白淵翰 楊 曦 曾志文

目前，第一代抗精神病藥物(First Generation Antipsychotics, FGAs)由于其嚴重的椎體外系和心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)，逐漸退居為二線的治療方案。有趣的是，作為FGAs代表的氟哌啶醇，仍舊活躍在精神分裂癥和雙相障礙的治療當中[1, 2]。除了確證的臨床療效外，多項基礎(chǔ)研究提示了氟哌啶醇對細胞損傷的保護性作用[3～5]。蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB/Akt)是促進神經(jīng)發(fā)育及細胞存活的一種重要激酶，其編碼基因AKT也是精神分裂癥的易感基因，Akt激酶在精神分裂癥的發(fā)病和藥物治療中均發(fā)揮了重要作用[6, 7]。前期研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇在體內(nèi)可以增加Akt激酶活性[7]，而氟哌啶醇是否通過激活A(yù)kt激酶并促進細胞存活并不清楚。叉頭型轉(zhuǎn)錄因子O亞型(Forkhead Box Os，F(xiàn)oxOs)家族中的FoxO1和FoxO3a是Akt激酶的下游靶標，同時也受磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)的調(diào)控。FoxOs作為誘導(dǎo)細胞損傷的關(guān)鍵分子[8]，其在氟哌啶醇細胞保護中的作用也不明確。

PC12細胞來源于成年大白鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤的細胞系，目前作為細胞模型被廣泛用于神經(jīng)細胞存活和凋亡的研究中[9]。研究已證明，當去除培養(yǎng)基中血清時，PC12細胞表現(xiàn)出時間依賴性的凋亡，并且表現(xiàn)出明顯的DNA片段破碎的凋亡模式[10]。本研究擬觀察氟哌啶醇對血清剝奪PC12細胞的保護性作用，同時采用不同濃度或不同作用時間的氟哌啶醇及特異性的PI3K/Akt信號通路抑制劑預(yù)處理研究其在Akt/PI3K-FoxOs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和實驗設(shè)備 細胞：PC12細胞由加拿大Mcgill University道格拉斯研究中心Remi Quirion教授饋贈提供。試劑：DMEM、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、二聯(lián)抗生素(PSA)均購自美國GIBCO 公司。氟哌啶醇，LY294002、AktVIII，U0126 均購自美國Sellect公司。設(shè)備：雙人單面凈化超凈臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，賽默飛二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，蔡氏倒置熒光顯微鏡，BioTek Synergy H1多功能酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長滿后，用含l%FBS、1%PSA的DMEM培養(yǎng)基接種于96孔和6孔板，16 h后對細胞進行處理。

1.2.2 細胞活力測試 血清剝奪實驗：將96孔板培養(yǎng)液換成無血清DMEM，孵育1 h后進行處理。7組細胞分別給予含1%FBS的DMEM和不同劑量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇。抑制劑預(yù)處理實驗：血清剝奪PC12細胞分為6組，其中3組分別給予不處理，1%FBS，1 μm的氟哌啶醇，另外3組分別給予10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126處理30 min后，加入濃度為1 μm的氟哌啶醇。MTT法檢測細胞活力：上述兩個實驗中每組細胞設(shè)6個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μm MTT(10 mg/ml)，再培養(yǎng)3 h，吸去培養(yǎng)液，加DMSO 200 μl/孔，待甲躦結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570 nm處讀取每孔吸光度(A)。取6孔A值的均數(shù)按公式計算細胞存活率=(試驗孔A均值/對照孔A均值)× 100%，重復(fù)3次。

