石　潔，朱巖昆，鄭丹薇，馬曉光，王少華，李　輝，邢　進#，吳彩霞

1)河南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防控所 鄭州 450016　2)河南省疾病預(yù)防控制中心門診 鄭州 450016

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結(jié)核分枝桿菌mpt59和esxA融合基因編碼蛋白的原核表達及免疫原性觀察*

石潔1)，朱巖昆1)，鄭丹薇1)，馬曉光1)，王少華1)，李輝1)，邢進1)#，吳彩霞2)

1)河南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防控所 鄭州 4500162)河南省疾病預(yù)防控制中心門診 鄭州 450016

關(guān)鍵詞結(jié)核分枝桿菌；mpt59基因；esxA基因；血清學(xué)診斷；原核表達

摘要目的：獲取結(jié)核分枝桿菌mpt59和esxA基因編碼的原核表達融合蛋白，并將該蛋白初步用于結(jié)核患者的快速診斷。方法：PCR擴增含有柔性鏈接肽段的esxA核苷酸序列，并將其連接至原核表達載體pET28a上，再將mpt59連接至pET28a-esxA上。該融合蛋白在大腸桿菌BL21中原核表達后，用鎳珠子進行親和純化。采用垂直電泳和免疫印跡分析重組蛋白，并用于結(jié)核患者的診斷。結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達載體pET28a-esxA-mpt59，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了高水平的表達產(chǎn)物。用該純化蛋白進行ELISA檢測，結(jié)果表明其診斷結(jié)核的靈敏度為97.8%，特異度為100%。結(jié)論：構(gòu)建了含mpt59和esxA融合抗原基因的原核表達載體，并誘導(dǎo)表達了融合蛋白，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌疫苗或診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

AbstractAim: To obtain bacterially expressed prokaryotic protein encoded by mpt59 and esxA from Mycobacterium tuberculosis, and to apply this protein for rapid diagnosis of tuberculosis patients.Methods: The nucleotide sequence of esxA gene containing flexible peptide linker was obtained from Mycobacterium tuberculosis using PCR and was linked to pET28a expression vector.Then mpt59 gene was cloned into the pET28a-esxA.The fusion protein was expressed in E.coil BL21 and purified by Ni-NTA. The purified fusion protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis, and was used for TB diagnosis.Results: The recombinant expression vector pET28a-esxA-mpt59 was successfully constructed. The E.coli BL21 strains with recombinant vector showed high level expressions of fusion protein after IPTG induction. The ELISA assay with purified protein for detecting Mycobacterium tuberculosis antibody showed a sensitivity of 97.8% and a specificity of 100%.Conclusion: The expression of recombinant fusion protein of Mycobacterium tuberculosis mpt59 and esxA lays a basis for further studies on researches such as vaccine or diagnostic reagent.

中國作為全球結(jié)核病高負擔國家之一，結(jié)核病人口數(shù)量位居全球第二[1]?？ń槊缱鳛橐环N活性減弱的牛分枝桿菌，是目前使用最廣泛的疫苗之一，對感染分枝桿菌的動物模型有很強的保護作用。盡管卡介苗抗原能預(yù)防嬰幼兒中的結(jié)核性腦膜炎和播散型結(jié)核，但對成年人的保護效果較差，在熱帶地區(qū)臨床試驗中甚至無保護[2-3]。不同國家卡介苗的保護效果從0%～80%不等[4-5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌早期分泌的靶蛋白ESAT-6是由結(jié)核分枝桿菌合成的有效T細胞抗原，其對應(yīng)的基因esxA位于卡介苗與結(jié)核分枝桿菌的基因差異區(qū)RD-1區(qū)域。結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白中，Ag85復(fù)合物家族成員中Ag85A和Ag85B被認為是人體對抗結(jié)核分枝桿菌時產(chǎn)生T細胞應(yīng)答的主要靶蛋白，因此常被作為免疫應(yīng)答候選蛋白[8]。該研究以結(jié)核分枝桿菌分泌抗原Ag85B和ESAT-6的編碼基因mpt59和esxA為研究對象，構(gòu)建了含有His標簽融合抗原基因的原核表達載體，經(jīng)體外高效表達和純化后，用于疑似結(jié)核病患者的免疫學(xué)檢測，為結(jié)核病的早期診斷和預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料大腸桿菌BL21(DE3)和DH10B，結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv，原核表達載體pET28a均由作者所在的實驗室保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ，膠回收試劑盒，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，其他試劑購自上海生工生物工程有限公司，His純化珠子購自GE公司。

