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含維生素C、維生素E和阿魏酸的外用復(fù)方抗氧化制劑對(duì)紫外線導(dǎo)致中國(guó)女性皮膚光損傷的保護(hù)功效

眾所周知，連續(xù)的紫外線（UV）照射可導(dǎo)致日曬傷、紅斑、水腫、光老化和皮膚癌在內(nèi)的多種皮膚生物學(xué)效應(yīng)。UV照射誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞水平活性氧簇（ROS）的增加是產(chǎn)生上述現(xiàn)象的機(jī)制之一，生成的ROS會(huì)損傷表皮和真皮細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，以及激發(fā)皮膚的炎癥反應(yīng)。占紫外線95%的UVA（波長(zhǎng)320～400 nm）是導(dǎo)致人皮膚氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要來源。很多研究發(fā)現(xiàn)，累積的UVA照射可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，而DNA的損傷可能導(dǎo)致皮膚光老化、致癌基因和腫瘤抑制基因表達(dá)的改變，以及皮膚癌的產(chǎn)生。另外，UVB（波長(zhǎng)290～320 nm）照射可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子損傷并誘發(fā)ROS生成，生成的ROS（如羥基自由基和超氧離子等）可激活基因、損傷DNA、氧化細(xì)胞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。

人類皮膚具有抵御氧化性損傷的防御機(jī)制，保護(hù)細(xì)胞免受光損傷。即由一些酶和非酶類物質(zhì)組合來清除皮膚內(nèi)生成的ROS。如果人體持續(xù)暴露在UV中，皮膚自身的抗氧化機(jī)制將會(huì)受到巨大壓力，同時(shí)生成更多的ROS。因此，需要采取一些必要策略來增強(qiáng)皮膚的抗氧化能力，抵御光損傷。

作為人體的獲得性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維生素C（抗壞血酸）和維生素E（主要是生育酚）能夠清除體內(nèi)自由基，抵御ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。維生素C能夠直接清除水相的自由基、保護(hù)細(xì)胞膜；維生素E則通過抑制脂質(zhì)氧化來清除脂相中的自由基；維生素C和E同時(shí)作用能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。阿魏酸是一種大量存在于植物中的高效酚系抗氧化物。已有研究報(bào)道阿魏酸可以通過抵御脂質(zhì)氧化和中和烷氧自由基來保護(hù)細(xì)胞膜，同時(shí)抑制由羥基自由基、一氧化氮和超氧自由基所造成的細(xì)胞損傷。當(dāng)把阿魏酸整合到含維生素C和（或）E的配方中時(shí)，可以增強(qiáng)維生素經(jīng)皮滲透的作用，提高制劑的化學(xué)穩(wěn)定性，其光防護(hù)功效兩倍于單獨(dú)使用維生素C和E的配方。

該研究建議外用抗氧化制劑對(duì)UV誘導(dǎo)的皮膚損傷做有效補(bǔ)充。這些制劑可以在皮膚內(nèi)提供數(shù)天的抗氧化功效。近年，也有多種植物來源的抗氧化物被證實(shí)具有清除皮膚內(nèi)自由基、抵御皮膚光損傷的功效。該研究旨在探討含維生素C和E以及阿魏酸的外用復(fù)方抗氧化制劑對(duì)日光模擬照射所致皮膚光損傷的臨床防護(hù)功效。

一、對(duì)象和方法

研究招募了12名18～60歲FitzpatrickⅢ型或Ⅳ型的中國(guó)健康女性志愿者，均簽署了知情同意書。為避免環(huán)境日曬的混淆，該研究于冬季進(jìn)行。

標(biāo)記出每名志愿者背部4處未受照射的皮膚區(qū)域。將復(fù)方抗氧化制劑AOx（維生素C和E以及阿魏酸）和該制劑的賦形劑連續(xù)4 d分別涂抹于背部標(biāo)記的兩個(gè)部位。第4天，對(duì)AOx處理部位、賦形劑處理部位和一處空白部位（陽性對(duì)照）進(jìn)行日光模擬照射，劑量為5倍的最小紅斑劑量。第4處部位留做陰性對(duì)照，既無產(chǎn)品處理也不接受日光模擬照射。對(duì)照射后4個(gè)部位進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)照片拍攝，并對(duì)紅斑形成情況進(jìn)行比較；紅斑指數(shù)（EI）值由Mexameter 18測(cè)得，對(duì)比照射前后各部位EI值的變化情況。日光模擬照射后24 h對(duì)各標(biāo)記部位皮膚進(jìn)行組織活檢，使用HE和免疫組化染色后進(jìn)行定量檢測(cè)，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。詳細(xì)方法見原文。

