盧興霞+駱建霞+任志雨+孫世海+柴慈江

摘 ? ?要：為進(jìn)行中華補(bǔ)血草優(yōu)良品種的保存和培育，為從分子水平進(jìn)行泌鹽植物耐鹽機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，本研究以中華補(bǔ)血草無菌苗葉片為外植體，對中華補(bǔ)血草的組織培養(yǎng)和再生體系進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，以MS + 6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%;以MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1為叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為99.06%;叢生芽繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為MS + NAA 0.2 mg·L-1 + 6-BA 0.15 mg·L-1;以MS + NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基為最佳生根率培養(yǎng)基，生根率為87%，且根系生長良好。

關(guān)鍵詞：中華補(bǔ)血草;組織培養(yǎng);植株再生

中圖分類號：Q945 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.006

Optimized System of Tissue Culture and Plant Regeneration of Limonium sinense

LU Xingxia， LUO Jianxia， REN Zhiyu， SUN Shihai， CHAI Cijiang

（College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural College， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to save and breed new varieties， and to lay the foundation for studying salt tolerance mechanism of salt secreting plant by molecular techniques， tissue culture and plant regeneration of Limonium sinensewere were optimized with the leaf explants of sterile seedlings. The results showed that the optimal medium inducing the callus was MS + 6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1， the inducing ratio was 100%; the optimal medium of regeneration buds was MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1， the regeneration ratio was 99.06%; the MS medium containing NAA 0.2 mg·L-1and 6-BA 0.15 mg·L-1 was optimal subculture medium;the MS medium containing NAA 0.2 mg·L-1 was the optimal medium of rooting， the rooting ratio was 87%， and the roots could have vigorous growth.

Key words： Limonium sinense（Girard） Kuntze; tissue culture; plant regeneration

中華補(bǔ)血草[Limonium sinense（Girard） Kuntze]又名匙葉草、海金花，為藍(lán)雪科（Plumbaginaceae）補(bǔ)血草屬的多年生草本植物，是典型的泌鹽植物，具有鹽腺和鹽囊泡等結(jié)構(gòu)，可以將體內(nèi)多余鹽分排出體外，使鹽堿地脫鹽，改善鹽堿地土壤環(huán)境，被譽(yù)為改造鹽堿地的“先鋒植物”[1-2]。其花萼膜質(zhì)，花后宿存，形態(tài)似“梅”，被譽(yù)為干支梅，是插花中人們尤為鐘愛的填充花材。中華補(bǔ)血草根或全草均可入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)消炎、活血止血、調(diào)經(jīng)的功效，用于感冒、失血以及月經(jīng)過多等癥狀，也有抗衰老、抗癌等功效，具有較高的藥用價(jià)值[3-4]。目前，中華補(bǔ)血草以野生為主，且主要以播種方式進(jìn)行繁殖，致使后代發(fā)生嚴(yán)重變異。建立中華補(bǔ)血草組織培養(yǎng)及再生體系，既有利于中華補(bǔ)血草優(yōu)良品種的保存及培育，也可以為從分子水平進(jìn)行泌鹽植物耐鹽機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。本研究以中華補(bǔ)血草無菌苗葉片為外植體，在前期組培工作的基礎(chǔ)上，對中華補(bǔ)血草的組織培養(yǎng)和再生體系進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)外植體為2013年5月在天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地采集的中華補(bǔ)血草花梗上獲得的無菌苗葉片，在無菌條件下將葉片切成0.5 cm的正方形方塊，然后接種到愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中華補(bǔ)血草愈傷組織的誘導(dǎo)及分化 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加0.2 mg·L-1NAA和不同濃度6-BA（0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1），共計(jì)5個處理。pH值為5.8。每個處理接種50塊以上外植體。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，60 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的誘導(dǎo)率。

1.2.2 中華補(bǔ)血草叢生芽繼代培養(yǎng)基的篩選 將葉片誘導(dǎo)的叢生芽分別繼代培養(yǎng)在不同濃度6-BA（0.05，0.15，0.10 mg·L-1）的繼代培養(yǎng)基內(nèi)，基本培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，放在組培室內(nèi)培養(yǎng)。每周統(tǒng)計(jì)、觀察繼代叢生芽的生長情況，40 d后結(jié)束統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 中華補(bǔ)血草組培苗的生根 以MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度的激素，研究不同的激素種類和濃度對組培苗生根的影響。激素種類和濃度見表1，3個處理，每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)4瓶，每瓶接種5個，每個處理接種60個組培苗。接種后每周觀察1次，觀察組培苗的生根時(shí)間、數(shù)量、質(zhì)量，1個月后每個處理隨機(jī)選取30株進(jìn)行根系生長情況的觀察、測量。

