劉成霞，申曉青，徐平平#

1)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院(廣東省口腔醫(yī)院) 廣州 510280　2)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院口腔科 廣州 510280

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不同粒徑羥基磷灰石對人工早期齲再礦化作用的研究*

劉成霞1)，申曉青2)，徐平平1)#

1)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院(廣東省口腔醫(yī)院) 廣州 5102802)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院口腔科 廣州 510280

關(guān)鍵詞早期釉質(zhì)齲；羥基磷灰石；再礦化

摘要目的：研究不同粒徑羥基磷灰石(HA)對人工早期齲的再礦化作用。方法：應(yīng)用離體人恒前磨牙制備早期釉質(zhì)齲標(biāo)本50個，隨機(jī)分為5組(n=10)：陽性對照組(NaF溶液)、陰性對照組(去離子水)、30 nm HA組、60 nm HA組和12 μm HA組，用顯微硬度計檢測標(biāo)本脫礦前后表面顯微硬度，并用掃描電鏡觀察各組樣本脫礦前后的形態(tài)；按照分組進(jìn)行早期齲體外循環(huán)實驗12 d，同法測定體外循環(huán)后各組樣本的表面顯微硬度，并觀察其形態(tài)。結(jié)果：與陰性對照組相比，各HA組均能提高標(biāo)本的表面顯微硬度，且隨著粒徑的減小，其表面顯微硬度增大(F=86.272,P<0.001)。掃描電鏡下觀察，30 nm HA組和60 nm HA組的脫礦區(qū)有針狀或短棒狀晶體顆粒沉積，表面變得均勻、平整，且以30 nm HA組的再礦化效果更佳，12 μm HA組的再礦化效果不明顯。結(jié)論：HA能有效促進(jìn)早期釉質(zhì)齲的再礦化；納米級HA優(yōu)于微米級HA，且隨著粒徑的減小，其再礦化效果更佳。

AbstractAim: To explore the effect of various particle size hydroxyapatite(HA) on remineralization of artificial initial enamel caries.Methods: Fifty human premolars were prepared for artificial enamel caries specimens, and these specimens were randomly allocated into 5 groups(n=10): positive control group(NaF solution), negative control group(deionized water), 30 nm HA group, 60 nm HA group and 12 μm HA group.Before and after demineralization, the surface microhardness of the specimens was measured by microhardness tester and the morphologies of the specimens were observed by scanning electron microscope. Then after the experiment of 12 d cycling in vitro, the surface microhardness of each group′s specimens was measured and the morphologies were observed again.Results: Compared with negative control group, all the 3 HA groups could significantly improve the surface microhardness of initial enamel caries,and the effects were better with the decrease of particle size(F=86.272,P<0.001). Under the scanning electron microscope, crystalline particles with acicular or short bar deposited and the surface became uniformly smooth in the demineralization area of 30 nm HA group and 60 nm HA group especially for the 30 nm HA group, and the effect of 12 μm HA group on remineralization were unobvious.Conclusion: HA can effectively promote the remineralization of initial enamel caries. Nano HA is superior to micron HA, and with the decrease of particle size, the effect of remineralization can be better.

齲病是口腔最常見的疾病，其患病率隨年齡增長呈上升的趨勢，嚴(yán)重影響人類的口腔乃至全身健康。食物來源的碳水化合物產(chǎn)酸，使牙體硬組織脫礦，導(dǎo)致齲損發(fā)生。齲病的發(fā)生是脫礦與再礦化不斷交替變化的過程。因此，可以通過再礦化的方法促進(jìn)齲損的自然修復(fù)使其愈合。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)在牙釉質(zhì)中的含量高達(dá)96%，具有良好的生物相容性和生物活性，已成為近年來生物材料研究的熱點之一[1-4]。研究[5]表明HA具有再礦化作用。隨著納米材料研究的深入，對HA 的研究也進(jìn)入了探索納米HA(nano HA, n-HA)的新階段。隨著n-HA粒徑的不斷減小，比表面不斷增大，生物活性增高，是否粒徑越小其再礦化效果越佳？作者擬通過早期齲體外循環(huán)模型[6]研究不同粒徑HA對早期釉質(zhì)齲的再礦化作用。

