朱昌國潘朝旺.湖北省鄂州市第三醫(yī)院，湖北　鄂州　436000; .湖北省鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北　鄂州　436000

九龍蟲對自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相關(guān)蛋白的影響

朱昌國1潘朝旺2
1.湖北省鄂州市第三醫(yī)院，湖北鄂州436000; 2.湖北省鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北鄂州436000

【摘要】目的:觀察九龍蟲對自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相關(guān)蛋白的影響.方法: 15月齡SD雌性大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、九龍蟲低、中、高劑量組，4月齡大鼠為青年組.給藥42d后，測定卵巢SOD、GSH－PX活性及MDA含量，采用免疫組織化學(xué)分析方法檢測卵巢凋亡相關(guān)基因Bcl－2和Bax的表達(dá).結(jié)果:與青年組比較，模型組SOD、GSH－PX活性和Bax表達(dá)降低，MDA含量和Bcl－2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 01)，陽性對照組和九龍蟲各劑量組的上述指標(biāo)均得到改善.結(jié)論:九龍蟲抗衰老作用可能通過改善卵巢氧自由基及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而實現(xiàn).

【關(guān)鍵詞】九龍蟲;卵巢;氧自由基;凋亡相關(guān)蛋白

Effects of Jiulong Insect on Oxyen Free Radicals and Apoptosis－associated Protein of Ovary in Natural－aging Rats

ZHU Chang-guo1，PAN Chao-wang2
1. Ezhou third hospital，Ezhou 436000，China; 2. Ezhou Polytechnic，Ezhou 436000，China

Abstract:Objective To observe the effects of Jiulong insect on Oxyen free radicals and apoptosis－associated protein of ovary in natural－aging rats．Methods SD female rats of 15 months old were divided randomly into model group，positive control group，Jiulong Insect high dosage group，Jiulong Insect medium dosage group and Jiulong Insect low dosage group．SD female rats of 4 months old formed a youth group．42 days later，The activities of SOD and GSH－PX，content of MDA in ovary were measured，the expression of apoptosis－associated Bax and Bcl－2 were detected by immunocytochemistry．Results The SOD，GSH－PX and Bax were decreased，the MDA and Bcl－2 were increased in model group，compared with youth group(P＜0. 01)．The above index were ameliorated in treatment groups．Conclusion The anti－aging activity of Jiulong insect is achieved by improving the SOD，GSH－PX，Bax and lowering the MDA and Bcl－2 of ovary．

Key words:Jiulong insectp; Ovary; Oxyen free radicals; apoptosis－associated protein

衰老是指機體各器官功能普遍的、逐漸降低的過程，對于女性而言，卵巢尤為明顯.本實驗旨在研究九龍蟲對自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相關(guān)蛋白的影響，探討其延緩衰老機制.

1　材料與儀器

1. 1動物SPF級SD雌性大鼠，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號: SCXK(鄂)2011－0012; 4月齡10只，體重(200±20)g; 15月齡50只，體重(350± 30)g.

1. 2藥品與試劑九龍蟲散(自制，用前配成混懸液);維生素E(批號: 20120422，海南養(yǎng)生堂保健品有限公司);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)試劑盒(批號: 20120516)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(批號: 20120409)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號: 20120314)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號: 20120324)均購自南京建成生物工程研究所; SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(上海研卉生物科技有限公司); DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司).

1. 3儀器UV754紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司);高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器公司);超薄切片機(上海五相儀器儀表有限公司).

2　方法

2. 1動物造模及分組給藥50只15月齡雌性老齡模型大鼠，隨機分為模型組、陽性對照組、九龍蟲低劑量、九龍蟲中劑量、九龍蟲高劑量組，每組10只; 4月齡大鼠為青年組.九龍蟲低、中、高劑量組灌胃給予九龍蟲混懸液0. 007、0. 014、0. 028g/(kg·d)，陽性對照組給予維生素E 15mg/(kg·d)，模型組、青年組給予生理鹽水15ml/(kg·d)，連續(xù)42d.末次給藥24h后，稱重，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測.

2. 2卵巢SOD、GSH－PX活性及MDA含量的測定將大鼠用3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，取左側(cè)卵巢，稱重后加9倍重量生理鹽水制備勻漿，按試劑盒說明進(jìn)行SOD、GSH－PX活力和MDA含量的測定.

