佟玉風(fēng)　巴根那白梅榮　包明蘭　葉日貴　拉喜那木吉拉內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古　通遼　028000

液質(zhì)聯(lián)用分析D－GlaN致急性肝損傷模型大鼠尿液中肋柱花的化學(xué)成分

佟玉風(fēng)巴根那*白梅榮包明蘭葉日貴拉喜那木吉拉
內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼028000

【摘要】目的:研究肋柱花水煎液在D－GlaN致急性肝損傷模型大鼠尿液中的化學(xué)成分.方法:采用腹腔注射D－GlaN制備急性肝損傷大鼠模型;利用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)模型大鼠灌胃肋柱花水煎液后尿液中化學(xué)成分進(jìn)行分析，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;流動(dòng)相為甲醇－0. 1%甲酸水溶液;流速1. 0ml/min;柱溫35℃;梯度洗脫，質(zhì)譜定性采用多級(jí)離子阱質(zhì)譜，負(fù)離子模式掃描.結(jié)果:在含藥尿液中共標(biāo)識(shí)19個(gè)峰，1個(gè)為藥物原型成分，14個(gè)為代謝產(chǎn)物，其余為尿液內(nèi)源性成分.結(jié)論:該方法較全面的分析肋柱花在急性肝損傷模型大鼠尿液中的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究肋柱花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù).

【關(guān)鍵詞】肋柱花;液質(zhì)聯(lián)用;急性肝損傷模型;尿液

Chemical composition analysis of Herba Lomatognii in the urine from ratmodel of D－GlaN induced acute liver injury by LC－MS

TONG Yu-feng，BA Gen-na，BAI Mei-rong，BAO Ming-lan，YE Ri-gui
Inner Mongolia University for the Nationalities，TongLiao 028000，China

Abstract:Objective To analyze the chemical composition of Herba Lomatognii water decoction in the urine from rat model of DGlaN induced acute liver injury．Methods Intraperitoneal injected D－GlaN to prepare rat model of acute liver injury; Analyze the chemical composition of the urine after the rats were given Herba Lomatognii water decoction by gavage; The detection wavelength was 280nm; the mobile phase was methanol and water; the flow rate was 1. 0ml/min; column temperature was 35℃; gradient elute．Results 19 compositions were detected in the Medicated urine，1 ones were drug－induced compositions，14 ones were metabolites，and others were the natural ingredients for urine．Conclusion This method comprehensively analyzed the chemicalcomposition of Herba Lomatognii in the urine from rat model of D－GlaN induced acute liver injury．This research is a theoretical indication for the further research on effective substance of Herba Lomatogonii．

Key words:Herba Lomatogonii; LC－MS; Acute liver injury model; Urine

肋柱花為龍膽科肋柱花屬植物肋柱花Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草.廣布在我國西藏、云南、四川、青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙、山西和河北.該藥是蒙醫(yī)特色藥材，具有平息協(xié)日、清熱、健胃、愈傷之功.主要用于清協(xié)日熱、瘟疫、流感、傷寒、中暑頭痛、肝膽熱、黃疸、胃協(xié)日、傷熱等病癥[1].1998年收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊(cè)).近年來，研究資料顯示，肋柱花所含黃酮類化合物、木犀草素、齊敦果酸等均具有不同程度的利膽、保肝活性[2]，在一定程度上提示肋柱花可用于治療肝膽疾病.

課題組對(duì)該藥材乙酸乙酯、氯仿、正丁醇及石油醚提取物化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并發(fā)現(xiàn)了新化學(xué)成分[3－6].本研究通過灌胃給予D－GlaN致急性肝損傷模型大鼠肋柱花水煎液，收集24h的尿液樣品，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)色譜峰歸屬進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究肋柱花藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了方法學(xué)基礎(chǔ).

1　儀器與材料

1. 1儀器Agilent 1100 series LC－MSD液質(zhì)聯(lián)用儀(包括: Agilent SL型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、DAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、chemistation化學(xué)工作站); Agilent 1260 Infinitely半制備高效液相色譜儀(美國安捷倫); TGL－20B高速離心機(jī); KQ－200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器; AUW120D電子分析天平; DP－01無油真空泵;過濾器和普通玻璃儀器等.

1. 2藥物和試劑肋柱花藥材(興安盟左翼中旗);木犀草素(批號(hào): 111520－200504)、齊墩果酸(批號(hào): 110709 －201206)、獐牙菜苦苷(批號(hào): 0785－200203)購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、甲酸為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純.

1. 3動(dòng)物SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體重(200±10)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供.

2　方法與結(jié)果

2. 1肋柱花水提物制備稱取1kg肋柱花，第一次加水量為10倍，煎煮提取1. 5h，第二次加水量為8倍，煎煮提取1h，第三次加水量為6倍，煎煮提取1h，共提取3次，合并3次提取液減壓濃縮，干燥得浸膏，低溫保存待用.

2. 2體外藥材溶液的制備精密稱取肋柱花浸膏0. 1177g，置于100ml錐形瓶中，精密加入25ml色譜甲醇，密塞，稱定重量70. 6425g(具塞)，超聲40min后放冷，再稱定重量，用色譜甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取上液1ml過0. 45μm微孔濾膜，得待測(cè)溶液.

2. 3對(duì)照品溶液的制備精密稱取獐牙菜苦苷1. 1mg、木犀草素1. 2mg、齊墩果酸1mg，分別置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，取1ml上清液，過0. 45μm微孔濾膜，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

2. 4色譜條件色譜柱: Venusil MP C18(4. 6×300mm，5μm);流動(dòng)相: A為0. 1%甲酸水溶液，B為甲醇;柱溫: 35℃;進(jìn)樣體積: 30μl;流速: 1. 0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm，梯度洗脫.如表1.