1材料與方法

1.1釉質(zhì)塊標(biāo)本的制備收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診因正畸治療新鮮拔除的16~26歲健康人的恒前磨牙，清理干凈后 4 ℃下保存于飽和麝香草酚溶液中。所有牙齒在肉眼及顯微鏡下觀察無齲壞、無白堊斑、無裂紋或其他缺損。使用金剛砂車針在冷水冷卻下將牙冠切割制成釉質(zhì)塊。用顯微硬度計(Knoop壓頭,10 g,15 s) 在每個釉質(zhì)塊表面中央垂直測量5個點，并計算其平均值，即基線表面顯微硬度(surface microhardness,SMH)選擇表面顯微硬度值為305~355 KHN的釉質(zhì)塊，并在其表面中心開窗(4 mm×4 mm)，其余部位先涂布2層抗酸指甲油后以自凝樹脂包埋[7-9]。該研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2早期釉質(zhì)齲模型的建立將上述釉質(zhì)塊標(biāo)本放入體積分?jǐn)?shù)10%的檸檬酸溶液中酸蝕120 s，去除檸檬酸溶液，建立早期釉質(zhì)齲模型。同法測量并計算脫礦后的表面顯微硬度(SMH1)，選擇50個硬度值在155~185 KHN的釉質(zhì)塊進(jìn)行以下觀察。

1.3實驗分組和處理HA由北京高德威金屬科技開發(fā)有限責(zé)任公司提供。HA實驗組溶液的配制方法：準(zhǔn)確稱取粒徑分別30 nm、60 nm、12 μm的HA各0.30 g分別置于燒杯中，取100 mL雙蒸水加入燒杯中，超聲振蕩3次，每次30 s，以形成均勻的懸濁液，然后放置磁力攪拌器攪拌均勻。脫礦溶液(pH=4.5)含50 mmol/L醋酸、2.2 mmol/L Ca(NO3)2、2.2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L NaN3；人工唾液(pH=7.0)含130 mmol/L KCl、20 mmol/L HEPES、1.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L NaN3、0.9 mmol/L KH2PO4[10]。將上述50個標(biāo)本隨機(jī)分為5組(10個/組)。陽性對照組給予1 g/L NaF溶液，陰性對照組給予去離子水，30 nm HA組、60 nm HA組和12 μm HA組分別給予相應(yīng)的HA實驗組溶液。

再礦化實驗：采用體外循環(huán)流程，在37 ℃恒溫水浴箱中持續(xù)處理12 d。每天的體外循環(huán)包括：在相應(yīng)溶液中浸泡處理4次(上午8時和9時，下午3時和4時)，每次3 min，之后用去離子水沖洗5 s；上午11時至下午1時在脫礦液中浸泡2 h，其余時間浸泡在人工唾液中。所用試劑均為每天新鮮配制。

1.4掃描電鏡觀察及顯微硬度檢測采用Quanta 400 FEG場發(fā)射掃描電鏡(荷蘭飛利浦FEI公司)，在制備釉質(zhì)塊后(脫礦前)和脫礦后進(jìn)行掃描電鏡觀察；在體外循環(huán)后從各組中隨機(jī)抽取5個標(biāo)本，用于再礦化后的掃描電鏡觀察：將標(biāo)本按觀察窗口面向上的方向固定在載物臺上，粘臺，表面噴金，真空下干燥，在掃描電鏡下觀察(每個標(biāo)本隨機(jī)觀察3個不同區(qū)域)，拍攝電鏡圖像并存儲。

