劉建新，王金成，王瑞娟，賈海燕

(隴東學院生命科學與技術學院，甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室, 甘肅 慶陽 745000)

外源一氧化氮提高裸燕麥幼苗的耐堿性

劉建新*，王金成，王瑞娟，賈海燕

(隴東學院生命科學與技術學院，甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室, 甘肅 慶陽 745000)

摘要：采用營養(yǎng)液砂培方法，研究外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗生長、活性氧代謝和滲透溶質(zhì)積累的影響。結果表明，1~200 μmol/L SNP能夠緩解75 mmol/L NaHCO3脅迫對裸燕麥幼苗生長的抑制作用，25 μmol/L SNP的緩解作用最明顯，可降低裸燕麥葉片O2·-、H2O2、丙二醛和有機酸含量，增強幼苗葉片超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和質(zhì)膜H+-ATPase活性，提高葉片谷胱甘肽、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸、脯氨酸含量和K+/Na+，但對抗壞血酸含量影響不大。分析表明，外源NO可能通過激活抗氧化系統(tǒng)活性、促進滲透溶質(zhì)積累和改善Na+、K+平衡緩解堿脅迫對幼苗的傷害和生長抑制，從而提高裸燕麥的耐堿性。

關鍵詞：一氧化氮；裸燕麥；堿脅迫；活性氧代謝；滲透溶質(zhì)

DOI：10.11686/cyxb2014352http://cyxb.lzu.edu.cn

劉建新，王金成，王瑞娟，賈海燕. 外源一氧化氮提高裸燕麥幼苗的耐堿性. 草業(yè)學報, 2015, 24(8): 110-117.

Liu J X, Wang J C, Wang R J, Jia H Y. Exogenous nitric oxide elevated alkali tolerance ofAvenanudaseedlings. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 110-117.

收稿日期：2014-08-21；改回日期：2014-10-08

基金項目：甘肅省慶陽市科技計劃項目(KZ2014-19)資助。

作者簡介：劉建新(1964-), 男, 甘肅通渭人, 教授。

通訊作者*Corresponding author. E-mail: liujx1964@163.com

Exogenous nitric oxide elevated alkali tolerance ofAvenanudaseedlings

LIU Jian-Xin*, WANG Jin-Cheng, WANG Rui-Juan, JIA Hai-Yan

CollegeofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,UniversityProvincialKeyLaboratoryforProtectionandUtilizationofLongdongBio-resourcesinGansuProvince,Qingyang745000,China

Abstract:The effects of sodium nitroprusside (SNP) as a nitric oxide (NO) donor on growth, leaf reactive oxygen metabolism and osmotic accumulation in naked oat (Avena nuda) seedlings under NaHCO3stress were investigated by a sand nutrient cultivation method. SNP exposure at concentration ranges of 1-200 μmol/L, especially at 25 μmol/L, significantly alleviated NaHCO3-related growth inhibition of seedlings by decreasing the levels of O2·-, H2O2, malondialdehyde and organic acid, and increased the activities of superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase and plasma membrane H+-ATPase in leaves under 75 mmol/L NaHCO3stress. Similarly, the concentrations of reduced glutathione, soluble sugar, soluble protein, free amino acid and proline as well as K+/Na+ratio were also increased significantly in seedling leaves under the same stress, but ascorbic acid concentration was not affected significantly. The results indicate that NO may alleviate the damage and growth inhibition caused by alkali stress in naked oat seedlings via activation of antioxidant system activity, acceleration of osmotic accumulation and maintenance of Na+and K+balance, thus improving alkali resistance of the naked oat plants.