二、結(jié)果

1.紅斑反應(yīng)和EI：照射前后對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)照片發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照組出現(xiàn)明顯的紅斑并伴有輕微水腫，賦形劑組有明顯的紅斑，而AOx組僅出現(xiàn)輕微的紅斑反應(yīng)。照射前，4個(gè)部位的EI值均相似（157.25～174.25，P＞0.05）。經(jīng)5個(gè)MED照射后，受照射部位的EI值均明顯升高：AOx組為375.33，賦形劑組為418.11，陽性對(duì)照組為439.89。相比賦形劑組（243.86；P=0.07）和陽性對(duì)照（266.39；P＜ 0.05），AOx組的EI差值最?。?17.97）。

2.曬傷細(xì)胞：曬傷細(xì)胞為表皮凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞，是UV誘導(dǎo)的急性損傷。5個(gè)MED照射后，賦形劑組（40.08/HPF）和陽性對(duì)照組（41/HPF）均觀察到了大量曬傷細(xì)胞；而AOx組（21.42/HPF；P＜0.05）則對(duì)UV誘導(dǎo)的曬傷細(xì)胞有顯著抑制。

3.p53：在細(xì)胞抑制和凋亡的過程中，p53蛋白起重要作用。已知UV誘導(dǎo)DNA損傷后會(huì)激活角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)。5個(gè)MED照射后，賦形劑組（192.25/HPF）和陽性對(duì)照組（198.83/HPF）都觀察到了大量p53陽性細(xì)胞，而AOx組（142.33/HPF）的p53陽性細(xì)胞量較少。陰性對(duì)照組為7.25/HPF。

4.胸腺嘧啶二聚體：UV誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生在皮膚光致癌發(fā)生機(jī)制中起重要作用。5個(gè)MED照射后，賦形劑組（512.83/HPF）和陽性對(duì)照組（480.25/HPF）的胸腺嘧啶二聚體陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著較多，而AOx組（355.42/HPF）的增幅適中。陰性對(duì)照未形成陽性細(xì)胞。

5.朗格漢斯細(xì)胞：UV能夠刺激表達(dá)CD1a的朗格漢斯細(xì)胞從表皮遷移至局部淋巴結(jié)，導(dǎo)致表皮朗格漢斯細(xì)胞減少，引發(fā)皮膚免疫抑制。5個(gè)MED照射后，賦形劑組（7.33/HPF）及陽性對(duì)照組（8.33/HPF）CD1a陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而AOx組（15.73/HPF；P＜0.05）減幅最小。陰性對(duì)照內(nèi)有大量的朗格漢斯細(xì)胞（27.92/HPF）。

三、討論

UV可誘導(dǎo)人體皮膚一系列復(fù)雜的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，UV會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和抗氧化酶的耗竭；導(dǎo)致DNA損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體和p53的過度表達(dá)；還會(huì)激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)導(dǎo)致免疫抑制和神經(jīng)內(nèi)分泌介導(dǎo)物質(zhì)的釋放。在ROS誘導(dǎo)組織發(fā)生氧化性改變之前，人體會(huì)利用一系列低分子質(zhì)量的抗氧化物來中和ROS，抵御氧化損傷。當(dāng)自由基產(chǎn)量過多，且細(xì)胞無法靠自身的抗氧化機(jī)制來中和時(shí)，出現(xiàn)了氧化應(yīng)激。

皮膚中的主要抗氧化物為維生素C與維生素E。維生素C與超氧離子或羥自由基作用，可抑制或阻斷UV誘導(dǎo)ROS的生成。維生素C還能影響酪氨酸酶的活性，使氧化型黑素轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型黑素，抑制黑素生成。維生素E是皮膚中主要的脂溶性抗氧化物。維生素E最重要的亞型是α生育酚，構(gòu)成了細(xì)胞脂質(zhì)自由基第一道防線。維生素E已被用于抗老化研究，因?yàn)樗芮宄?xì)胞中沉積的黑素、延緩老化進(jìn)程。每日口服3 g維生素C和2 g維生素E，可使皮膚抵御光損傷的能力提高1.5倍，表明這兩種維生素具有協(xié)同效應(yīng)。

作為酚系植物抗氧化物，阿魏酸本身也能夠清除自由基并抑制自由基合成酶的活性；還能顯著提高谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和醌還原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性。之前作者研究已報(bào)道將阿魏酸加入維生素C和維生素E外用溶液配方中能提高維生素的化學(xué)穩(wěn)定性，同時(shí)通過對(duì)比紅斑反應(yīng)和曬傷細(xì)胞形成的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)其皮膚光防護(hù)功效是單用維生素C和E制劑的兩倍。

