于超男，王　穎#，燕樹(shù)勛，楊國(guó)杰，張彥周，楊曉村，李　淵，孫麗娜

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052　2)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450008　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

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睪酮受體蛋白表達(dá)水平對(duì)高血壓大鼠血管重構(gòu)的影響*

于超男1)，王穎1)#，燕樹(shù)勛2)，楊國(guó)杰1)，張彥周3)，楊曉村1)，李淵1)，孫麗娜1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 4500522)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 4500083)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞高血壓；睪酮受體；血管重構(gòu)；絲裂原活化蛋白激酶；磷酸酶

摘要目的：探討睪酮受體(AR)蛋白表達(dá)水平的改變對(duì)高血壓大鼠血管重構(gòu)(VR)的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法：將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、高血壓組3組(每組10只)。采用“兩腎一夾”法制備腎血管性高血壓大鼠模型。HE染色觀察主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組化法檢測(cè)3組大鼠主動(dòng)脈組織中AR、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，假手術(shù)組主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，AR、MKP-1蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P>0.05)；與對(duì)照組及假手術(shù)組相比，AR和MKP-1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.001)；且在高血壓組AR與MKP-1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.657，P=0.039)，在對(duì)照組及假手術(shù)組無(wú)關(guān)(r=0.589和0.436，P>0.05)。結(jié)論：高血壓VR過(guò)程中存在AR及MKP-1蛋白表達(dá)水平的改變。

AbstractAim: To explore the effect of the change of androgen receptor(AR) protein expression level on hypertensive vascular remodeling and the underlying mechanisms.Methods:Thirty rats were randomly allocated into 3 groups：control group, sham operation group and hypertensive group(10 rats in each group). The renovascular hypertensive rats model was established using the "2-kidney and 1-clip" method. Using tail-cuff method to measure the systolic blood pressure(pSB) and HE staining to observe the morphological structure of aorta, and the expressions of AR and MKP-1 were detected by immunohistochemical technique. Results: For the morphological structure, there was no significant difference between the control group and the sham operation group, and also no significant difference in the expressions of AR and MKP-1 was found between the two groups(P>0.05). Compared with the control group and the sham operation group，the vascular remodeling of the aorta in the hypertensive group was remarkable, and the expressions of AR and MKP-1 significantly decreased(P<0.001). In the hypertensive group, the expression of AR was positively correlated with the expression of MKP-1(r=0.657,P=0.039), and no such correlation was found in the control group or in the sham operation group(r=0.589，0.436，P>0.05). Conclusion: The vascular remodeling during hypertension is accompanied by the down-regulation of AR and MKP-1.

高血壓血管重構(gòu)(vascular remodeling，VR)是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)[1]，對(duì)其機(jī)制的研究是高血壓研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)的研究[2-3]結(jié)果顯示睪酮與高血壓VR的發(fā)生關(guān)系密切。睪酮是人體內(nèi)重要的性激素之一，它的生物學(xué)活性主要是通過(guò)雄激素受體(androgen receptor，AR)實(shí)現(xiàn)的。已證實(shí)[4-6]睪酮與AR結(jié)合，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路參與心肌肥大、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生。但其在高血壓VR過(guò)程中的地位、作用及機(jī)制尚不清楚。為此，該研究以腎血管性高血壓大鼠為研究對(duì)象，以AR為研究靶點(diǎn)，以MAPK的下游調(diào)節(jié)激酶——絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)為視點(diǎn)，探討AR在高血壓VR中的作用、地位及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為臨床高血壓VR的預(yù)防及治療提供新的線(xiàn)索和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器4周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體重(75±5) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):0008508)。兔抗AR和MKP-1多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，抗兔IgG免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。其余產(chǎn)品均為市售分析純。大鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓儀(日本Softron公司，BP-98A型)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)LEICA，CM 1900型)，烤片機(jī)(德國(guó)LEICA，HI 1220型)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)。