Key words:nitric oxide; Avena nuda; alkali stress; reactive oxygen metabolism; osmotica

土壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的全球性問題[1]。鹽堿化土壤中的致害鹽類除以NaCl和Na2SO4為主的中性鹽外，還有以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽。通常將中性鹽脅迫稱為鹽脅迫，而將堿性鹽脅迫稱為堿脅迫。鹽、堿脅迫下，植物共同遭受離子毒害和滲透脅迫，但堿脅迫還要受高pH值脅迫。因而，堿脅迫通常比鹽脅迫具有更強的生態(tài)破壞力。有研究證明，堿脅迫和鹽脅迫是兩種既相關但又有本質(zhì)區(qū)別的不同性質(zhì)的脅迫[2]。但以往的植物抗鹽堿研究多以鹽脅迫為主，對堿脅迫涉及較少。提高活性氧(ROS)清除系統(tǒng)活性及滲透調(diào)節(jié)功能能夠增強植物對鹽堿脅迫的適應能力[3-4]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物體內(nèi)的一種信號分子，參與調(diào)節(jié)了許多植物對鹽堿逆境的適應過程。如能夠誘導鹽脅迫下水稻(Oryzasativa)葉片的抗氧化酶活性，增加耐鹽相關基因的轉錄本[5]；緩解鹽脅迫對小麥(Triticumaestivum)幼苗的氧化損傷[6]和玉米(Zeamays)幼苗的生長抑制[7]；增強鹽脅迫長春花(Catharanthusroseus)的光合作用和生物堿積累[8]；上調(diào)抗氧化酶活性和逆境蛋白表達增強菊苣(Cichoriumintybus)鹽適應能力[9]；NO參與堿脅迫下光合功能的調(diào)控增強黑麥草(Loliumperenne)耐堿性[10]。但NO對堿脅迫下燕麥屬植物活性氧代謝、滲透溶質(zhì)積累影響的研究尚鮮見報道。裸燕麥(Avenanuda)是中國北方大面積種植的禾本科燕麥屬糧飼兼用作物，具有耐適度鹽堿的特性。但種植區(qū)土壤較高的NaHCO3含量是春季返鹽季節(jié)裸燕麥保苗難和幼苗生長發(fā)育不良的主要限制因子之一。因此，本試驗研究外源NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗生長、活性氧代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，探討NO對裸燕麥耐堿性的增強效應及其生理機制，為裸燕麥高產(chǎn)栽培和遺傳育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試材料

試驗于2012年5-7月在甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室生物科技園進行。供試裸燕麥品種‘定莜6號’種子由甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心饋贈。NO供體硝普鈉([Na2Fe(CN)5]·NO，德國merck公司產(chǎn)品)先配成100 mmol/L的母液，4℃保存，用時按所需濃度稀釋。

1.2　NaHCO3和SNP濃度的篩選

用0.5% NaClO對精選的裸燕麥種子進行表面消毒30 min，漂洗干凈后置瓷盤中在溫度為28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照/黑暗14 h/10 h，光照強度150 μmol/(m2·s)。待種子露白后選萌發(fā)一致的種子用蒸餾水培養(yǎng)1周后，改用濃度分別為0，25，50，75，100，125，150，175，200 mmol/L NaHCO3培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后根據(jù)植株相對生長量選出NaHCO3處理濃度。在選出的NaHCO3溶液(75 mmol/L)中分別添加0，1，5，10，15，25，50，100，150，200 μmol/L SNP溶液用同樣的方法培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后根據(jù)幼苗相對生長量選出進一步處理的SNP濃度。實驗重復5次，完全隨機化排列。

1.3　材料培養(yǎng)與試驗處理

用0.5% NaClO對裸燕麥種子表面消毒后播種在裝有珍珠巖的培養(yǎng)皿(直徑12 cm)中，每皿播100粒左右，澆足水后置培養(yǎng)室培養(yǎng)。晝/夜溫度(28±5)℃/(21±3)℃，濕度60%~75%，每天光照約12 h，平均光強420 μmol/(m2·s)。幼苗2葉1心時根據(jù)預實驗篩選的NaHCO3和SNP濃度進行如下澆苗處理：1)對照，Hoagland溶液，CK(pH 6.12)；2)Hoagland溶液+75 mmol/L NaHCO3，NaHCO3(pH 8.67)；3) Hoagland溶液+75 mmol/L NaHCO3+25 μmol/L SNP，NaHCO3+SNP(pH 8.61)；4) Hoagland溶液+25 μmol/L SNP，SNP(pH 6.28)。處理期間，每天早晚各更換一次處理液，實驗3次重復，隨機排列。處理7 d后取幼苗葉片保存在-80℃冰箱中用于各項生理指標測定。