該研究發(fā)現(xiàn)，含維生素C、維生素E和阿魏酸的外用抗氧化制劑（AOx）可抑制日光模擬照射誘導(dǎo)的紅斑反應(yīng)。雖然其EI的平均值上升，但其差值（與照射前的EI差）遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照組。對(duì)曬傷細(xì)胞形成的抑制作用，相比賦形劑組和陽性對(duì)照組，AOx可使曬傷細(xì)胞的形成降低近一半（21.42/HPF）。皮膚對(duì)UV照射的初期反應(yīng)是皮膚血管擴(kuò)張，產(chǎn)生紅斑。該中國(guó)女性志愿者的臨床測(cè)試結(jié)果表明，外用含維生素C、維生素E和阿魏酸的復(fù)方抗氧化制劑能明顯抑制日光模擬照射誘導(dǎo)的皮膚紅斑反應(yīng)。

研究還發(fā)現(xiàn)在未使用產(chǎn)品的陽性對(duì)照組中，急性日光模擬照射可誘導(dǎo)p53的過度表達(dá)和形成嘧啶二聚體。p53在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)應(yīng)對(duì)應(yīng)激的多種適應(yīng)性和保護(hù)性反應(yīng)。當(dāng)正常的細(xì)胞接受到DNA損傷或氧化應(yīng)激的信號(hào)時(shí)，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或凋亡的下游靶基因會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。由于p53基因的突變主要在胸腺嘧啶二聚體的位點(diǎn)發(fā)生，因此這種現(xiàn)象是合理的。胸腺嘧啶二聚體是UV誘導(dǎo)DNA損傷的結(jié)果，它能夠改變DNA的生物功能，已證實(shí)涉及多個(gè)有害通路，包括紅斑和曬傷細(xì)胞形成、免疫抑制和腫瘤形成。有研究者指出，阿魏酸、維生素C和維生素E復(fù)方制劑能抑制胸腺嘧啶二聚體、半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的形成。這種制劑能夠降低p53的過度表達(dá)和胸腺嘧啶二聚體的形成（降幅分別為25%與30%）。

朗格漢斯細(xì)胞能夠捕獲、提呈和處理感染皮膚的抗原，是表皮中唯一具有表達(dá)抗原特異性CD1a的樹突細(xì)胞。UV照射可抑制皮膚內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，誘發(fā)皮膚的免疫抑制。該研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)5個(gè)MED照射后24 h，陽性對(duì)照組中表達(dá)CD1a的朗格漢斯細(xì)胞顯著降低了70%（27.92/HPF降到8/HPF）。而AOx組的朗格漢斯細(xì)胞細(xì)胞為15.75/HPF，說明該抗氧化制劑能夠保護(hù)皮膚內(nèi)的朗格漢斯細(xì)胞抵御光損傷。

綜上所述，對(duì)于日光模擬照射所造成急性光損傷（包括紅斑、曬傷細(xì)胞形成、p53過度表達(dá)、胸腺嘧啶二聚體形成和LC消耗），含維生素C、維生素E和阿魏酸的外用復(fù)方抗氧化制劑均可有效預(yù)防，說明該復(fù)方制劑具有良好的光防護(hù)功效。

防曬霜的使用雖然能夠?yàn)槠つw提供光防護(hù)，但人們?nèi)粘?duì)防曬霜的使用不當(dāng)可能會(huì)減弱光防護(hù)的效力。例如，防曬霜使用劑量不足、使用后極易被擦拭或洗去、沒有選擇廣譜防曬類產(chǎn)品（能夠同時(shí)抵御UVB和UVA甚至是UVA1的防曬類產(chǎn)品）等。近年的研究證明：使用抗氧化制劑可作為預(yù)防UV誘導(dǎo)皮膚光損傷的有效策略，抗氧化制劑能夠同時(shí)作用在皮膚表面和內(nèi)部，它的抗氧化功效能夠持續(xù)數(shù)日。因此，同時(shí)使用含維生素C、維生素E和阿魏酸的抗氧化制劑和廣譜防曬類產(chǎn)品，能夠?yàn)槿藗內(nèi)粘Ｉ钐峁┳罴训墓夥雷o(hù)效果。

［摘自Wu Y,Zheng X,Xu XG,et al.Protective effects of a topical antioxidant complex containing vitamins C and E and ferulic acid against UV irradiation?induced photodamge in Chinese woman［J］.J Drugs Dermatol,2013,12（4）:464?468.］