表1　不同時(shí)間流動(dòng)相的情況

2. 5質(zhì)譜條件電離源:電噴霧離子源(ESI);檢測(cè)方式:負(fù)離子檢測(cè);掃描范圍: m/z 50～800;干燥氣溫度: 350℃;干燥氣流量9. 0L/min;霧化氣壓強(qiáng): 0. 24MPa(35. 0psi);毛細(xì)管電壓: 4000V.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Data Analysis軟件處理.

2. 6 D－GlaN致急性肝損傷模型的復(fù)制[7]選取大鼠16只，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，模型腹腔注射300mg/kg D－GlaN 24h后處死小鼠，觀察血清AST、ALT含量，正常對(duì)照組腹腔注射300mg/kg生理鹽水，判斷模型是否成功.

2. 7尿液樣品的收集取Wistar雄性大鼠15只，隨機(jī)分為空白組，模型組，模型加肋柱花組，每組各5只.將大鼠正常飼養(yǎng)3d使其適應(yīng)環(huán)境，從第4天開始模型加肋柱花組按5. 4g/kg劑量灌胃肋柱花水煎液，空白組和模型組灌胃等容量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7d，于末次給藥后1h，模型組和模型加肋柱花組大鼠按照300mg/kg腹腔注射D－GlaN進(jìn)行造模.將各組大鼠置于代謝籠中，分別收集24h尿液，將尿液置于－40℃冰箱備用.

2. 8尿液樣品的預(yù)處理[8]

2. 8. 1乙酸乙酯萃取法將凍存的各組尿液樣品置于室溫下緩慢融化，12000r/min離心10min，取上清液2. 0ml，每次加2倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，用1. 0ml色譜甲醇超聲溶解，0. 22μm微孔濾膜過濾備用.

2. 8. 2 SPE小柱固相萃取法將凍存的各組尿液置于室溫下緩慢溶解，12000r/min離心10min，取上清液2ml，用HBL固相萃取柱進(jìn)行純化，先用1ml蒸餾水洗去雜質(zhì)，洗脫液棄用;再用2ml甲醇洗脫，減壓濃縮至干，殘?jiān)?ml色譜甲醇溶解，0. 22μm微孔濾膜過濾備用.

2. 8. 3正丁醇萃取法將凍存的空白及給藥組尿液樣品置于室溫下緩慢融化，12000r/min離心10min，取上清液2. 0ml，每次加2倍水飽和的正丁醇溶液，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，用1. 0ml色譜甲醇超聲溶解，0. 22μm微孔濾膜過濾備用.

2. 9液質(zhì)聯(lián)用圖譜測(cè)定分別吸取空白尿液、模型尿液、含藥尿液供試品溶液、體外藥材溶液及對(duì)照品溶液各30μl進(jìn)樣，記錄60min的色譜圖.

2. 10結(jié)果對(duì)比空白尿液、模型尿液、肋柱花尿液、肋柱花體外藥材HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)肋柱花尿液共標(biāo)識(shí)19個(gè)成分，結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收和二級(jí)質(zhì)譜分析得知4、8、13、19號(hào)峰為尿液內(nèi)源性成分，15號(hào)峰為藥物原型成分，1、2、3、5、6、7、9、10、11、12、14、16、17、18號(hào)峰推測(cè)其為體內(nèi)代謝產(chǎn)物.LC圖譜比較如下圖:

圖1　正常組尿液圖譜

圖2　模型組尿液圖譜

圖3　肋柱花體外圖譜

圖4　肋柱花尿液圖譜

3　討論

3. 1尿液樣品處理方法的選擇通過對(duì)比SPE小柱固相萃取法、乙酸乙酯萃取法和正丁醇萃取法液相圖譜，發(fā)現(xiàn)SPE小柱固相萃取法的選擇性好、保留成分多、引入雜質(zhì)量少，對(duì)樣品起到了很好的純化作用，可作為含藥尿液的處理方法.

3. 2流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇實(shí)驗(yàn)中分別嘗試了甲醇－水、甲醇－0. 1%甲酸水溶液等不同流動(dòng)相梯度洗脫，對(duì)比發(fā)現(xiàn)甲醇－0. 1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的峰型好，分離度良好，故選擇了甲醇－0. 1%甲酸水溶液梯度洗脫為流動(dòng)相.檢測(cè)波長(zhǎng)分別測(cè)定了210、238、254、280、305nm，其中在280nm波長(zhǎng)下基線平穩(wěn)，分離度良好，故選擇了280nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

3. 3結(jié)論課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明肋柱花具有一定的保肝作用[9]，經(jīng)過適當(dāng)途徑給藥后，在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝等過程最后吸收入血的往往是多個(gè)單體成分形成的有效成分群，其結(jié)構(gòu)既可以是肋柱花的原型成分，也可以是代謝產(chǎn)物或肋柱花中各成分間相互反應(yīng)形成的新成分，還可以

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收稿日期:( 2014. 12. 07)

通信作者:巴根那(1960－)，男，蒙古族，教授，研究方向?yàn)槊伤幣湮橐?guī)律及新藥研發(fā).

作者簡(jiǎn)介:佟玉風(fēng)(1987－)，女，蒙古族，碩士研究生.

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8360673).

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)05－0012－03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R284. 1