王遠(yuǎn)濤　王　鋼　張　坤　劉　念　王永生　王偉剛　周洪瀾　傅耀文

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院泌尿外二科，吉林　長(zhǎng)春　130021)

?

雷公藤多苷納米乳在大鼠腎移植中的免疫抑制作用

王遠(yuǎn)濤王鋼張坤劉念王永生1王偉剛周洪瀾傅耀文

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院泌尿外二科，吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的制作雷公藤提取物新劑型，提高生物利用度，嘗試開(kāi)發(fā)有品質(zhì)的免疫抑制劑。方法利用自制雷公藤多苷納米乳(Nano-TII)，腹腔內(nèi)或口服給藥途徑作用于實(shí)驗(yàn)用大鼠腎移植模型。Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體行大鼠原位腎移植術(shù)。空白對(duì)照組：給予口服安慰劑；對(duì)照組：給予口服環(huán)孢素(CsA)；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：給予常規(guī)的雷公藤提取物片劑(TII)；實(shí)驗(yàn)組：給予新型納米雷公藤提取物膠囊；手術(shù)對(duì)照組：SD大鼠近交系原位腎移植，給予口服安慰劑。檢測(cè)腎移植術(shù)后大鼠尿量、腎功、肝功、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率、移植腎/受體存活率。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠移植腎生存期為(86±12.2)d；生存分析log-rank檢驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為新型納米乳雷公藤藥物組的大鼠生存期顯著長(zhǎng)于傳統(tǒng)雷公藤給藥組(P<0.01)，但與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.124)。藥物毒性大小排序?yàn)椋篢II>Nano-TII>CsA。結(jié)論在大鼠腎移植模型中，移植術(shù)后單獨(dú)應(yīng)用雷公藤多苷納米乳相比傳統(tǒng)TII具有更好的移植物存活率和更小的藥物毒性，此項(xiàng)工作為納米技術(shù)雷公藤新劑型的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕大鼠腎移植模型；雷公藤多苷；納米技術(shù)

1吉林大學(xué)藥學(xué)院

第一作者：王遠(yuǎn)濤(1978-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事器官移植臨床研究。

慢性移植腎腎病(CAN)是由鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(CNI)類藥物引起的，主要病理表現(xiàn)為腎血管玻璃樣變；同時(shí)，此類藥物也能引起移植后高血壓、高血糖、血脂代謝紊亂和致癌基因表達(dá)〔1〕。環(huán)孢素(CsA)作為廣泛應(yīng)用的CNI類傳統(tǒng)免疫抑制劑，其局限性主要表現(xiàn)為藥物相關(guān)性毒副反應(yīng)和急性排斥反應(yīng)〔2～5〕。目前，具有免疫抑制功能的中藥有很多，而雷公藤的功效較為明確，且已被常規(guī)用于一些自身免疫疾病(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的治療中〔6～10〕。在器官移植領(lǐng)域，雷公藤的應(yīng)用并不普遍。常用的雷公藤提取物片劑生物利用度低，而且血藥濃度不穩(wěn)定，且易造成口腔潰瘍、蛋白尿、胃腸道潰瘍等明顯的副作用，也限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在腎移植術(shù)后早期的雷公藤提取物轉(zhuǎn)換仍存在較大風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)新型雷公藤提取物制劑具有合理性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供體為健康6～8周齡Wistar大鼠40只，雌雄不限，體重250～300 g；受體為健康6～8周齡SD大鼠60只(20只SD-SD移植作為手術(shù)對(duì)照組)，雄性，體重300～350 g。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和滅菌水，動(dòng)物飼養(yǎng)間清潔級(jí)別為SPF級(jí)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥物高效液相色譜儀測(cè)定雷公藤多苷在IPM、大豆油、藥用石蠟和橄欖油以及表面活性劑EL-40、RH-40 和Tween-80中的溶解度。根據(jù)納米乳的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，利用序貫設(shè)計(jì)思想，采用滴定法繪制偽三元相圖，制備雷公藤多苷納米乳(Nano-TII)；口服CsA軟膠囊，杭州中美華東制藥有限公司；雷公藤多苷片(TII)，黃石飛云制藥有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將已接受腎移植的SD大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，除手術(shù)對(duì)照組為2只外其余每組均為10只。A組(空白對(duì)照組)：給予口服安慰劑；B組(標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組)：給予口服CsA；C組(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組)：給予常規(guī)的TII；D組(實(shí)驗(yàn)組)：給予新型Nano-TII；E組(手術(shù)對(duì)照組)：SD大鼠近交系原位腎移植，給予口服安慰劑?？诜緩綖楣辔福g(shù)后3 d開(kāi)始。給藥劑量分別為：B組CsA 15 mg·kg-1·d-1；C組：TII 30 mg·kg-1·d-1；D組：10%自制Nano-TII 30 mg·kg-1·d-1；A、E組：安慰劑為生理鹽水。于術(shù)后第1天開(kāi)始給藥至大鼠死亡、24 h收集不到尿液或術(shù)后90 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死(處死組內(nèi)1只作為代表，其余大鼠繼續(xù)觀察移植物生存期)取移植腎病理。