2. 3卵巢凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2和Bax的測定取大鼠右側(cè)卵巢，立即用10%甲醛液固定，石蠟包埋切片，片厚5μm.按照試劑盒說明書步驟作SP法免疫組化染色.以PBS替代一抗作為陰性對照.細(xì)胞漿有棕黃色彌散細(xì)顆粒者為陽性反應(yīng)細(xì)胞.每張切片隨機選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的部位，選取10個視野計數(shù).采用Motic6. 0數(shù)據(jù)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度法分析.

2. 4統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS16. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，

各實驗組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用t檢驗，P＜0. 05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3　結(jié)果

3. 1對卵巢SOD、GSH－PX活性及MDA含量的影響與青年組比較，模型組SOD、GSH－PX活性降低，MDA含量升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 01);陽性對照組和九龍蟲各劑量組與模型組比較，SOD、GSH－PX活力升高，MDA含量降低(P＜0. 05或P＜0. 01).見表1.

表1　九龍蟲對自然衰老大鼠卵巢SOD、GSH－PX活力和MDA含量的影響(x±s，n =10)

3. 2對卵巢凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2和Bax的影響與青年組比較，模型組Bcl－2降低，Bax升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 01);陽性對照組和九龍蟲各劑量組與模型組比較，Bcl－2升高，Bax降低(P＜0. 05或P ＜0. 01).見表2.

表2　九龍蟲對自然衰老大鼠卵巢凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2和Bax的影響(x±s，n =10)

4　討論

卵巢作為女性的性腺，在維持正常生育功能的同時，對女性的生長發(fā)育、抵御疾病等方面具有非常重要的作用，女性機體衰老是從卵巢衰老開始的.衰老的自由基學(xué)說為目前國際學(xué)術(shù)界所公認(rèn)，有研究證明[1]，衰老小鼠卵巢SOD活性較正常小鼠明顯降低，MDA含量則明顯升高;氧自由基的變化可促使活性氧對蛋白、膜脂和DNA的損傷，在不同程度上引起卵巢功能的減退[2].本研究表明，與青年大鼠相比，老年大鼠卵巢SOD、GSH－PX活性明顯降低，而MDA含量則明顯升高，并發(fā)現(xiàn)九龍蟲可以抑制老年大鼠卵巢SOD、GSH－PX活性的降低，并能降低MDA含量.

B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。?(Bcl－2)蛋白家族是一個特別的家族，目前已發(fā)現(xiàn)20多種Bcl－2家族同源蛋白，根據(jù)功能不同分為兩組，一組為促凋亡蛋白，如Bax、Bid等，另一組為抗凋亡蛋白，如Bcl－2、Bcl－x等[3].Bcl－2通過編碼蛋白發(fā)揮調(diào)控作用，是重要的凋亡抑制基因，可與Bax形成能阻遏細(xì)胞凋亡異源二聚體.Bax過量表達(dá)時，可自身結(jié)合成同源二聚體，促進(jìn)凋亡的發(fā)生.李亞麗[4]等研究表明，D－半乳糖衰老大鼠較正常大鼠卵巢細(xì)胞Bcl－2表達(dá)量減少，Bax表達(dá)量增加，提示衰老可能跟促進(jìn)卵巢細(xì)胞凋亡有關(guān);我們對自然衰老大鼠的研究也得到同樣結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)九龍蟲促進(jìn)Bcl－2表達(dá)，抑制Bax表達(dá).

綜上所述，九龍蟲可通過影響卵巢氧自由基的產(chǎn)生及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加SOD、GSH－PX活性和Bax表達(dá)，減少MDA含量和Bcl－2表達(dá)而起到抗衰老作用.

參考文獻(xiàn)

[1]敖恩寶力格，包秋華，王金妞，等．蒙藥高尤－9對衰老大鼠卵巢抗氧化活性及端粒酶活性的影響[J]．中國老年學(xué)雜志，2011，31(20): 3997－3999．

[2]St－Pierre J，Buckinghan JA，Roebuck SJ，et al．Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain[J]．J Biol Chem，2002，277(47): 44784．

[3]Xu D，Wang Z N，Zhu W J，et al．Effects of local testicular heating on Bcl－2 and Bax protein expression in spermatogenic cells in rats[J]．J Reprod Contrac，2005，16(1): 23－28．

[4]李亞麗，楚偉，王方娜，等．何首烏飲對衰老大鼠卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl－2及Caspase－3表達(dá)的影響[J]．中國新藥雜志，2011，20(18): 1791－1794．

收稿日期:( 2014. 12. 05)

作者簡介:朱昌國(1972－)，男，湖北鄂州人，主管藥師，主要從事藥學(xué)調(diào)劑和藥理研究.

基金項目:湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(B2013002).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0017－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R285. 5