1.2.4 培養(yǎng)條件 以上試驗(yàn)材料均放置在組培室內(nèi)，培養(yǎng)條件：光照3 000 lx，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)溫度23～25 ℃。

1.2.5 中華補(bǔ)血草組培苗移栽和管理 將生根的組培苗在散射光下煉苗1周后，再開瓶煉苗5 d，然后洗去根部的瓊脂，移栽到裝有蛭石：草炭土=3∶1（體積比）的穴盤（12×5）中，將穴盤放入周轉(zhuǎn)箱后，上面用塑料薄膜覆蓋，放到室內(nèi)散射光的地方，保持土壤濕潤，1周后揭去塑料薄膜，正常管理。揭去塑料薄膜1周后，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPASS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并做方差分析。

出愈率=生成愈傷組織的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%

叢生芽誘導(dǎo)率=分化出芽叢的愈傷組織數(shù)或葉片數(shù)/接種愈傷組織數(shù)或葉片數(shù)×100%

移栽成活率=成活植株數(shù)/移栽植株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 中華補(bǔ)血草愈傷組織的誘導(dǎo)及分化

由表2可知，與對照相比，當(dāng)培養(yǎng)基中添加了0.5 mg·L-1的6-BA時(shí)，葉片外植體傷口邊緣直接發(fā)生64%的叢生芽，而不產(chǎn)生愈傷組織，當(dāng)在此培養(yǎng)基中再添加0.1 mg·L-1的NAA時(shí)，外植體傷口邊緣發(fā)生18%的愈傷組織，而叢生芽的發(fā)生率則從64%降低到50%。這表明，添加6-BA有助于叢生芽的誘導(dǎo)發(fā)生，而添加NAA則有助于愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生。

表2中，當(dāng)NAA的濃度不變（0.2 mg·L-1），6-BA的濃度從0.1 mg·L-1逐漸增加到2 mg·L-1時(shí)，尤其是6-BA濃度在1.5 mg·L-1以下范圍內(nèi)逐漸增加時(shí)，對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響差異不顯著，但當(dāng)6-BA濃度增加到2 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著下降到48%。這表明，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1，6-BA濃度為0.1～1.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率均較高，為96%以上，愈傷組織的生長狀態(tài)也較好，但從成本方面考慮，添加6-BA 0.1 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基為中華補(bǔ)血草愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

但對于叢生芽誘導(dǎo)率而言，當(dāng)6-BA 濃度在0.1～1.5 mg·L-1時(shí)，隨著6-BA 濃度的增加，叢生芽誘導(dǎo)率也顯著增加，當(dāng)6-BA濃度增加到1.5 mg·L-1時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為99.06%，叢生芽生長正常;當(dāng)6-BA濃度為2 mg·L-1時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率顯著下降到60%，且叢生芽生長異常，葉片肥厚，葉色為墨綠色。這表明，當(dāng)NAA為0.2 mg·L-1時(shí)，6-BA濃度為1.5 mg·L-1是誘導(dǎo)叢生芽的臨界濃度，低于或高于這個濃度，叢生芽誘導(dǎo)率均顯著下降。因此，培養(yǎng)基中添加6-BA 1.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1為中華補(bǔ)血草叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，叢生芽誘導(dǎo)率為99.06%，叢生芽生長發(fā)育良好。

2.2 中華補(bǔ)血草叢生芽繼代培養(yǎng)基的篩選

由表3可知，6-BA濃度在0.05 mg·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)接的玻璃化叢生芽的莖葉沒有伸長生長，生長狀態(tài)不好，正常叢生芽生長較好，成苗率為46.67%;有18.33%的叢生芽被誘導(dǎo)生根，根系長勢不良。6-BA濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)接的個別玻璃化叢生芽可以伸長生長，逐漸轉(zhuǎn)向正常苗，正常叢生芽生長良好，成苗率為40%;叢生芽可以發(fā)出粗壯的根系，但須根較少。6-BA濃度為0.15 mg·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)接玻璃化叢生芽逐漸恢復(fù)正常生長，正常叢生芽健壯生長，葉色深綠，成苗率為83.33%，顯著高于前兩個處理;叢生芽發(fā)根的時(shí)間晚于前兩個處理，根系短且須根少，生根率最少，為6.67%。由以上分析可知，隨著6-BA濃度的增長，中華補(bǔ)血草畸形叢生芽的成苗率呈上升趨勢，生根率呈下降趨勢，適當(dāng)增加細(xì)胞分裂素的含量可以促進(jìn)叢生芽的生長發(fā)育。因此，中華補(bǔ)血草叢生芽適宜的繼代培養(yǎng)基為MS + NAA 0.2 mg·L-1+ 6-BA 0.15 mg·L-1。