提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA[9]，首先擴增esxA基因，并將其構(gòu)建到含有His標簽的原核表達載體pET28a中，化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B中，菌落PCR驗證挑取陽性克隆。再將構(gòu)建好的中間載體用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連入擴增后的mpt59基因片段，菌落PCR初步挑取陽性克隆，并進行單個基因和融合基因的雙酶切驗證，最后送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序及比對。

1.3融合蛋白的原核表達、純化及鑒定將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進行IPTG誘導(dǎo)表達，分別在30和37 ℃條件下誘導(dǎo)4和6 h，考馬斯亮藍染色觀察目的蛋白的表達情況。最后將最優(yōu)表達條件下獲得的蛋白用His純化珠子進行親和層析和洗脫，用SDS-PAGE電泳和免疫印跡檢測融合蛋白的純化情況[9]。

1.4純化融合蛋白對疑似結(jié)核病患者的免疫原性檢測在新密市疾控中心連續(xù)收集根據(jù)肺部影像學(xué)初步診斷的可疑結(jié)核病患者的痰液和血清以及來自健康體檢者的血清(對照)，最終收集到83份可疑結(jié)核病患者的痰液和血清以及56份健康體檢者的血清。對可疑結(jié)核病患者的痰液進行傳統(tǒng)的痰培養(yǎng)檢測。

以0.75 mg/L純化的融合蛋白包被96孔板，對83份可疑結(jié)核病患者的血清樣本和56份健康人血清按1100稀釋后進行ELISA檢測，同時以碳酸鹽包被緩沖液作為空白對照,結(jié)果見表1。于450 nm處以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，大于規(guī)定的空白對照OD值的2.1倍即為陽性。

2結(jié)果

2.1mpt59和esxA融合基因載體構(gòu)建及菌落PCR結(jié)果驗證將編碼ESAT-6抗原的基因esxA構(gòu)建至含有His標簽的表達載體pET28a上，菌落PCR驗證挑取的克隆均為陽性克隆(圖1)。選取其中測序正確的陽性克隆，用BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切后，加入去掉終止密碼子的mpt59核苷酸序列，進一步通過菌落PCR驗證，結(jié)果見圖2。

圖1　esxA菌落PCR鑒定

圖2　mpt59菌落PCR鑒定

M：DNA Marker；1~2、4~7：mpt59基因陽性克隆PCR產(chǎn)物；3：mpt59基因陰性克隆PCR產(chǎn)物。

2.2融合基因載體的雙酶切鑒定融合基因載體經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后，切出大約300 bp的esxA基因，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，切出mpt59目的片段(圖3)。同時用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，可切出大約1 200 bp的融合基因條帶(圖4)，進一步表明成功構(gòu)建了融合基因載體。

圖3　單個基因雙酶切鑒定結(jié)果

M：DNA Marker；1：融合基因載體經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的結(jié)果；2：融合基因載體經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后的結(jié)果。

圖4　重組質(zhì)粒pET28a-mpt59-esxA融合基因的酶切鑒定

M：DNA Marker；1：融合基因載體經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后的結(jié)果。

2.3融合蛋白表達條件的優(yōu)化在終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，當誘導(dǎo)溫度為30 ℃時，融合蛋白表達不明顯，而當溫度提高至37 ℃時，與對照組相比，在相對分子質(zhì)量40 000處有一明顯的優(yōu)勢表達條帶，并且誘導(dǎo)4和6 h目的蛋白的表達量無明顯差別(圖5)。