1.2.3 蛋白提取與Western blot檢測 PC12細胞傳代并接種于6孔板，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，剝奪血清1 h，隨后6組細胞加入不同劑量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇處理，30 min后收獲蛋白。將同樣處理的另外6組血清剝奪PC12細胞中加入1 μm氟哌啶醇，處理不同時間(0 min、8 min、15 min、30 min、60 min、120 min)后收獲蛋白。另分5組同樣處理的血清剝奪PC12細胞分別給予不處理、氟哌啶醇1 μm、10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126。加入抑制劑30 min后3組細胞均接受氟哌啶醇1 μm處理，30 min后收取蛋白。上述三個實驗中每組細胞設(shè)6個復(fù)孔。Western blot實驗：向不同實驗因素處理的細胞中加入2×Sample Buffer，在冰上搖震裂解細胞約30 min，吸出裂解液，沸水加熱8 min使蛋白充分變性，離心冷卻后可進行Western免疫印跡。采用SDS-PAGE電泳，每孔加50 μg蛋白樣品，90 V電泳分離蛋白，溴酚藍電泳至分離膠底部時取出分離膠，將其與PVDF膜相貼并排除氣泡，兩側(cè)夾以濾紙和海綿墊，插入電轉(zhuǎn)槽中60 mA過夜。取出PVDF膜，TBST洗滌，置入含5%脫脂牛奶的TBST中，室溫封閉90 min從牛奶中取出，TBST洗膜5 min×3次，加入適當比例稀釋的第1抗體4 ℃孵育過夜，次日取出，TBST洗膜5 min×3次，含5%脫脂牛奶的TBST稀釋二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×3次；配制發(fā)光液，在暗房內(nèi)將發(fā)光液均勻滴加到膜上，靜置約2 min，出現(xiàn)熒光，根據(jù)熒光強度在壓片夾中曝光1～30 min不等，顯影、定影沖洗出膠片，目的蛋白顯示為黑色條帶；采用600 dpi分辨率掃描膠片，保存圖像數(shù)據(jù)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用單因素方差分析(ANOVA)分析組間差異，若差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進一步組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α= 0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟哌啶醇對血清剝奪PC12細胞存活率影響 與0 μm氟哌啶醇組相比，0.3 μm、1 μm、和3 μm氟哌啶醇能提升細胞存活率(P<0.05)。見圖1。與1%FBS組相比，不處理組PC12細胞存活率下降(P<0.05)。與不處理組相比，1 μm的氟哌啶醇能提升細胞存活率(P<0.05)。與1 μm的氟哌啶醇組相比，10 μm的LY294002和5 μm的AktVIII預(yù)處理能抑制氟哌啶醇對細胞存活率的提升(P<0.05)。見圖2。

注：與0 μm氟哌啶醇組比較，*P<0.05

注：與1%FBS組比較，*P<0.05；與不處理組比較，△P<0.05；與1%FBS組和1 μm的氟哌啶醇組比較，#P<0.05；-代表不予相應(yīng)處理，+代表給予相應(yīng)處理

2.2 氟哌啶醇不同濃度和不同作用時間對Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影響 不同濃度氟哌啶醇作用30 min后，與0 μm氟哌啶醇組相比，0.3 μm和1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；3 μm氟哌啶醇能增加FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；10 μm氟哌啶醇能增加ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖3。氟哌啶醇作用15 min和30 min能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用8 min能增加Akt和ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用60 min后能增加FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖4。

注：與0 μm氟哌啶醇組比較，*P<0.05

注：與0 min氟哌啶醇組比較，*P<0.05

2.3 PI3K、Akt、Mek抑制劑對Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影響 與不處理組相比，1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。與氟哌啶醇組比較，LY294002和AktVIII能減少Akt、FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖5。

