李文桂(LI Wen-gui)，陳雅棠

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲(chóng)病研究所，重慶 400016)

?

·綜述·

人乳頭瘤病毒16型重組乳球菌疫苗的研制現(xiàn)狀

李文桂(LI Wen-gui)，陳雅棠

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲(chóng)病研究所，重慶 400016)

人乳頭瘤病毒16型； HPV16； 乳球菌； 疫苗； 綜述

人乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV16)是一類(lèi)廣泛感染人類(lèi)上皮組織的小DNA病毒，能引起人體各種黏膜和皮膚的增生性疾病與腫瘤，與人宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。疫苗接種是防治HPV16感染的有效途徑之一，現(xiàn)有疫苗的種類(lèi)包括死疫苗、減毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗等，但存在一定的毒副作用，因此尚需研究新型HPV16疫苗。

乳球菌(Lactococcus)是一種能大量發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的兼性厭氧革蘭陽(yáng)性菌。一般呈球形或卵圓形，大小為2 μm ×5 μm，單生，成對(duì)或成鏈狀。模式菌株為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。乳球菌通常具有加速食品酸化，增加食物營(yíng)養(yǎng)及改善食物品質(zhì)的作用，是乳制品工業(yè)發(fā)酵的重要菌類(lèi)，是一種有希望的疫苗載體[1-2]。本文擬就乳球菌介導(dǎo)的HPV16的E7蛋白、E7-IL-12融合蛋白、E7mm蛋白和L1蛋白等疫苗的構(gòu)建及其作用機(jī)制等方面的研制現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 大腸埃希菌-乳球菌穿梭載體的構(gòu)建

乳球菌的細(xì)胞壁厚且復(fù)雜，攝取外源DNA較為困難。Kim等[3]采用電穿孔方法進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化乳酸桿菌試驗(yàn)，摸索出了較好的轉(zhuǎn)化條件,為構(gòu)建重組乳球菌疫苗提供了有利條件。

為將外源DNA有效引入乳球菌，需構(gòu)建大腸埃希菌-乳球菌穿梭表達(dá)載體，乳球菌的穿梭表達(dá)載體通常有組成型和誘導(dǎo)型2種類(lèi)型。van等[4]構(gòu)建的pMG36e是一種常見(jiàn)的組成型表達(dá)載體，它含有p32啟動(dòng)子及其下游部分的開(kāi)放閱讀框，來(lái)自pUC18的多克隆位點(diǎn)和來(lái)自PrtP基因的轉(zhuǎn)錄終止子，pWV01的復(fù)制子和氯霉素抗性基因等。盡管該載體可表達(dá)高水平的外源蛋白，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的富集和聚合卻可導(dǎo)致蛋白在胞質(zhì)中被降解，通常對(duì)細(xì)胞具有毒害作用。

誘導(dǎo)型表達(dá)載體可利用誘導(dǎo)劑對(duì)外源蛋白進(jìn)行可控性表達(dá)，應(yīng)用較為廣泛。de Rugter等[5]開(kāi)發(fā)了乳菌肽控制的表達(dá)系統(tǒng)(Nisin-controlled expression system,NICE)，此系統(tǒng)包括3個(gè)組分：攜帶nisR和nisK基因的宿主菌、充當(dāng)誘導(dǎo)分子的乳菌肽(Nisin)，以及含有nisA啟動(dòng)子的質(zhì)粒。誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo)nisA啟動(dòng)子，nisA啟動(dòng)子由nisR和nisK組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。nisK是Nisin的膜結(jié)合感應(yīng)蛋白，nisR是膜內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)子。nisK接受外源nisin肽信號(hào)后，自身磷酸化激活胞漿內(nèi)nisR，隨后nisR激活nisA啟動(dòng)子，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。宿主菌NZ3900含有nisK和nisR基因，質(zhì)粒pNZ8149含有nisA啟動(dòng)子，其起始密碼子ATG處有NCOI酶切位點(diǎn)，這樣使插入的目的基因與nisA啟動(dòng)子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域構(gòu)成翻譯融合，較轉(zhuǎn)錄融合具有更高的表達(dá)活性。通常將含有nisA啟動(dòng)子的質(zhì)粒導(dǎo)入攜帶nisR和nisK蛋白的宿主菌時(shí)，外源基因的表達(dá)較弱；而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入nisin進(jìn)行誘導(dǎo)后，外源基因的表達(dá)水平在一定范圍內(nèi)與nisin的劑量成正比，誘導(dǎo)效率可以達(dá)到1 000倍以上[6]。