1.4腎移植模型供、受體大鼠均用0.3%戊巴比妥按照1 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，鉗夾雙下肢無(wú)疼痛反射時(shí)認(rèn)為已深度麻醉。均采取腹正中切口入路。

器官獲取：手術(shù)取左腎，先切去左腎包括全長(zhǎng)輸尿管、整個(gè)膀胱，近端腎動(dòng)靜脈需要分別帶有腹主動(dòng)脈瓣和下腔靜脈瓣。4℃高滲灌注液灌注后低溫保存。

受體移植：深度麻醉后，切除雙腎，右腎血管保留并游離遠(yuǎn)端，采用Engelbrecht法，在手術(shù)顯微鏡下用10～0無(wú)損傷帶針縫合線，端端吻合共受體腎動(dòng)脈〔11〕。靜脈吻合略加改進(jìn)，先受體腎靜脈從長(zhǎng)約1.0 cm的硬膜外管(內(nèi)徑約0.15 cm)內(nèi)穿出后翻轉(zhuǎn)套在硬膜外管上，供腎靜脈直接套扎在硬膜外管上即可，無(wú)須縫合。輸尿管與膀胱吻合采用一種改進(jìn)的膀胱瓣片法進(jìn)行〔11〕。所有受體均于移植后當(dāng)天關(guān)腹前，腹腔注射氨芐青霉素50 mg/kg預(yù)防感染。

1.5血尿標(biāo)本檢測(cè)各組動(dòng)物移植后放入代謝籠,每周記錄1次24 h尿量、采1次外周血，采用斷尾采血法。血標(biāo)本用于檢測(cè)血肌酐(Scr)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.6移植腎病理移植用于光鏡觀察的組織采用常規(guī)石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)、染色。應(yīng)用Olympus 顯微鏡、攝像機(jī),100倍視野下觀察、測(cè)量。病理診斷標(biāo)準(zhǔn):①腎小管損傷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞及細(xì)胞間空泡變性、腎小管塌陷(與間質(zhì)纖維化和腎小管膜增厚無(wú)關(guān))及腎小管腫脹;②腎小管間質(zhì)損傷標(biāo)準(zhǔn):單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)細(xì)胞空泡變性、水腫及間質(zhì)纖維化;③腎小動(dòng)脈病變:腎內(nèi)小動(dòng)脈管壁肌性增厚或入球小動(dòng)脈的玻璃樣變及損傷。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本狀態(tài)實(shí)驗(yàn)共納入42只成功移植的SD大鼠作為研究對(duì)象，均在手術(shù)后2 h內(nèi)恢復(fù)正常行為狀態(tài)，并開(kāi)始進(jìn)食、排便，術(shù)后3 d內(nèi)獨(dú)籠飼養(yǎng)，3 d后同實(shí)驗(yàn)組大鼠合籠。A、E組大鼠移植物存活時(shí)間組間差異顯著。E組大鼠移植物生存期最長(zhǎng)(<200 d)；其中A組10只大鼠存活時(shí)間最短(9±2.5)d；其余各組與A組相比均遠(yuǎn)超出其生存期(P<0.05)，其中B組為(124±22.3)d，C組(70±62.6)d，D組(86±12.2)d。

2.2受體SD大鼠移植物功能及藥物毒性作用大鼠移植腎臟功能由24 h尿量和Scr表示，藥物毒性作用以大鼠外周血ALT和AST表示。如圖1所示，E組術(shù)后尿量(20.4±3.1)ml/24 h，B組術(shù)后尿量(18.2±2.8)ml/24 h；兩組尿量標(biāo)準(zhǔn)差較小，尿量浮動(dòng)不大，大鼠尿量基本穩(wěn)定。A組大鼠在1 w左右的時(shí)間相繼進(jìn)入無(wú)尿期，C、D兩組尿量進(jìn)行性下降，在術(shù)后7 w左右C組尿量下降趨勢(shì)明顯超越D組。移植后SD大鼠的Scr均在術(shù)后出現(xiàn)一次突增，大約1 w左右恢復(fù)正常；術(shù)后3～6 w基本維持平穩(wěn)，第7周以后C、D兩組血肌酐開(kāi)始陡增。見(jiàn)圖2。

各組大鼠基線肝功能屬于正常范圍(ALT與AST)。從圖3、圖4中可以看出，C組折線基本處于B組和D組上方，E組肝功能基本維持在正常范圍內(nèi)。B、C、D組大鼠的轉(zhuǎn)氨酶血清濃度基本隨給藥時(shí)間增長(zhǎng)而持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)，以B組增長(zhǎng)趨勢(shì)更為明顯。