1.2動(dòng)物分組與模型的建立大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、高血壓組3組 (n=10)。采用“兩腎一夾”法制備腎血管性高血壓大鼠模型:水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒，打開(kāi)腹腔，分離左側(cè)腎動(dòng)脈，內(nèi)徑0.2 mm的“U”型銀夾鉗夾左腎動(dòng)脈，制作左腎動(dòng)脈狹窄模型，腹腔注射青霉素鈉，縫合。假手術(shù)組除不放置銀夾外，其余操作步驟同上。所有大鼠均用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度18～23 ℃，濕度50%～60%，人工晝夜(12 h/12 h)循環(huán)。術(shù)后每周測(cè)量血壓1次，連續(xù)觀察3周，以術(shù)后尾動(dòng)脈收縮壓(pSB)升高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)(或>正常血壓3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)以上且同時(shí)>140 mmHg者為造模成功。

1.3血壓測(cè)定和主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察①血壓測(cè)定：在造模前、造模后第1、2、3及8周末，采用Tail-Cuff法測(cè)量各組大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈pSB，每只測(cè)3次，取平均值。②取材和形態(tài)學(xué)觀察：造模后第8周末，大鼠稱(chēng)重，經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉，開(kāi)胸獲取胸主動(dòng)脈，洗滌，40 g/L多聚甲醛溶液固定。石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并攝片，圖像分析系統(tǒng)分析VR的指標(biāo)，包括中層壁厚(MT)、管腔內(nèi)徑(LD)、中層壁厚/管腔內(nèi)徑(MT/LD)；選取3個(gè)視野，取平均值。

1.43組大鼠胸主動(dòng)脈組織中AR和MKP-1蛋白表達(dá)的免疫組化測(cè)定石蠟包埋組織切片、脫蠟，沖洗；體積分?jǐn)?shù)3%H2O2封閉，PBS漂洗；熱修復(fù)抗原；正常山羊血清封閉，去液；滴加一抗(均按1100稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；室溫復(fù)溫，PBS漂洗；滴加抗兔IgG二抗室溫放置30 min，PBS漂洗；DAB顯色，沖洗，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察并攝片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白表達(dá)的平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠尾動(dòng)脈pSB的差異，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組VR指標(biāo)、大鼠主動(dòng)脈組織中AR及MPK-1蛋白表達(dá)水平的差異，兩因素相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組大鼠尾動(dòng)脈pSB比較見(jiàn)表1。各組大鼠術(shù)前尾動(dòng)脈pSB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與各組相應(yīng)的術(shù)前pSB相比，高血壓組pSB逐漸升高，而對(duì)照組及假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，8周末時(shí)，高血壓組pSB升高顯著，而假手術(shù)組pSB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　3組大鼠尾動(dòng)脈pSB的比較　mmHg

F組間=1 211.779，F(xiàn)時(shí)間=1 613.225，F(xiàn)交互=1 537.050，P<0.001；*：與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.23組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)比較見(jiàn)圖1、表2。對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)大致正常，各層分界清晰，內(nèi)膜光滑，中膜無(wú)增厚，彈性纖維呈層狀排列整齊，平滑肌排列均勻有序、無(wú)增生肥大；與對(duì)照組相比，高血壓組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增生、排列紊亂，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫失，中膜增厚明顯，血管平滑肌細(xì)胞增生肥大且排列紊亂，彈性纖維扭曲、紊亂，而假手術(shù)組無(wú)明顯改變。與對(duì)照組相比，高血壓組MT、MT/LD明顯增加，LD減小；而對(duì)照組與假手術(shù)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　3組大鼠主動(dòng)脈HE染色(×400)A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：高血壓組。

表2　3組大鼠VR指標(biāo)的比較

*：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，P<0.001。

2.33組大鼠AR和MPK-1蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)圖2和表3。對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)存在基礎(chǔ)量的AR蛋白表達(dá)(棕黃色顆粒物，如圖箭頭所示)，且AR在動(dòng)脈各層均有表達(dá)，以?xún)?nèi)層為主，主要位于細(xì)胞核內(nèi)；MKP-1蛋白(棕黃色顆粒物，如圖箭頭所示)各層均可見(jiàn)。與對(duì)照組相比，高血壓組AR蛋白及MKP-1蛋白的表達(dá)明顯下降，假手術(shù)組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson相關(guān)分析顯示，在高血壓組AR與MKP-1呈正相關(guān)(r=0.657，P=0.039)，在對(duì)照組及假手術(shù)組無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.589和0.436，P>0.05)。

圖2　3組大鼠主動(dòng)脈組織中AR和MKP-1蛋白的表達(dá)(SP，×400)1：AR蛋白；2：MKP-1蛋白；A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：高血壓組。