1.4　測定指標與方法

1.4.1幼苗相對生長量的測定每個處理取50株幼苗，在105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱干重，以對照組干重為100%，其他處理的幼苗干重與對照組干重比值作為幼苗相對生長量。

1.4.2超氧陰離子(O2·-)、H2O2和MDA含量測定O2·-含量按陳建勛和王曉峰[11]的方法測定。H2O2含量參照Sergiev等[12]的方法測定；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[11]測定。

1.4.3抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性及谷胱甘肽(glutathione，GSH)和抗壞血酸(ascorbic acid， AsA)含量按陳建勛和王曉峰[11]的方法測定。SOD活性以抑制氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原的50%為1個酶活性單位(U)；CAT活性以每分鐘240 nm吸光值(OD)減少0.01為1個活力單位(U)；POD活性以每分鐘470 nm OD值增加0.01為1個活力單位(U)；APX活性以每分鐘290 nm OD值減少0.01為1個活力單位(U)。

1.4.4滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定分別按李合生[13]的蒽酮比色法、考馬斯亮藍法、茚三酮染色法和磺基水楊酸法測定可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸含量。有機酸含量按高俊鳳[14]的方法測定。

1.4.5質(zhì)膜H+-ATPase活性和Na+、K+含量的測定質(zhì)膜微囊提取和H+-ATPase活性測定采用陳海燕等[15]的方法。Na+、K+按趙旭等[16]的方法浸提，F(xiàn)P640型火焰光度計測定浸提液中Na+、K+含量。

1.5　統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 19.0進行方差分析和Duncan法多重比較(P<0.05)。

2結果與分析

2.1　NaHCO3和SNP處理濃度的篩選

圖1顯示，用0~200 mmol/L NaHCO3處理裸燕麥7 d，幼苗相對生長量隨NaHCO3濃度增加呈下降趨勢，75 mmol/L及以上濃度NaHCO3處理與0 mmol/L對照的幼苗相對生長量差異顯著。因此，選用75 mmol/L NaHCO3作為堿脅迫濃度。在75 mmol/L NaHCO3脅迫下用0~200 μmol/L SNP處理裸燕麥時幼苗相對生長量隨SNP濃度遞增呈先升后降的變化，其中25 μmol/L SNP處理的相對生長量最大(圖2)。因此，選用25 μmol/L SNP作為后續(xù)實驗濃度。

圖1　不同濃度NaHCO3對裸燕麥幼苗相對生長量的影響Fig.1　Effect of different concentration of NaHCO3 on relative dry weight of naked oat seedlings

圖2　不同濃度SNP對75 mmol/L NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗相對生長量的影響Fig.2　Effect of different concentrations of SNP on relative dry weight of naked oat seedlings under 75 mmol/L NaHCO3 stress

2.2　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片O2·-、H2O2和MDA含量的影響

O2·-和H2O2是膜脂過氧化2種重要的ROS，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物。從圖3可見，與CK相比，NaHCO3脅迫顯著提高了裸燕麥幼苗葉片O2·-、H2O2和MDA含量；NaHCO3+SNP處理與單獨NaHCO3處理相比，O2·-、H2O2和MDA含量分別下降了41.5%，19.3%和34.3%，差異顯著；單獨SNP處理的O2·-、H2O2和MDA含量與CK無顯著差異。表明NO能夠緩解堿脅迫下ROS積累誘導的膜脂過氧化傷害。

圖3　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片O2·-、H2O2和MDA含量的影響Fig.3　Effects of SNP on contents of O2·-, H2O2 and MDA in naked oat seedlings under NaHCO3 stress