圖5　融合基因在大腸桿菌BL21中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳鑒定

M：蛋白Marker；1：轉(zhuǎn)化空載體的BL21未表達蛋白條帶；2、3：轉(zhuǎn)化表達載體的BL21在IPTG、37 ℃的條件下誘導(dǎo)4和6 h時的蛋白條帶；4、5：轉(zhuǎn)化表達載體的BL21在IPTG、30 ℃的條件下誘導(dǎo)4和6 h時的蛋白條帶。

重組蛋白用His純化珠子純化洗脫后，分別進行考馬斯亮藍染色和免疫印跡分析，結(jié)果見圖6?？捡R斯亮藍染色結(jié)果顯示融合蛋白經(jīng)表達純化后，在40 000處有一明顯亮帶，并且條帶單一(圖6A)；免疫印跡結(jié)果表明與圖6A相應(yīng)蛋白相對分子質(zhì)量處有明顯反應(yīng)條帶的出現(xiàn)(圖6B)。

圖6　融合蛋白的考馬斯亮藍染色(A)及免疫印跡檢測(B)結(jié)果

2.4純化融合蛋白的免疫原性檢測結(jié)果見表1。His-Ag85B-ESAT-6融合蛋白對所檢測樣本的靈敏度為97.8%，特異度為100%。

表1　ELISA方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法比較　例

3討論

肺結(jié)核作為一種危害全球人類健康的疾病，每年有100萬的新發(fā)病例，17萬人因此而死亡；可通過開發(fā)有效的結(jié)核病疫苗、改進的診斷試劑以及新型的短程化療方案實現(xiàn)全球?qū)Y(jié)核病的控制目標[10]。

目前最常用的診斷方法是對痰液中的抗酸桿菌進行顯微鏡觀察即痰涂片，但該方法靈敏度低，只有30%左右[11]。盡管痰培養(yǎng)比痰涂片相對靈敏，但是該方法的結(jié)果判斷需要花費4~8周的時間，并且對實驗條件要求較高，有些結(jié)核病高負擔地區(qū)的實驗室很難達到。因此急需開發(fā)快速敏感的實驗室診斷方法。

由于免疫學(xué)診斷具有快速簡單的特點，近年來越來越多的研究致力于開發(fā)新型的免疫學(xué)診斷產(chǎn)品用于結(jié)核病的檢測。而檢測結(jié)核分枝桿菌抗原及針對這些抗原產(chǎn)生的抗體的研究受到越來越多的重視，因為其能鑒定潛伏感染的肺結(jié)核患者。大量結(jié)核分枝桿菌抗原，包括天然抗原、半合成抗原、重組抗原都被有效用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷[12-13]。結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白中，Ag85復(fù)合物家族成員(Ag85A、B、C)作為快速生長結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白，含量占所有分泌蛋白的30%，被認為是最具潛力的疫苗候選物。其中Ag85B作為一種DNA疫苗，對結(jié)核分枝桿菌小鼠感染模型產(chǎn)生了部分性保護作用[14]。結(jié)核分枝桿菌早期分泌的靶蛋白ESAT-6是由結(jié)核分枝桿菌合成的有效的T細胞抗原，其對應(yīng)的基因為esxA。

目前市面上膠體金產(chǎn)品對結(jié)核病患者檢測的靈敏度只有60%~70%[15-16]。為進一步提高抗原檢測的靈敏度和特異度，作者在前期工作[17]的基礎(chǔ)上，在mpt59原核表達載體上進一步融合了esxA基因，并在體外進行重組表達條件的優(yōu)化；在優(yōu)化條件下對融合抗原進行高效表達，用His純化珠子親和層析；最終通過電泳和免疫印跡檢測最終蛋白產(chǎn)物，結(jié)果表明其為單一蛋白條帶。用該純化蛋白對83例可疑結(jié)核病患者及56例健康人的血清進行ELISA診斷，結(jié)果顯示該融合蛋白對所檢測樣本的靈敏度為97.8%，特異度為100%，初步證明該蛋白可用于結(jié)核病患者的快速診斷，并為進一步研究二者的免疫原性奠定了基礎(chǔ)。同時，作者在前期工作的基礎(chǔ)上增加了樣本量，從而提高了結(jié)論的適用性。在后續(xù)研究中將進一步增加樣本量及以將該融合抗原結(jié)合其他結(jié)核抗菌抗原對患者的免疫原性進行深入的研究。