乳球菌的表達(dá)載體既可以利用胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，Thy)或丙氨酸消旋酶(alanine racemase,Alr)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為選擇標(biāo)記，也可以利用乳糖或木糖作為選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記均可食用，對(duì)于口服疫苗的開(kāi)發(fā)極具價(jià)值。人們發(fā)現(xiàn)thyA基因編碼的Thy在DNA合成中起關(guān)鍵作用，缺失thyA基因的菌株在普通培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，alr基因編碼的Alr是許多細(xì)菌生長(zhǎng)的必需成分。Fu等[7]以干酪乳桿菌來(lái)源的thyA基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建了食品級(jí)載體pFXL103。Bron等[8]將含異源alr基因的質(zhì)粒pGIPO11轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌alr-菌株后，alr-菌株恢復(fù)了野生型表型。Platteeuw等[9]構(gòu)建了食品級(jí)穿梭表達(dá)載體pLP3537，其含有l(wèi)acF選擇標(biāo)記、高拷貝內(nèi)源性的乳酸乳球菌pSH71復(fù)制子、LacA啟動(dòng)子和PepN終止子，配套菌株為刪除lacF基因的乳酸乳球菌NZ3900株，可以利用乳糖作為選擇標(biāo)記。將pLP3537質(zhì)粒轉(zhuǎn)入lacF基因缺失的宿主菌NZ3900株后，可使原來(lái)不能利用乳糖的宿主菌NZ3900發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸，使pH值降低，使篩選培養(yǎng)基中的溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，此種利用乳糖作為選擇標(biāo)記表達(dá)系統(tǒng)的元件均是食品級(jí)的，口服安全。Gosalbes等[10]構(gòu)建了乳糖調(diào)節(jié)的乳酸桿菌食品級(jí)表達(dá)載體pILac。戊糖乳球菌的MD353染色體上含有木糖(xylose，xy1)編碼基因，可以發(fā)酵木糖。Posno等[11]把xy1基因插入pLP3537，得到食品級(jí)表達(dá)載體pLP3537-xyl，可以利用木糖作為選擇標(biāo)記。上述選擇標(biāo)記的成功開(kāi)發(fā)為發(fā)展乳球菌成為疫苗載體提供了有力保障。

2 E7蛋白重組乳球菌疫苗

HPV16基因組分為早期區(qū)(E區(qū))和晚期區(qū)(L區(qū))，E區(qū)又分為E1～E7區(qū)，其中E7基因編碼E7蛋白。E7蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，可干擾抑癌蛋白R(shí)B與轉(zhuǎn)錄因子E2F和P107的結(jié)合，使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，E7蛋白還可與P103、Cyclin A和CDK2等細(xì)胞周期相關(guān)因子結(jié)合，使細(xì)胞發(fā)生癌變。核酸內(nèi)切酶A(nuclease A，NucA)是一種外源信號(hào)肽，LEISSTCDA肽段是一種連接短肽，它們均可促進(jìn)外源蛋白的分泌。Cortes-Perez等[12]將pBS-E7與pVE5547重組得pIL-E7-CWA，將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，10 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)1 h，免疫印跡發(fā)現(xiàn)HPV16患者的血清識(shí)別分子量為32 KDa的E7-CWAM6融合蛋白；將1×109CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，在初次免疫后14和28 d加強(qiáng)2次，在初次免疫后35 d采集免疫鼠的血清，免疫印跡證實(shí)該血清可識(shí)別重組E7-GST融合蛋白，說(shuō)明該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答。

