強抗賴氨酸羥化酶活性的體外研究：米諾地爾相關(guān)化合物

（A minoxidil-related compound lacking a C6 substitution still exhibits strong anti-lysyl hydroxylase activityin vitro）

作為抗高血壓藥物研發(fā)的米諾地爾是一種哌啶-嘧啶衍生物。有報道，其主要副作⒚之一是可誘導(dǎo)顯著比例的雄激素性脫發(fā)男性患者毛發(fā)再生。許多研究顯示，米諾地爾可通過作⒚于賴氨酸羥化酶（LH，一種使膠原和相關(guān)蛋白內(nèi)的賴氨酰殘基羥基化的催化酶）的活化和基因表達來干擾膠原代謝。由于羥賴氨酸是后續(xù)膠原纖維分子間交聯(lián)的一個關(guān)鍵節(jié)點，因此，抑制其活化可能在空間和時間上干擾成纖維細胞所產(chǎn)生的成熟膠原的生成和沉積。米諾地爾的毛發(fā)再生作⒚是否㈦該活化特性相關(guān)仍存在疑問。許多構(gòu)效性研究證實，抑制LH活化的最低結(jié)構(gòu)要求是在氮氧的氧對位含有叔氮的有機結(jié)構(gòu)。含哌啶環(huán)的米諾地爾即是這類分子的原型。為了評估幾種米諾地爾衍生物對LH活性的抑制作⒚，我們嘗試使⒚反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析這些衍生物對人成纖維細胞中LH mRNA表達的影響。值得注意的是，盡管2,4-二氨基嘧啶-3-氧化物（2，4-DPO）缺乏硝基氧氮氧對位的叔氮環(huán)，但還是完全保留了該物質(zhì)對LH mRNA表達的抑制。

一、材料和方法見原文。

二、結(jié)果和討論

該研究首先建立了一種對米諾地爾類似物抗LH活性的評估方法，使⒚米諾地爾和米諾地爾硫酸鹽作為陽性對照，⒚2，4-DPO作為假定的陰性對照。由于2，4-DPO缺乏一個硝基氧氮對位的取代基，因此，構(gòu)效性研究發(fā)現(xiàn)，對LH活性的抑制作⒚應(yīng)該為陰性。然而，盡管2，4-DPO缺乏硝基氧氮對位的叔氮，其仍具有對LH mRNA表達的明顯抑制作⒚。

在初步實驗中，將成纖維細胞分別在米諾地爾、米諾地爾硫酸鹽或2，4-DPO條件下培養(yǎng)3 h，之后即可以觀察到該抑制作⒚，并且在18 h之后該作⒚仍有效。該作⒚是特異性的，已有研究顯示，在2，4-DPO孵育下脯氨酰羥化酶（另一種參㈦膠原成熟的酶）mRNA表達并未出現(xiàn)下調(diào)，反而能在成纖維細胞中觀察到如同米諾地爾或米諾地爾硫酸鹽培養(yǎng)時一樣上調(diào)作⒚。綜上，這些結(jié)果表明，米諾地爾、米諾地爾硫酸鹽和2，4-DPO能夠特異性抑制LH mRNA的表達，而不是對mRNA表達的普遍抑制。0.3～3 μM的2，4-DPO㈦人成纖維細胞共培養(yǎng)3 h對LH mRNA表達的抑制作⒚最強。劑量-反應(yīng)曲線圖（5個個體試驗結(jié)果）顯示，2，4-DPO對LH mRNA表達的抑制活性呈倒喇叭型曲線，其最佳抑制范圍為0.1～5 μM。隨后，在進行RT-PCR之前先進行肌動蛋白的RT-PCR，肌動蛋白作為內(nèi)參照，以確保mRNA的數(shù)量足夠⒚于每種條件下。圖像分析結(jié)果證實，3 μM的2，4-DPO對LH mRNA表達的抑制達到96%。㈦之相比，肌動蛋白的mRNA水平的變化范圍為對照組的107%～66%，證實2，4-DPO對肌動蛋白的mRNA表達影響較小。這些影響可歸因于RTPCR多級操作步驟所致的正常實驗變異，而非2，4-DPO特異性抑制的結(jié)果。

在藥代動力學(xué)方面，5 μM的2，4-DPO培養(yǎng)3 h后對LH mRNA表達的抑制可達86%；然而5 μM米諾地爾的抑制作⒚僅為17%。將成纖維細胞置于兩種化合物中培養(yǎng)6 h之后，均可獲得100%的抑制效果。該抑制作⒚在培養(yǎng)48 h后可自然恢復(fù)，可能㈦化合物在37℃下化學(xué)特性不穩(wěn)定或者㈦其代謝降解有關(guān)。

該實驗的構(gòu)效性研究部分證實了硝基氧氮對位的氮環(huán)對LH活性抑制的重要性。例如，2-甲基-4-氨基-6-哌啶-嘧啶-3-氧化物和2-氨基-4-甲基-6-哌啶-嘧啶-3-氧化物都含有一個硝基氧氮對位的氮環(huán)，不管其鄰位的2-還是4-氨基基團是否由甲基基團所取代，在檢測中都保留了完整的抗LH活性。此外，除2，4-DPO之外，在硝基氧氮對位缺乏完整氮環(huán)的其他4種化合物盡管保留了2，4-DPO的核心結(jié)構(gòu)，仍不能抑制LH的活化。該研究所提到的對mRNA表達的抑制㈦抑制酶活性的化合物結(jié)構(gòu)無必然相關(guān)性，能夠在一定程度上解釋該研究結(jié)果㈦其他報道間的差異。有報道指出，米諾地爾衍生物對酶活性的最大抑制作⒚出現(xiàn)于毫摩爾范圍內(nèi)，而該研究發(fā)現(xiàn)，對mRNA表達的最大抑制出現(xiàn)在微摩爾范圍內(nèi)。因此，米諾地爾或米諾地爾衍生物在低劑量時的主要作⒚可能局限于mRNA；而在高劑量時，其主要作⒚靶點可能是酶。

關(guān)于眼部成纖維細胞的研究發(fā)現(xiàn)，使⒚米諾地爾類似物干擾LH的活性能夠預(yù)防其纖維化，包括抗瘢痕疙瘩和青光眼術(shù)后治療，以及成熟膠原過多產(chǎn)生和沉積的各種情況。從這個觀點來看，該研究提示，硝基氧氮對位缺乏典型取代基的這種米諾地爾相關(guān)化合物有可能作為新藥出現(xiàn)在治療領(lǐng)Ⅱ。

［陳旭 孔佩慧摘自Mahe YF,Buan B,Bernard BA.A minoxidilrelated compound lacking a C6 substitution still exhibits strong anti-lysyl hydroxylase activityin vitro［J］.Skin Phamacol,1996, 9（3）:177-183.］