2.3 中華補(bǔ)血草組培苗的生根

由表4可知，以附加0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基的生根率最高，達(dá)87%，其次為對照，生根率70%，二者之間達(dá)到顯著性差異;附加NAA和6-BA處理的生根率最低，只有17%，且與其它兩個處理達(dá)到了極顯著差異。對于根系的生長情況而言，3個處理的生根數(shù)差異不大;3個處理的根長、根系的長勢相比，附加0.2 mg·L-1NAA和0.05 mg·L-16-BA處理的根系最長、長勢最壯，而且須根數(shù)明顯多于其它兩個組合;對照的根長較附加NAA處理的根系要長，但根系長勢明顯細(xì)弱，總體效果不好;附加NAA處理的根系粗壯，長勢也較好。以上分析表明，添加6-BA不利于中華補(bǔ)血草的生根，但有助于促發(fā)須根。綜合本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，以MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1處理的生根率最高，且根系長勢也較好。

2.4 中華補(bǔ)血草組培苗移栽和管理

中華補(bǔ)血草共移栽113株組培苗，成活101株，移栽成活率為89%，移栽成活率較高。陳世華等人[5]的研究表明，中華補(bǔ)血草移栽成活率可達(dá)93%以上，與本試驗(yàn)的結(jié)果相差不大。中華補(bǔ)血草的葉片為基生，且小苗葉片比較薄，澆水后容易粘附在基質(zhì)表面，導(dǎo)致組培苗葉片霉?fàn)€，降低成活率。因此，中華補(bǔ)血草小苗在澆水后應(yīng)及時(shí)挑離覆于濕土上的葉片，避免發(fā)生葉片霉?fàn)€而導(dǎo)致成活率降低。本試驗(yàn)認(rèn)為，中華補(bǔ)血草屬于移栽易成活的植物。

3 結(jié)論與討論

陳世華等[5]以葉片為外植體在基本培養(yǎng)基中通過添加不同種類生長素及調(diào)節(jié)生長素濃度，對中華補(bǔ)血草的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系進(jìn)行了優(yōu)化，不同濃度NAA與0.5 mg·L-1 6-BA組合時(shí)，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高，為88%，而本試驗(yàn)中NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1組合培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率僅為47.27%，顯著低于前人的研究結(jié)果。但添加0.2 mg·L-1NAA和1.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率卻為99.06%，高于陳世華等人最佳不定芽培養(yǎng)基94%的不定芽誘導(dǎo)率。生根誘導(dǎo)時(shí)，陳世華等人在MS基本培養(yǎng)基中添加了不同濃度的NAA，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，生根率最高，為74%，NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，生根率為64%;本試驗(yàn)中，適宜的生根培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1NAA，生根率達(dá)87%，明顯高于陳世華等的研究結(jié)果，且與他們篩選出的最佳生根培養(yǎng)基MS + IBA 0.1 mg·L-1的生根誘導(dǎo)率（86%）相近。造成試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能與中華補(bǔ)血草種資資源間的差異有關(guān)，一方面以播種繁殖的中華補(bǔ)血草其后代變異較大，另一方面種資資源也可能存在地域性差異。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)的取材范圍，選取不同品種及不同產(chǎn)地的中華補(bǔ)血草進(jìn)行試驗(yàn)，為中華補(bǔ)血草組織培養(yǎng)和再生體系建立更加完善的培養(yǎng)方案。

本試驗(yàn)對天津鹽堿地栽植的中華補(bǔ)血草組織培養(yǎng)和再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，為鹽堿地中華補(bǔ)血草優(yōu)株種質(zhì)資源的保存和培育及泌鹽植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)率為100%;叢生芽最佳培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)率為99.06%;叢生芽繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為MS + NAA 0.2 mg·L-1+ 6-BA 0.15 mg·L-1;最佳生根率培養(yǎng)基為MS + NAA 0.2 mg·L-1，生根率為87%，且根系長勢良好。

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