Ribelles等[13]以pSEC-E7為模板擴(kuò)增383 bp的E7編碼基因，插入pGEP-CBD得pE7-CBD；將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，10 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)1 h，SDS-PAGE證實(shí)重組菌表達(dá)分子量為37 KDa的E7-CBD融合蛋白，免疫電鏡提示重組菌的表面存在E7-CBD融合蛋白分子；將1×108CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加強(qiáng)1次，初次免疫35 d后發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾內(nèi)E7特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的數(shù)目顯著增多；末次免疫后1周用1×105CFU的肺癌細(xì)胞株TC-1皮下注射進(jìn)行攻擊，在攻擊后3周發(fā)現(xiàn)60%(3/5)的免疫鼠末發(fā)生腫瘤，40%(2/5)的免疫鼠出現(xiàn)體積為0.285 cm3的腫瘤，而對(duì)照組的腫瘤體積為2.939 cm3，表明該疫苗可有效對(duì)抗肺癌細(xì)胞株TC-1的攻擊。

研究[14-17]表明，以pCD-E7為模板擴(kuò)增大小為313 bp的E7編碼基因，插入pGEM-Teasy獲得pGEM-E7，與pVE8001重組獲得pBS-E7；將pGEM-E7與pSEC-Nuc重組獲得pSEC-E7，將NucA基因插入pSEC-E7獲得pSEC-Nuc-E7；將pBS-E7與pSEC-LEISSTCDA重組獲得pSEC-LEISSTCDA-E7，與pBS-Nuc重組獲得pSEC-LEISSTCDA-Nuc-E7；將pCYT-E7與pVE5546重組獲得pILCYT-E7，與pGK重組得pCWA-E7；分別將pSEC-E7、pSEC-Nuc-E7、pSEC-LEISSTCDA-Nuc-E7和pCWA-E7這4種質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，1 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)1 h，SDS-PAGE證實(shí)4種重組菌分別表達(dá)19 KDa的E7蛋白、35KDa的Nuc-E7融合蛋白、41KDa的LEISS-Nuc-E7融合蛋白,以及38KDa的E7-CWAM6融合蛋白。免疫印跡發(fā)現(xiàn)，HPPV16患者血清識(shí)別重組菌表達(dá)的LEISS-Nuc-E7融合蛋白，免疫熒光表明4種重組菌表面存在相應(yīng)的融合蛋白分子。將1×109CFU的疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14和28 d各加強(qiáng)1次，末次免疫后1周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細(xì)胞分泌高水平的IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，提示這4種疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生TH1型的免疫應(yīng)答。

隨后將1×109CFU的LL-E7疫苗加1×109CFU的LL-IL-12佐劑疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加強(qiáng)1次，在末次免疫后1周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目顯著增加；末次免疫后1周皮下注射5×104CFU的肺癌細(xì)胞株TC-1進(jìn)行攻擊，攻擊后5周發(fā)現(xiàn)50%(12/24)的免疫鼠末發(fā)生腫瘤，可持續(xù)100 d，50%(12/24)的免疫鼠出現(xiàn)體積為1 cm3的腫瘤，而對(duì)照組的腫瘤體積可達(dá)6 cm3。將10只無(wú)瘤的免疫鼠喂養(yǎng)3個(gè)月后再用TC-1細(xì)胞株進(jìn)行攻擊，攻擊后6月仍未發(fā)生腫瘤，提示該類(lèi)疫苗加用IL-12佐劑可明顯對(duì)抗肺癌細(xì)胞株TC-1的攻擊感染。將5×104CFU的肺癌細(xì)胞株TC-1皮下注射C57BL/6鼠，注射后7 d小鼠出現(xiàn)可觸診的腫瘤，此時(shí)用1×109CFU的LL-E7疫苗和1×109CFU的LL-IL-12佐劑疫苗對(duì)模型鼠混合滴鼻進(jìn)行免疫治療，免疫治療后14、18 d各加強(qiáng)1次，發(fā)現(xiàn)35%(8/24)免疫治療鼠的腫瘤消退，可持續(xù)100 d，65%(16/24)免疫治療鼠的腫瘤體積縮小為1.8 cm3，而對(duì)照組的腫瘤體積可達(dá)7.5 cm3，表明該類(lèi)疫苗加用IL-12佐劑對(duì)肺癌細(xì)胞株TC-1模型鼠具有較好的免疫治療作用。