圖1　移植后SD大鼠尿量變化

圖2　移植后大鼠Scr變化

圖3　移植后大鼠ALT變化

圖4　移植后大鼠AST變化

圖5　移植后90 d大鼠肝臟HE染色切片(×100)

在SD大鼠接受移植術(shù)后90 d時(shí)，各組選取一只大鼠取肝臟，所有大體肝臟形態(tài)正常,色澤鮮紅,質(zhì)地柔軟。做成HE染色切片，結(jié)果如圖5所示。A組與E組干細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝索排列規(guī)則,肝小葉分界尚可,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰,肝竇及匯管區(qū)均正常,未見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死或纖維化等病理變化，核分裂象普遍。B、C、D組肝索排列輕度紊亂,肝小葉分界尚清楚,肝竇正常,肝細(xì)胞伴有少量水腫和脂肪變樣變，其中C組脂肪樣變相比最明顯，還有少許嗜酸性改變。2.3大鼠移植腎生存期術(shù)后90 d(此期間內(nèi)沒(méi)有意外死亡大鼠)是本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)摸索，人為規(guī)定的獲取移植腎病理的最適時(shí)間。筆者希望觀察腎功能存活時(shí)間能夠維持的確切時(shí)間，因此觀察到本文截稿之日，共221 d。如圖6所示，B、C、D生存曲線都在A組與E組的曲線范圍之間，且與A組進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中術(shù)后90 d存活比例A組為0，B組10只(100%)，C組3只(30%)，D組5只(50%)，E組2只(100%)；術(shù)后>200 d存活比例A組為0，B組3只(30%)，C組2只(20%)，D組3只(305)，E組2只(100%)。D組與B組的生存曲線相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而D組的Kaplan-Meier曲線與C組相比，有顯著性差異。在5組大鼠的生存曲線中，可大致觀察到D組生存曲線處于B組及C組之間。

圖6　SD大鼠移植生存曲線

2.4移植腎病理檢查各組大鼠移植腎獲取時(shí)大體標(biāo)本所見(jiàn)：腎臟體積不同程度小于E組，色澤從紅潤(rùn)到蒼白不一。各組移植腎臟HE切片提示了不同程度的單核細(xì)胞浸潤(rùn)、分裂核細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球硬化、玻璃樣變、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和小動(dòng)脈內(nèi)膜纖維性增厚等急、慢性排異反應(yīng)組織病理學(xué)改變。

3討論

雷公藤多苷提取物在動(dòng)物器官移植模型以及臨床器官移植領(lǐng)域均有應(yīng)用，效果不一而終。雷公藤提取物的免疫抑制作用機(jī)制并不十分清楚，有研究表明它能抑制由抗原和細(xì)胞因子(白介素-2、-4、-15)激發(fā)的T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，抑制輔助性CD4+T細(xì)胞功能，改善CD8+T 細(xì)胞功能，下調(diào)CD4/CD8的比例，還可以抑制B細(xì)胞增殖及產(chǎn)生免疫球蛋白。更重要的是在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，雷公藤提取物與FK結(jié)合蛋白(FKBP)-12結(jié)合，生成的免疫復(fù)合物具有免疫抑制作用。此復(fù)合物對(duì)鈣調(diào)磷酸酶的活性無(wú)影響，但可與哺乳動(dòng)物的雷公藤提取物靶分子(mTOR)結(jié)合，并抑制其活性。此種抑制阻礙了細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞增殖，即抑制細(xì)胞周期中G1期向S期的發(fā)展，從根本上與CNI類發(fā)揮免疫抑制作用的靶點(diǎn)不同。相對(duì)CNI類藥物來(lái)說(shuō)，因其具有低/無(wú)腎毒性的特點(diǎn)而得到移植醫(yī)生的青睞。然而對(duì)于維持移植腎術(shù)后器官免疫狀態(tài)的效果，目前僅見(jiàn)于少量的臨床報(bào)道，缺乏可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究以及臨床研究，尚未有明確的結(jié)論。

由于表示移植術(shù)后免疫維持狀態(tài)的指標(biāo)有很多，個(gè)體及組內(nèi)、組間差異也不可避免會(huì)影響這些檢驗(yàn)指標(biāo)的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。因此筆者希望從大鼠腎移植模型體內(nèi)異體腎臟的存活時(shí)間來(lái)粗略地描述所用藥物的免疫維持效果。所以主要的觀察指標(biāo)是大鼠移植腎存活狀況。本研究結(jié)果說(shuō)明自制Nano-Ⅱ具有免疫抑制作用，能夠在單獨(dú)給藥的情況下維持一段時(shí)間的移植物功能狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能認(rèn)為Nano-TII和CsA單獨(dú)給藥時(shí)兩組大鼠移植腎的生存期來(lái)自不同總體。這表示兩者單獨(dú)用藥，在該實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)揮作用相似。而Nano-TII和Nano-TII相比，自制Nna-Ⅱ在移植大鼠移植物排異反應(yīng)的免疫抑制作用強(qiáng)于傳統(tǒng)片劑。