2.3　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片活性氧清除系統(tǒng)的影響

由SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶及AsA、GSH等抗氧化物質(zhì)組成的ROS清除系統(tǒng)對膜脂氧化損傷具有保護作用。由表1可見，與CK相比，NaHCO3脅迫顯著降低了裸燕麥幼苗葉片SOD和CAT活性，提高了APX活性及GSH含量，而POD活性和AsA含量無顯著差異；NaHCO3+SNP處理的SOD、CAT、POD和APX活性及GSH含量顯著高于單獨NaHCO3處理，分別提高了22.8%，41.8%，162.3%，19.4%和68.7%。而AsA含量卻沒有明顯變化。單獨SNP處理的SOD、APX活性較CK提高了17.4%和22.2%，而CAT、POD活性及AsA、GSH含量與CK無顯著差異。

表1　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片SOD、CAT、POD 和APX活性及AsA、GSH含量的影響

同列不同字母表示5%水平差異顯著，下同。Different letters within the same column mean significant difference at 5% level. The same below.

2.4　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透溶質(zhì)含量的影響

從表2可見，與CK相比，單獨NaHCO3處理下裸燕麥幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸含量分別下降53.1%，31.0%和43.0%，而有機酸和脯氨酸含量則分別升高25.1%和276.8%；NaHCO3+SNP處理與單獨NaHCO3處理相比，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸和游離氨基酸含量分別提高42.2%，66.1%，24.5%和28.7%，有機酸含量則下降59.9%。單獨SNP處理與CK相比，可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量顯著提高，可溶性糖和游離氨基酸含量明顯降低，而有機酸含量無明顯變化。

2.5　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片Na+、K+含量及質(zhì)膜H+-ATP活性的影響

與CK相比，NaHCO3處理下裸燕麥幼苗葉片Na+含量提高了52.8%， K+含量和K+/Na+及質(zhì)膜H+-ATP活性分別降低了26.6%，52.0%和46.3%(表3)；添加SNP使NaHCO3脅迫下Na+含量提高及K+含量、K+/Na+和質(zhì)膜H+-ATPase活性下降的幅度明顯減小。單獨SNP處理下的Na+、K+含量、K+/Na+和質(zhì)膜H+-ATPase活性與CK無明顯差異。

表2　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透溶質(zhì)含量的影響

表3　SNP對NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片Na+、K+含量及質(zhì)膜H+-ATP活性的影響

3討論

生長受抑是作物對土壤鹽堿化響應的直接表現(xiàn)。本研究表明，75 mmol/L及以上濃度NaHCO3溶液(相當于土壤含0.63%以上堿性鹽)處理顯著抑制裸燕麥幼苗的生長(圖1)，1~200 μmol/L SNP能夠不同程度地緩解75 mmol/L NaHCO3脅迫對裸燕麥幼苗生長的抑制，其中25 μmol/L SNP 的緩解作用最為明顯(圖2)。說明外源NO能夠提高裸燕麥幼苗的耐堿性。0.5 mmol/LSNP能夠產(chǎn)生約2 μmol/L NO[17]。NO能夠緩解堿脅迫下裸燕麥幼苗生長抑制作用的原因：一方面，可能是NO提高了細胞膜的流動性，促進了細胞生長[18]，另一方面，可能與NO參與光合作用過程調(diào)節(jié)，提高光化學活性有關[10]。但外源NO調(diào)節(jié)細胞生理代謝緩解鹽堿脅迫對作物生長抑制的作用是暫時性的，采用化控或遺傳手段提高作物體內(nèi)NO水平，增強作物長期適應鹽堿環(huán)境的能力是需要進一步研究解決的問題。