3 E7-IL-12融合蛋白重組乳球菌疫苗

白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL-12)可促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，提高它們的殺傷活性，誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，促進(jìn)TH0細(xì)胞分化為T(mén)H1細(xì)胞，促進(jìn)IgG2a、IgG2b和IgG3合成，抑制IgG1合成。Li等[18]分別以pCD-E7和pORT-IL-12為模板擴(kuò)增E7蛋白和IL-12的編碼基因，將E7基因插入pMG36e獲得pMG36e-E7，將IL-12基因插入pMG36e-E7獲得pMG36e-E7-IL-12；將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900株，1 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)3 h，SDS-PAGE證實(shí)重組菌表達(dá)分子量為89 KDa的E7-IL-12融合蛋白。將1×109CFU疫苗滴鼻免疫C57BL/6鼠，初次免疫后14、28 d各加強(qiáng)1次，初次免疫35 d后發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子的水平升高，脾內(nèi)E7特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞的數(shù)目顯著增多；末次免疫后1周皮下注射5×104的肺癌細(xì)胞株TC-1進(jìn)行攻擊，攻擊后5周發(fā)現(xiàn)37.5%(3/8)的免疫鼠未發(fā)生腫瘤，62.5%(5/8)的免疫鼠出現(xiàn)體積為0.89 cm3的腫瘤，而對(duì)照組的腫瘤體積可達(dá)7.84 cm3，說(shuō)明該疫苗可有效對(duì)抗肺癌細(xì)胞株TC-1的攻擊。將5×104CFU的肺癌細(xì)胞株TC-1皮下注射小鼠，注射后7 d小鼠出現(xiàn)可觸診的腫瘤，此時(shí)用1×109CFU疫苗對(duì)模型鼠滴鼻進(jìn)行免疫治療，治療后14、21 d各重復(fù)1次，初次免疫治療后90 d發(fā)現(xiàn)25%(2/8)治療鼠的腫瘤消退，75%(6/8)治療鼠的腫瘤體積明顯縮小，而對(duì)照組小鼠的腫瘤體積增大，在50 d內(nèi)全部死亡，提示該疫苗對(duì)肺癌細(xì)胞株TC-1模型鼠具有較好的免疫治療作用。

4 E7mm蛋白重組乳球菌疫苗

E7蛋白是一種致癌蛋白，改變E7蛋白內(nèi)的2個(gè)C-X-X-C基序，可產(chǎn)生一種不穩(wěn)定的蛋白，命名為E7 mm蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，E7mm蛋白的轉(zhuǎn)染活性明顯下降，比天然E7蛋白具有更好的免疫原性。Cortes-Perez等[19]以pBC209-E7mm為模板擴(kuò)增E7mm蛋白的編碼基因，插入pVE5547獲得pILCWAM6-SPUSP45-E7mm，與pGK重組獲得pCWAM6-SPUSP45-E7mm；將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，25 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)5 h，SDS-PAGE證實(shí)重組菌表達(dá)分子量為38 KDa的SPUSP45-E7-CWAM6融合蛋白；免疫熒光發(fā)現(xiàn)重組菌的表面含有融合蛋白分子，但未進(jìn)行保護(hù)力的試驗(yàn)。

5 L1蛋白重組乳球菌疫苗

HPV16基因組的L1基因可編碼L1蛋白，它是主要衣殼蛋白，可自身聚合成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)。Cortes-Perez等[20]以pCD-L1為模板擴(kuò)增1 606 bp的L1蛋白編碼基因，插入pCR-TOPO獲得pCR-L1，與pSEC-E7重組獲得pSEC-L1；將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000株，1 ng/mL乳菌肽誘導(dǎo)1 h，SDS-PAGE證實(shí)重組菌表達(dá)分子量為60 KDa的PreL1蛋白；免疫電鏡顯示重組菌的表面存在直徑30～50 nm的VLPs。