表3　3組大鼠主動(dòng)脈組織中AR和MPK-1蛋白表達(dá)水平的比較

*：與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，P<0.001。

3討論

高血壓VR是高血壓靶器官損害的重要病理生理基礎(chǔ)[7]，嚴(yán)重影響高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病的預(yù)后。目前高血壓治療策略不只局限于降低血壓，也關(guān)注對(duì)高血壓VR的防治，故對(duì)其機(jī)制深入探討研究意義重大。

近年來(lái)的研究[8-10]表明，睪酮不僅對(duì)生殖系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而且與冠心病、高血壓病等多種心血管疾病及其危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。既往課題組研究[11]證實(shí)，睪酮能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，其生物學(xué)效應(yīng)與抑制MAPK過(guò)度激活有關(guān)，提示睪酮有心血管保護(hù)作用。

睪酮的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)AR介導(dǎo)的。AR是配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，大多通過(guò)基因途徑調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。已證實(shí)[12]AR廣泛存在于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、心肌、主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、血管平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板等。該研究發(fā)現(xiàn)在正常大鼠主動(dòng)脈壁各層內(nèi)均存在基礎(chǔ)量的AR表達(dá)，主要分布于內(nèi)層；在腎血管性高血壓大鼠重構(gòu)的主動(dòng)脈中，AR蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示AR蛋白表達(dá)水平的改變參與了VR的發(fā)生過(guò)程，這與既往的研究[13]結(jié)果相符。Ikeda等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在AR基因敲除鼠，AngⅡ刺激顯著增加主動(dòng)脈內(nèi)膠原表達(dá)，引起中膜厚度增加及血管纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致VR的發(fā)生；同時(shí)也增加過(guò)氧化物物質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化等誘導(dǎo)VR的發(fā)生，且該過(guò)程伴有NO生物利用度的下降，提示AR通過(guò)多種途徑影響VR的發(fā)生。

MAPK是細(xì)胞外重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。以往的研究[14]證實(shí)，MAPKs過(guò)度激活在高血壓VR過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MKP-1是MAPKs的特異性調(diào)節(jié)磷酸酶，負(fù)責(zé)MAPKs的失活，在維持MAPKs活性水平的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。課題組既往研究[15]已證實(shí)，在高血壓左室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，不僅僅存在MAPKs的過(guò)度激活，同時(shí)還合并MPK-1表達(dá)下降，即表現(xiàn)為在重構(gòu)的心血管組織中MKP-1的表達(dá)可誘導(dǎo)性減低，導(dǎo)致MAPKs滅活障礙。為此，該研究選擇MKP-1蛋白表達(dá)水平為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)觀察點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在正常組織中存在基礎(chǔ)量的MKP-1蛋白表達(dá)，在重構(gòu)的血管中MKP-1蛋白表達(dá)下調(diào)，并且該現(xiàn)象與AR蛋白表達(dá)下調(diào)共存，進(jìn)一步的相關(guān)分析證明在高血壓組AR與MKP-1的表達(dá)呈正相關(guān)。由此推測(cè)，在高血壓VR過(guò)程中，AR與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)、相互作用，共同推進(jìn)了該過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，在高血壓VR過(guò)程中，存在AR及MKP-1蛋白表達(dá)水平的下降。提示AR蛋白表達(dá)下調(diào)參與了高血壓VR過(guò)程，并證實(shí)與MAPK信號(hào)通路偶聯(lián)。這可能為臨床高血壓VR及靶器官損害的防治提供新線(xiàn)索和新的藥物靶點(diǎn)。

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*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目31160193;云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目2010Y398;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目2010ZC055,2012FB135

Effects of androgen receptor protein expression level on hypertensive vascular remodeling in rats

YUChaonan1),WANGYing1),YANShuxun2),YANGGuojie1),ZHANGYanzhou3),YANGXiaocun1),LIYuan1),SUNLina1)

1)DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity；Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500522)DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theFirstAffiliatedHospital,HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500083)DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshypertension；testosterone receptor；vascular remodeling；mitogen-activated protein kinase；phosphatase

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.004

中圖分類(lèi)號(hào)R544.1

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：心肌重構(gòu)的機(jī)制及防治，E-mail:2414714561@qq.com