鹽堿脅迫下，植物首先遭受的是離子毒害和滲透脅迫，進而導致氧化傷害等次生脅迫。細胞質(zhì)膜是受氧化傷害最敏感的部位。植物體內(nèi)存在的酶促和非酶促兩類活性氧清除系統(tǒng)在防御ROS對膜脂的攻擊，維持膜結構和功能的完整性方面具有重要作用[19]。 SOD催化O2·-發(fā)生歧化反應生成H2O2，CAT可直接與H2O2反應來清除H2O2，POD則需在酚類物質(zhì)參與下清除H2O2，APX參與AsA-GSH循環(huán)與AsA反應清除H2O2[20]。本試驗結果表明，75 mmol/L NaHCO3脅迫下，裸燕麥幼苗葉片盡管通過提高APX活性和GSH含量加強ROS的清除，但因SOD和CAT活性的下降(表1)，還是造成了O2·-和H2O2的積累及膜脂過氧化水平的提高(圖3)。外源SNP對 NaHCO3脅迫下SOD、CAT、POD和APX活性及GSH含量明顯的促進作用(表1)，提高了裸燕麥清除ROS的能力，緩解了NaHCO3脅迫誘導的O2·-和H2O2積累對膜脂的氧化傷害(圖3)。表明外源NO可通過調(diào)節(jié)抗氧化防護降低堿脅迫下ROS積累對膜脂的氧化損傷。NO對ROS水平的這種下調(diào)作用一方面可能是NO作為抗氧化劑直接參與了ROS的清除[21]；另一方面NO作為信號分子可能誘導了抗氧化酶編碼基因mRNA的表達間接清除ROS[22]。

由于Na+和K+具有接近的水合半徑，鹽堿脅迫下的植物大量Na+的吸收會限制K+吸收。細胞胞質(zhì)中積累的Na+需跨膜轉運以降低胞質(zhì)傷害[23]，胞質(zhì)中通過累積有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持滲透平衡[24]。質(zhì)膜上結合的H+-ATP酶通過水解ATP為Na+的跨質(zhì)膜轉運提供了驅(qū)動力[25]。有研究表明，NO能提高液泡膜質(zhì)子泵和Na+/H+逆向轉運蛋白活性降低玉米在鹽脅迫下對Na+的吸收[26]；還可激活細胞質(zhì)膜內(nèi)向K+通道活性促進小麥根系對K+的吸收[27]。本研究結果表明，25 μmol/L NO供體SNP能夠降低堿脅迫下裸燕麥植株Na+的含量，提高K+/Na+和質(zhì)膜H+-ATPase活力(表3)。說明外源NO可能通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase活性維持堿脅迫下K+、Na+的平衡。這與Zhao等[28]的研究結果一致。25 μmol/L SNP處理還提高了75 mmol/L NaHCO3脅迫裸燕麥有機滲透溶質(zhì)如可溶性的糖和蛋白質(zhì)及游離氨基酸的含量，降低了有機酸含量(表2)。說明外源NO可促進有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在胞質(zhì)的積累，從而提高裸燕麥的耐堿性，這與劉建新等[10]以黑麥草為材料及谷文英等[9]在菊苣上的研究結果一致。脯氨酸除具有滲透調(diào)節(jié)作用外，還能夠保護亞細胞結構及清除活性氧[29-30]。外源NO供體SNP提高了堿脅迫下裸燕麥的脯氨酸含量，這與外源NO促進黃瓜(Cucumissativus)脯氨酸累積的結果一致[31]。說明NO提高脯氨酸水平是其緩解植物逆境脅迫的重要原因。植物體內(nèi)脯氨酸的合成有谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑2條，而脯氨酸分解的關鍵酶是脯氨酸脫氫酶。楊雙龍和龔明[32]研究指出，NO通過提高鳥氨酸途徑中的鳥氨酸轉氨酶活性促進了脯氨酸的合成，又同時抑制脯氨酸脫氫酶的活性抑制了脯氨酸的降解。NO誘導堿脅迫下脯氨酸積累的機制尚待進一步探討。

4結論

外源SNP不僅能夠提高NaHCO3脅迫下裸燕麥幼苗葉片SOD、CAT、POD和APX活性及GSH含量，降低H2O2、O2·-和MDA含量；還可促進可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸積累，提高K+/Na+，緩解NaHCO3脅迫對植株生長的抑制。表明外源NO能夠通過增強抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力，維持K+、Na+的平衡，提高裸燕麥的耐堿性。

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