參考文獻

[1]范夢柏，智慧萍，張亮.耐多藥肺結(jié)核病胸科手術(shù)治療的依從性調(diào)查[J].中華醫(yī)院管理雜志，2010,26(10)：768

[2]吳昊，王浩，于繼云.結(jié)核疫苗研究進展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2012,32(10):1003

[3]Andersen P,Doherty TM.The success and failure of BCG- implications for a novel tuberculosis vaccine[J].Nat Rev Microbiol,2005,3(8):656

[4]Nuttall JJ,Davies MA,Hussey GD,et al.Bacillus Calmette-Guérin(BCG) vaccine-induced complications in children treated with highly active antiretroviral therapy[J].Int J Infect Dis,2008,12(6):e99

[5]Bolger T,O'connell M,Menon A,et al.Complications associated with the bacille Calmette-Guérin vaccination in Ireland[J].Arch Dis Child,2006,91(7):594

[6]Daugelat S,Kowall J,Mattow J,et al.The RD1 proteins of Mycobacterium tuberculosis: expression in Mycobacterium smegmatis and biochemical characterization[J].Microbes Infect,2003,5(12):1082

[7]王雪梅,王英,薛玉芹,等.結(jié)核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的構(gòu)建、鑒定及免疫效應(yīng)評價[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(7):945

[8]Kaufmann SH,Hussey G,Lambert PH.New vaccines for tuberculosis[J].Lancet,2010,375(9731):2110

[9]李輝,石潔,馬曉光,等.結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥相關(guān)蛋白的原核表達及純化[J].中國病原生物學(xué)雜志,2012(9):665

[10]WTO.Multidrug and extensively drug-resistant TB(M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response[M].Geneva:WHO Press,2010.

[11]Davies PD,Pai M.The diagnosis and misdiagnosis of tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis,2008,12(11):1226

[12]Ahsan MJ,Ansari MY,Yasmin S,et al.Tuberculosis: current treatment, diagnostics, and newer antitubercular agents in clinical trials[J].Infect Disord Drug Targets,2015,15(1):32

[13]Baumann R,Kaempfer S,Chegou NN,et al.Serologic diagnosis of tuberculosis by combining Ig classes against selected mycobacterial targets[J].J Infect,2014,69(6):581

[14]Teixeira FM,Teixeira HC,Ferreira AP,et al.DNA vaccine using Mycobacterium bovis Ag85B antigen induces partial protection against experimental infection in BALB/c mice[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(8):930

[15]劉俊峰,蘇丹，馮素花，等.3種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的評價[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(10):1055

[16]邱忠平，吳麗娟.膠體金試紙條快速檢測結(jié)核抗體的臨床意義探討[J].國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2004,25(3):209

[17]石潔,朱巖昆,馬曉光,等.結(jié)核分枝桿菌重組fbpB編碼蛋白的原核表達[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2014,49(5):741

*國家自然科學(xué)基金項目81173127,81171060；河南省杰出青年基金項目074100510020；河南省教育廳基礎(chǔ)研究項目13A310663；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目142300410206

Prokaryotic expression and immunogenicity analysis of mpt59 and esxA fusion gene from Mycobacterium tuberculosis

SHIJie1),ZHUYankun1),ZHENGDanwei1),MAXiaoguang1),WANGShaohua1),LIHui1),XINGJin1),WUCaixia2)

1)HenanResearchInstitutionforTuberculosisControl，HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou4500162)TheOutpatientDepartment，HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

Key wordsMycobacterium tuberculosis; mpt59 gene; esxA gene; serological diagnosis; prokaryotic expression

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.009

中圖分類號R446.6

通信作者#，1966年6月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：結(jié)核病防控，E-mail:hncdcxj@163.com