經(jīng)移植組組細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞核走形較為一致，單純脫細(xì)胞神經(jīng)支架組細(xì)胞分布較紊亂，細(xì)胞核走形較為混亂，說明脫細(xì)胞支架內(nèi)結(jié)締組織增生重塑現(xiàn)象明顯.

3. 4神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)分析由圖2可見，兩組神經(jīng)纖維內(nèi)均可見數(shù)條神經(jīng)軸突纖維，軸突滿布髓鞘，在軸突內(nèi)可見大量微絲、微管、新生毛細(xì)血管，細(xì)胞器豐富，軸突外有髓鞘包裹，髓鞘呈類圓形或不規(guī)則形，髓鞘壁厚薄均勻，可見同心圈層，髓鞘外周均有雪旺細(xì)胞胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，胞核基本規(guī)整.兩組超微結(jié)構(gòu)無十分明顯的差異.

圖1　神經(jīng)支架HE染色（x100）

圖2　神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)

4　討論

周圍神經(jīng)長距離缺損的修復(fù)一直是臨床難題，自體神經(jīng)移植被認(rèn)為是修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[5].因自體神經(jīng)來源有限以及增加了手術(shù)部位和創(chuàng)傷造成該神經(jīng)支配區(qū)的功能障礙，常無法滿足較大神經(jīng)缺損或較廣泛神經(jīng)損傷修復(fù)的需要.近年來有實驗表明[6－7]，脫細(xì)胞的同種異體天然神經(jīng)支架優(yōu)于其他人工制備的支架，不僅在于有較好的組織相容性，主要還在于去除有抗原性的細(xì)胞和髓鞘，而保留了抗原性極小的基底膜作為支架引導(dǎo)軸突沿移植物內(nèi)管向遠(yuǎn)端生長，引導(dǎo)宿主許旺細(xì)胞沿其內(nèi)管壁向移植段遷移和增殖，避免或極大地減輕宿主的免疫排斥反，使軸突再生通過一段較長距離成為可能.同時獲得以施萬細(xì)胞基底膜管(SCBL)為主的神經(jīng)外基質(zhì)構(gòu)成的三維管狀支架材料.軸突再生的研究表明，SCBL是由含豐富層黏蛋白(LN)的細(xì)胞外基質(zhì)組成，它能夠促進(jìn)宿主施萬細(xì)胞向神經(jīng)移植段內(nèi)遷移，引導(dǎo)軸突沿著SCBL的內(nèi)面生長[8].

本實驗大體組織觀察發(fā)現(xiàn):脫細(xì)胞神經(jīng)移植段周圍組織黏連及瘢痕形成較輕微，神經(jīng)連續(xù)性良好，無移植段吸收現(xiàn)象.說明脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)與自體神經(jīng)一樣，是良好的神經(jīng)缺損橋接修復(fù)材料，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞神經(jīng)移植段中央顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束，并有完整的外膜包裹，出現(xiàn)大量髓鞘形成的早期像，軸索位于橢圓形施萬細(xì)胞的一側(cè).

經(jīng)3% Triton X－100和4%脫氧膽酸鈉萃取的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架，其神經(jīng)修復(fù)過程未表現(xiàn)出對大鼠機(jī)體及周圍組織的毒性及炎癥刺激，新生神經(jīng)軸突微管、微絲、毛細(xì)血管、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，髓鞘可見同心圓狀板層結(jié)構(gòu)，雪旺細(xì)胞核清晰可見，其與自體神經(jīng)移植修復(fù)無明顯差異.說明此種脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架有作為神經(jīng)缺損修復(fù)的橋接物的潛力，可作進(jìn)一步研究.

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收稿日期:( 2014. 12. 11)

作者簡介:劉良燚(1980－)，男，漢族，貴州遵義人，碩士，主治醫(yī)生，研究方向為周圍神經(jīng)修復(fù).E－mail: liuliangyi3@163. com

基金項目:深圳市龍崗區(qū)科技局項目(ys2012187).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0073－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R745