張明昊，章金濤

1)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450046　2)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)，E-mail:zhangminghao@139.com

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豫醫(yī)卷毛大鼠Krt71基因cDNA序列的比較生物學(xué)分析*

張明昊1)△，章金濤2)

1)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室 鄭州 4500462)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)，E-mail:zhangminghao@139.com

關(guān)鍵詞卷毛大鼠；Krt71基因；同源性比較

摘要目的：對(duì)豫醫(yī)卷毛大鼠的Krt71基因進(jìn)行比較生物學(xué)分析。方法：采用PCR方法對(duì)豫醫(yī)卷毛大鼠Krt71的cDNA序列進(jìn)行克隆、測(cè)序，并與BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的Krt71 cDNA序列及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。結(jié)果：獲得了豫醫(yī)卷毛大鼠Krt71基因全長(zhǎng)1 573 bp的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：KF303588)。豫醫(yī)卷毛大鼠與BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的同源性分別為99.9%、95.2%、88.5%、87.5%、88.0%、88.1%、88.1%，氨基酸序列的同源性分別為99.9%、98.9%、92.4%、91.2%、91.4%、92.3%、92.1%。結(jié)論：Krt71基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中具有較高的保守性，是一個(gè)具有重要功能的“持家基因”。

AbstractAim: To study the difference of Keratin 71(Krt71) gene and its coding between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of Krt71 gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding Krt71 gene in different species ( rattus norvegicus, mus musculus, bos taurus, ovis aries, felis catus, pongo abelii and homo sapiens) were analyzed. Results: A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 1 573 bp(Accession Number:KF303588).The Krt71 gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus, bos taurus, ovis aries, felis catus, pongo abelii,and homo sapiens was 99.9%,95.2%,88.5%,87.5%,88.0%,88.1% and 88.1%,and those of amino acid sequences was 99.9%,98.9%,92.4%,91.2%,91.4%,92.3% and 92.1%,respectively. Conclusion: A high degree of conservation of Krt71 gene exists among different mammalian taxons, and Krt71 gene is an important housekeeping gene.

角蛋白是在上皮細(xì)胞發(fā)生、分化與成熟的過程中逐漸形成的一種不溶于水的蛋白質(zhì)。它作為外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中[1]。毛發(fā)是由毛囊長(zhǎng)出的纖維化蛋白，其主要成分為角蛋白。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多種角蛋白基因，它們的正確表達(dá)及角蛋白網(wǎng)功能的正常是表皮細(xì)胞穩(wěn)定和正常分化的基礎(chǔ)[2]，而這些基因的突變可造成角蛋白結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而產(chǎn)生毛發(fā)缺陷疾病，如人類念珠形發(fā)和脫發(fā)等。根據(jù)組成的氨基酸不同，角蛋白可以分為酸性角蛋白(Ⅰ型)和中性、堿性角蛋白(Ⅱ型)兩種。在組裝時(shí)，只有Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白以等比例混合組成異二聚體，才能進(jìn)一步形成中間纖維。Ⅱ型角蛋白Krt71基因(Keratin 71 gene，也稱Krt 2-6g或mK6irsl)特異表達(dá)于毛囊內(nèi)根鞘(Inner root sheath, IRS)[3]，該基因的突變會(huì)影響毛發(fā)的正常生長(zhǎng)發(fā)育。豫醫(yī)卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)是一種被毛和胡須均發(fā)生彎曲的基因突變大鼠，經(jīng)遺傳測(cè)交實(shí)驗(yàn)證實(shí)該卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制，呈現(xiàn)半顯性遺傳[4-6]。YCHR現(xiàn)已在突變體的基礎(chǔ)上育成分離近交系，并證明YCHR的卷毛性狀是由Krt71基因cDNA序列的420-422位3個(gè)堿基(CAA)缺失引起的。由此可見，Krt71基因是毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要基因之一，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于了解該基因在生物體生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用，進(jìn)一步揭示毛發(fā)卷曲及波紋狀性狀產(chǎn)生的機(jī)制。作者同時(shí)克隆了YCHR Krt71基因的cDNA序列，并與GenBank上發(fā)布的其他物種的Krt71基因cDNA序列進(jìn)行了同源性比較，旨在進(jìn)一步探討Krt71基因的同源性及其比較生物學(xué)特征。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡YCHR 10只，雌雄各半，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，一級(jí)環(huán)境條件下飼養(yǎng)。