各組另外5個標(biāo)本用于顯微硬度測量，同法使用顯微硬度儀在各釉質(zhì)塊窗口基線測量點的另一側(cè)平行測量5個點，計算其平均硬度值，即再礦化后的表面顯微硬度(SMH2)。計算每組表面顯微硬度恢復(fù)的百分比(%SMHR)。%SMHR=(SMH2-SMH1)/(SMH-SMH1)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用配對t檢驗來比較體外循環(huán)前后各組的表面顯微硬度值(SMH1和SMH2)，應(yīng)用單因素方差分析比較各組%SMHR，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1釉質(zhì)塊表面顯微硬度的檢測結(jié)果見表1。

表1　各組牙釉質(zhì)表面顯微硬度分析　KNH

*：F=86.272，P<0.001；△：5組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2掃描電鏡下正常釉質(zhì)和脫礦釉質(zhì)的表面形貌

低倍鏡下可見正常釉質(zhì)表面光滑平坦(圖1A)，高倍鏡下可見排列整齊的釉柱面 (圖1B)。脫礦后正常光滑的釉質(zhì)表面變得粗糙，布滿孔狀結(jié)構(gòu)，原來排列緊密的釉柱變得疏松(圖1C)。

圖1　正常釉質(zhì)和脫礦釉質(zhì)的掃描電鏡圖像

A、B:分別是正常釉質(zhì)在10 000和100 000倍鏡下；C：脫礦釉質(zhì)在60 000倍鏡下。

圖2　各組再礦化后的掃描電鏡圖像

2.3掃描電鏡下的再礦化效果見圖2。由圖2可見，陽性對照組礦化后的表面變得較為平整，有許多圓形間或長條狀的顆粒沉積。30 nm HA組和60 nm HA組礦化后的釉質(zhì)表面變得規(guī)則、均勻；在脫礦面上可見均勻密集的針狀或短棒狀的晶體顆粒沉積，與正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)鑲嵌緊密；30 nm HA 組不見脫礦孔孔隙，60 nm HA組可見極少數(shù)脫礦孔孔隙。12 μm HA組釉質(zhì)表面可見大顆粒懸浮于表面；高倍鏡下其外觀與陰性對照組相似，且因晶體粒度大，不能進(jìn)入脫礦釉質(zhì)深層，可見部分脫礦孔孔隙。A、B、C、D、E：分別為陽性對照組、30 nm HA組、60 nm HA組、12 μm HA組和陰性對照組；1、2：分別為10 000倍鏡下和60 000倍鏡下。

3討論

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)也變得越來越多樣化，由此帶來的牙齒健康問題也愈加突出。據(jù)第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查[11]報告，我國35~44歲人群患齲率為88.1%，65~74歲人群患齲率高達(dá)98.4%。因此，預(yù)防齲病對提高廣大人民群眾的口腔衛(wèi)生水平非常重要。

長期以來，人們認(rèn)為齲病是一個以脫礦為主的病變，其發(fā)生發(fā)展的過程不可逆，牙齒內(nèi)的礦物質(zhì)永久性丟失，最終形成了齲洞。而現(xiàn)代齲病學(xué)理論認(rèn)為：齲病的發(fā)生是一個脫礦與再礦化不斷交替變化的過程。再礦化是溶液中的鈣磷等離子重新沉積到部分溶解的晶體表面并誘導(dǎo)其重新增長的過程，它不但可以維持牙釉質(zhì)內(nèi)礦物質(zhì)丟失與獲得之間的動態(tài)平衡，而且還能促進(jìn)齲損的自然修復(fù)[12]。