關(guān)于藥物對(duì)于移植腎功能狀態(tài)的影響方面，筆者分析了尿量和Scr。Scr水平反映腎功能狀態(tài)比尿量更敏感。術(shù)后Scr的突增可以由手術(shù)過(guò)程中移植物的冷、熱缺血時(shí)間所以及受體切除雙側(cè)腎臟至移植腎開(kāi)放灌注的手術(shù)時(shí)間所解釋。在此期間，受體因無(wú)腎期體內(nèi)的代謝累積使內(nèi)生性肌酐積蓄，而異體腎臟的離體時(shí)間則會(huì)引起細(xì)胞水腫延緩腎臟功能恢復(fù)。

然而腎臟病理切片反應(yīng)排斥反應(yīng)情況并不統(tǒng)一。原因可能是3個(gè)月內(nèi)大鼠個(gè)體可能發(fā)生多次急性排斥反應(yīng)，也有可能即產(chǎn)生慢性排斥反應(yīng)。而獲取病理的時(shí)間只有1次，在獲取的時(shí)間點(diǎn)，每只大鼠都有可能處在急性或慢性排異反應(yīng)的不同階段?？梢?jiàn)提示需要進(jìn)一步采取免疫組化染色，以及根據(jù)大鼠一般狀況表現(xiàn)、尿量及Scr的變化獲取即時(shí)病理來(lái)了解移植腎組織學(xué)改變。

本實(shí)驗(yàn)是以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的藥效及藥物毒性試驗(yàn)的初步探索，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法有其缺陷，也并沒(méi)有針對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行相應(yīng)探索。但是，在此類研究并不廣泛的前提下，筆者的工作為納米技術(shù)雷公藤新劑型的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在器官移植領(lǐng)域的臨床問(wèn)題中，預(yù)想通過(guò)轉(zhuǎn)換應(yīng)用新型免疫抑制劑來(lái)維持器官功能并減少傳統(tǒng)CNI類藥物因引起的遠(yuǎn)期移植物功能衰竭的征途還很遙遠(yuǎn)。但是移植術(shù)后單獨(dú)應(yīng)用Nano-TII可獲得相比傳統(tǒng)TII更好的移植物存活率和更小的藥物毒性。

參考文獻(xiàn)4

1Nankive BJ.The natural history of chronic allograft nephropathy〔J〕.N Eng J Med,2003;349(24):2326-33.

2Keown PA,Ulan RA,Wall WJ,etal.Immunological and pharmacological monitoring in the clinical use of cyclosporin A〔J〕.Lancet,1981;1:686.

3Irschik E,Tilg H,Niederwieser D,etal.Cyclosporin blood levels do correlate with clinical complications〔J〕.Lancet,1984;2(8404):692-3.

4Kahan BD,Wideman CA,Reid M,etal.The value of serial serum trough cyclosporine levels in human renal transplantation〔J〕.Transplant Proc,1984;16:1195.

5Klintmalm G,Sawe J,Ringden O,etal.Cyclosporine plasma levels in renal transplant patients:association with renal toxicity and allograft rejection〔J〕.Transplantation,1985;39:132.

6McDonald SP.ESRD in Australia and New Zealand at the end of the millennium:a report from the ANZDATA registry〔J〕.Am J Kidney Dis,2002;40(6):1122-31.

7Qin WZ,Liu CH,Yang SM.Tripterygium wilfordii Hook F in systemic lupus erythematosus〔J〕.Chin Med J,1981;94:827.

8Guan F,Wang DH.Observation of therapeutic effect of Tripterygium wilfordii in psoriasis〔J〕.J Clin Dermat,1981;10:91.

9Yu D.Clinical observation of 144 cases of rheumatoid arthritis treated with glycosides of Tripterygium wilfordii〔J〕.J Trad Clin Med,1983;3:125.

10Engelbrecht G,Kahn D,Duminy F,etal.New rapid technique for renal transplantation in the rat〔J〕.Microsurgery,1992;13:340-4.

11Pietsch A,Nett PC,Sollinger HW,etal.Modified technique of ureteroureterostomy in rat kidney transplantation〔J〕.Microsurgery,2004;24:345-9.

〔2015-09-15修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：傅耀文(1957-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事器官移植臨床研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81470975)；吉林省科技廳項(xiàng)目(20120934)；吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2014Z042，2013Z002)

中圖分類號(hào)〔〕R392.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6680-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.016