注：與不處理組比較，*P<0.05；與氟哌啶醇組比較，△P<0.05;-代表不予相應(yīng)處理，+代表給予相應(yīng)處理

3 討論

本研究采用血清剝奪PC12細胞作為研究神經(jīng)損傷和保護的細胞模型。血清剝奪可以降低細胞的存活率，氟哌啶醇可以增加血清剝奪PC12細胞的存活率。PI3K/Akt信號通路阻斷劑可以阻斷氟哌啶醇的保護作用，而Mek通路抑制劑無此作用，這說明氟哌啶醇的保護作用可能是通過PI3K/Akt通路介導(dǎo)的。接著發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇可增加Akt、FoxO轉(zhuǎn)錄因子和ERK激酶的磷酸化水平，這一作用在氟哌啶醇為1 μm和30 min的作用時最為明顯，提示中等濃度的氟哌啶醇可能具有較好的神經(jīng)保護作用，而這種神經(jīng)保護作用會在一定范圍內(nèi)隨時間延長而增加。本研究更進一步發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇誘導(dǎo)的FoxO轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化是通過PI3K/Akt激酶介導(dǎo)的。提示氟哌啶醇可以通過磷酸化激活PI3K/Akt通路抑制凋亡因子FoxOs轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

越來越多的研究證據(jù)顯示，抗精神病藥物的治療作用與Akt激酶相關(guān)的細胞內(nèi)信號相關(guān)。小鼠模型經(jīng)短期和長期氟哌啶醇處理后，腦內(nèi)Akt1的磷酸化水平明顯升高[7, 11]。Beaulieu JM等[12～14]系統(tǒng)地證明了多巴胺D2受體通過beta-arrestin-2調(diào)節(jié)了Akt的磷酸化。這些結(jié)果表明，氟哌啶醇的作用機制可能是由Akt信號通路介導(dǎo)的。同樣，精神分裂癥患者接受氟哌啶醇治療后，額葉皮層內(nèi)源性Akt1激酶的水平有所恢復(fù)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇在0.3～3 μm時具有較好的促細胞存活作用，而10 μm或者更高濃度時能產(chǎn)生細胞毒性和增加細胞的凋亡。先前研究也發(fā)現(xiàn)10 μm氟哌啶醇導(dǎo)致培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元磷酸化Akt顯著下降[15]，可以抑制PC12細胞的Akt的磷酸化水平[16]。這兩項研究提示，氟哌啶醇對Akt的磷酸化水平的影響在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞或相關(guān)細胞類型與體內(nèi)完整的大腦反應(yīng)似乎不同。培養(yǎng)細胞可能對藥物濃度比活體大腦依賴性更敏感-具有明顯的濃度依賴性[17]。與這些差異類似，其他研究也證明了體外培養(yǎng)的細胞激活D2受體，如quinpirole或溴隱亭激動劑也可能導(dǎo)致Akt的磷酸化，這表明體外多巴胺介導(dǎo)的Akt磷酸化的確切機制是復(fù)雜的[18, 19]，值得進一步研究探討。

FoxO蛋白家族在細胞發(fā)育、增殖、存活和代謝等生命過程中發(fā)揮著重要的作用，也是藥物研究的一個重要靶點[20]。大量的研究表明，作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵下游靶標，F(xiàn)oxO在PI3K/Akt信號通路調(diào)控細胞存活的過程中扮演著關(guān)鍵的角色，而且其轉(zhuǎn)錄活性直接受PI3K/Akt信號通路的調(diào)控[21]。本研究及其他課題組的研究均發(fā)現(xiàn)FoxO轉(zhuǎn)錄因子在血清剝奪模型和其他多種細胞毒性模型中激活，而鋰鹽、氯氮平及其他多種神經(jīng)營養(yǎng)因子均可以抑制FoxO轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[9, 22]。本研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇可以增加FoxO1與FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，這在很大程度上可以解釋氟哌啶醇的神經(jīng)保護作用機制，而這一作用機制與PI3K/Akt-FoxOs通路而非Mek-ERK通路相關(guān)。

綜上，血清剝奪誘導(dǎo)PC12細胞損傷是一個經(jīng)典的神經(jīng)保護藥理學(xué)研究細胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇可以通過PI3k/Akt-FoxOs信號通路對PC12細胞產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，而這種作用表現(xiàn)出一定的量效和時效關(guān)系。后續(xù)研究可以關(guān)注氟哌啶醇在模型動物體內(nèi)是否可以同樣影響PI3k/Akt-FoxOs信號通路，進一步探討該通路與其抗精神病的藥理機制之間的關(guān)系。