目前納米材料的研制是一個熱門方向。納米材料是指顆粒尺寸為1~100 nm的粒子組成的新型材料[5]。n-HA是顆粒尺寸在1~100 nm的HA，相比普通的HA，n-HA由于粒徑小，比表面積大及具有量子尺寸效應(yīng)，故在抗齲、美白和脫敏等各方面均表現(xiàn)出優(yōu)于普通HA的效應(yīng)，因此也被稱為活性HA。并且隨著n-HA粒徑的不斷減小，比表面的不斷增大，表面原子數(shù)增多、表面原子配位不飽和性升高，從而產(chǎn)生了大量的懸鍵和不飽和鍵等，使其具有更高的表面能、高靜電場等特性，以及更高的化學(xué)活性和良好的生物活性[13]。

牙釉質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是釉柱。釉柱是由粒徑為40~60 nm針狀或柱狀的HA晶體構(gòu)成，屬于n-HA。n-HA與牙釉質(zhì)中HA的化學(xué)成分和微晶結(jié)構(gòu)極為相似，所以n-HA可以直接和牙體硬組織中的HA發(fā)生融合，修復(fù)牙齒表面裂痕[14-15]。HA再礦化的可能作用機(jī)制：首先，由于HA具有微弱的溶解性和堿性，為牙釉質(zhì)脫礦區(qū)提供了鈣、磷及羥基，可以有效補充無機(jī)鹽的丟失，增加了鈣離子的遷移機(jī)會，推動平衡向再礦化方向發(fā)展，利于齲損的修復(fù)；其次，脫礦區(qū)表面有活性基團(tuán)，HA通過與其發(fā)生化學(xué)結(jié)合反應(yīng)來修復(fù)齲損；再次，該研究采用的HA晶粒直徑較小，尤其是30 nm HA，接近甚至小于釉質(zhì)表層磷灰石晶粒直徑，且在齲病的發(fā)生過程中，釉質(zhì)因脫礦而導(dǎo)致間隙擴(kuò)大，產(chǎn)生微孔，這使得n-HA有可能進(jìn)入表層下脫礦區(qū)，通過機(jī)械沉積作用封閉脫礦層而預(yù)防齲病和修復(fù)早期齲。

該研究結(jié)果顯示，各HA組離體牙釉質(zhì)脫礦后顯微硬度值明顯減小，經(jīng)過早期齲體外循環(huán)后，顯微硬度值得到明顯提升，說明HA有明顯的再礦化作用，且n-HA明顯優(yōu)于微米級HA。該結(jié)果驗證了前期關(guān)于含60 nm HA牙膏組促進(jìn)釉質(zhì)齲再礦化優(yōu)于12 μm HA牙膏組的研究結(jié)論[16]。該研究結(jié)果還顯示，隨著粒徑的減小，HA組再礦化能力也不斷增強，%SMHR最高的是30 nm HA組，達(dá)64.3%。

此外，掃描電鏡觀察結(jié)果也進(jìn)一步證實HA有促進(jìn)早期齲的再礦化的作用，其結(jié)果與表面顯微硬度測量結(jié)果一致。30 nm HA組和60 nm HA組標(biāo)本脫礦面上可見針狀或短棒狀的晶體顆粒沉積封閉，與正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)鑲嵌緊密，以30 nm HA 組的再礦化效果最好；12 μm HA組再礦化作用不明顯。

綜上所述，HA可提高脫礦釉質(zhì)的表面顯微硬度，促進(jìn)牙齒再礦化，且隨著粒徑的減小，其再礦化效果也越來越好。n-HA在早期齲的防治領(lǐng)域具有較大的臨床應(yīng)用前景。

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Effect of various particle size hydroxyapatite on remineralization of artificial initial enamel caries

LIUChengxia1),SHENXiaoqing2),XUPingping1)

1)TheAffiliatedStomatologicalHospitalofSouthernMedicalUniversity(GuangdongProvincialStomatologicalHospital),Guangzhou5102802)DepartmentofStomatology,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280

Key wordsinitial enamel caries;hydroxyapatite;remineralization

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.031

中圖分類號R781.1

通信作者#，男，1971年7月生，博士，教授，研究方向：口腔生物材料，E-mail:gdskqyykjk@163.com