1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、500 mmol/L KCl，MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Marker、6×DNA Loading Dye，SK1261 DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.3DNA的提取處死YCHR后立即取腦組織，用液氮速凍后貯存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取試劑盒提取總DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.4引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的大鼠Krt71基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào)：AAHX01052752)和cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM001276440)，采用DNAStar軟件包的PrimerSelect程序設(shè)計(jì)了8對(duì)重疊引物(表1)，用以擴(kuò)增YCHR Krt71基因cDNA序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

表1　擴(kuò)增Krt71基因cDNA序列所用引物

1.5PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，dH2O 35.5 μL，總體系為50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，56~60 ℃退火35 s，72 ℃延伸50~90 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸8~10 min，4 ℃保存。

1.6測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司雙向測(cè)序。

1.7Krt71基因cDNA序列和氨基酸序列分析將獲得的cDNA序列在GenBank上進(jìn)行BLAST初步比對(duì)分析，然后再根據(jù)序列重疊區(qū)域拼接YCHR Krt71基因cDNA完整序列，并下載BN大鼠(GenBank登錄號(hào)：NM001276440)、小家鼠(GenBank登錄號(hào)：NM019956)、家貓(GenBank登錄號(hào)：NM001195239)、家綿羊(GenBank登錄號(hào)：JX975451)、家牛(GenBank登錄號(hào)：NM001075970)、蘇門答臘猩猩(GenBank登錄號(hào)：NM001131706)和人(GenBank登錄號(hào)：NM033448)的Krt71基因cDNA序列，采用DNAMAN和DNAStar軟件進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1YCHR Krt71基因cDNA的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果均得到明顯特異性的目的條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果在GenBank上經(jīng)BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)結(jié)果為Krt71基因序列。序列拼接顯示YCHR Krt71基因的完整cDNA序列長(zhǎng)1 573 bp(GenBank登錄號(hào)：KF303588)，在420～422處缺失了3個(gè)堿基，比正常SD大鼠的Krt71基因cDNA序列1 575 bp少了3個(gè)堿基。

圖1　YCHR Krt71基因PCR電泳結(jié)果

2.2Krt71基因的比較生物學(xué)分析系統(tǒng)遺傳分析(DNAMAN)結(jié)果見圖2。同源性分析結(jié)果見表2、3。Krt71基因的系統(tǒng)遺傳分析結(jié)果顯示YCHR與BN大鼠處于一個(gè)分支，和小家鼠的親緣關(guān)系較近，家綿羊和家牛、人和蘇門答臘猩猩分別處于另外的獨(dú)立分支。雖然相距較遠(yuǎn)，但也有80%的同源性。

圖2　Krt71基因同源序列的進(jìn)化分析

動(dòng)物編號(hào)123456781100.099.995.288.587.588.088.188.1299.9100.092.877.676.377.278.278.2395.292.8100.077.175.976.778.378.4488.577.677.1100.088.088.485.985.8587.576.375.988.0100.097.284.984.8688.077.276.788.497.2100.085.285.1788.178.278.385.984.985.2100.099.8888.178.278.485.884.885.199.8100.0

1：YCHR； 2：BN大鼠(NM001276440)；3：小家鼠(NM019956)；4：家貓(NM001195239)；5：家綿羊(JX975451)；6：家牛(NM001075970)；7：蘇門答臘猩猩(NM001131706)；8：人(NM033448)。

表3　YCHR與其他物種

1：YCHR； 2：BN大鼠(NP001263369)；3：小家鼠(NP064340)；4：家貓(NP001182168)；5：家綿羊(AFV46425)；6：家牛(NP001069438)；7：蘇門答臘猩猩(NP001125178)；8：人(NP258259)。