Cho等[21]以pGEM-L1為模板擴(kuò)增L1蛋白的編碼基因，插入pAM399獲得pAMJ399-L1；將其電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363株，培養(yǎng)1 h，SDS-PAGE證實(shí)重組菌表達(dá)分子量為57 KDa的L1蛋白；將1010CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，初次免疫后2、4周各加強(qiáng)1次，初次免疫后9～12周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG升高，初次免疫后9周達(dá)較高水平(滴度1∶5 000)，陰道SIgA抗體無(wú)明顯變化；同時(shí)將1010CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，初次免疫后1、14、15、28和29 d各加強(qiáng)1次，初次免疫后9～12周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG升高，初次免疫后9 W達(dá)較高水平(滴度1∶900)，陰道SIgA抗體無(wú)明顯變化，說(shuō)明該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答。

6 結(jié)語(yǔ)

重組乳球菌疫苗具有下述優(yōu)點(diǎn)：它是一種發(fā)酵工業(yè)長(zhǎng)期使用的食品級(jí)益生菌，是一種公認(rèn)為安全(generally regarded as safe,GRAS)的微生物，易培養(yǎng)，基因操作簡(jiǎn)便、可靠，轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好。乳球菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，不分泌內(nèi)毒素，表達(dá)的外源蛋白不需純化，可連同菌體直接服用。乳球菌通常不產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶，不會(huì)在細(xì)胞外對(duì)分泌的外源蛋白進(jìn)行降解；通常較少分泌自身蛋白，減少了載體自身蛋白對(duì)分泌的外源蛋白的干擾，外源蛋白既可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也可在細(xì)胞壁進(jìn)行表達(dá)，還可以分泌到細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)；乳球菌不在胃腸道定植，很少產(chǎn)生免疫耐受。乳酸菌的伴隨抗原是一種免疫佐劑，可提高重組乳球菌疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；乳酸菌與微顆粒疫苗的大小相似，可將抗原遞呈給腸黏膜組織的M細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?？诜虻伪墙臃N重組乳球菌疫苗可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。

重組乳球菌疫苗具有下述缺點(diǎn)：目前大部分乳球菌的表達(dá)載體常含有非食品級(jí)的基因片段，這將給乳球菌作為活菌微生態(tài)制劑帶來(lái)安全隱患；尚未闡明重組乳球菌疫苗誘導(dǎo)小腸黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)制，尚未闡明重組乳球菌疫苗的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，長(zhǎng)期口服重組乳球菌疫苗并不能在宿主體內(nèi)表達(dá)足量的抗原，長(zhǎng)期低劑量口服重組乳球菌疫苗有可能誘導(dǎo)免疫耐受，重組乳球菌疫苗的效果評(píng)價(jià)僅限于體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)階段。

隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步篩選高表達(dá)能力的菌株可提高外源蛋白的表達(dá)水平。針對(duì)不同的蛋白表達(dá)方式采用不同的免疫途徑，可提高重組乳球菌疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。深入研究重組乳球菌疫苗分泌外源蛋白的調(diào)控機(jī)制；構(gòu)建安全、高效的食品級(jí)表達(dá)載體；準(zhǔn)確定位外源蛋白在重組乳球菌疫苗中的表達(dá)位置，使重組抗原與黏膜的免疫系統(tǒng)充分接觸；實(shí)時(shí)定量檢測(cè)重組乳球菌疫苗在宿主胃腸道表達(dá)的目的蛋白；合理控制重組乳球菌疫苗在胃腸道的存活時(shí)間，避免免疫耐受；開(kāi)發(fā)合適的免疫佐劑，加強(qiáng)重組乳球菌疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，闡明上述問(wèn)題，重組乳球菌疫苗用于HPV16感染的免疫預(yù)防指日可待。

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(本文編輯：左雙燕)

Research of recombinant vaccine of human papillomavirus type 16 mediated byLactococcus

(CHEN Ya-tang)

(Institute of Infectious and Parasitic Diseases, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

2016-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30801052、No.30671835、No.30500423和No.30200239)

李文桂(1967-)，男(漢族)，湖北省鄖縣人，研究員，主要從事病原微生物的分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)研究。

李文桂 E-mail：cqliwengui@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.021

R183

A

1671-9638(2016)10-0802-05