3討論

研究毛發(fā)的形成及基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系需要借助自發(fā)的或誘導(dǎo)的多種毛發(fā)缺陷動(dòng)物，在某些情況下，這些研究還能幫助人們揭示脫發(fā)及毛發(fā)異常的原因[7]。角蛋白基因集中存在于鼠類的11號(hào)(Ⅰ型角蛋白基因)和15號(hào)(Ⅱ型角蛋白基因)染色體的遠(yuǎn)端。大鼠Ⅱ型角蛋白Krt71基因編碼產(chǎn)物由524個(gè)氨基酸組成，其中130個(gè)氨基酸組成頭部，310個(gè)氨基酸組成α-螺旋桿，84個(gè)氨基酸組成尾部。Krt71蛋白的α-螺旋桿在Ⅰ型、Ⅱ型角蛋白相互作用組成異二聚體的過程中發(fā)揮了重要的作用[8]。Krt71基因特異表達(dá)于毛囊內(nèi)根鞘，如發(fā)生基因突變將會(huì)直接影響到其編碼蛋白的α-螺旋桿的形成，進(jìn)而影響到毛囊內(nèi)根鞘的形態(tài)，最終導(dǎo)致機(jī)體毛發(fā)卷曲，如CaRin、CaJ、Rcol12和Rcol13等[7-8]，Krt71基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)導(dǎo)致的改變也會(huì)使貓和狗的毛發(fā)卷曲[9-11]。YCHR Krt71基因的cDNA序列為1 573 bp，在420～422處缺失了3個(gè)堿基，這種突變導(dǎo)致Krt71蛋白的第140位天冬酰胺缺失，由于該缺失位于Krt71蛋白的α-螺旋桿內(nèi)，可能是導(dǎo)致卷毛性狀出現(xiàn)的原因。為了深入了解Krt71基因組成的差異，作者克隆了Krt71基因cDNA序列共計(jì)1 573 bp，該基因編碼的蛋白質(zhì)由523個(gè)氨基酸殘基組成。在此基礎(chǔ)上，作者對(duì)包括YCHR在內(nèi)的7個(gè)物種的8條Krt71基因的cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)YCHR Krt71基因同GenBank上發(fā)布的BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的同源性分別為99.9%、95.2%、88.5%、87.5%、88.0%、88.1%、88.1%，氨基酸序列的同源性分別為99.9%、98.9%、92.4%、91.2%、91.4%、92.3%、92.1%，表明該基因在哺乳動(dòng)物中具有高度的保守性，是一個(gè)具有重要功能的“持家基因”。近年來有報(bào)道[12]指出，對(duì)某些高度保守的單分子系統(tǒng)進(jìn)化的分析與研究能夠更為簡(jiǎn)便有效地揭示出某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，亦是研究相應(yīng)物種基因組水平的重要證據(jù)和線索。因此，進(jìn)一步分析Krt71基因及其編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)該基因在人類與各種模式生物之間功能上的異同點(diǎn)，可以把來源于不同模式生物的Krt71基因作為人類Krt71基因的天然突變體，用于進(jìn)一步研究該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

綜上所述，作者克隆并獲得了YCHR Krt71基因cDNA的完整序列，該序列已提交給GenBank，并通過對(duì)不同物種Krt71基因cDNA序列及其編碼產(chǎn)物氨基酸序列的同源性比較，初步了解了Krt71基因在物種進(jìn)化上的同源性和保守性，為今后進(jìn)行Krt71基因的多態(tài)性檢測(cè)及開展Krt71基因與毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育和YCHR某些性狀的相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)性資料。

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*“十二·五”科技重大專項(xiàng)課題資助2014ZX10003002；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目資助122102310053

Comparative biology analysis of Krt71 gene in Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500462)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscurly hair rat; Krt71 gene; homology comparison

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.008

中圖分類號(hào)Q953