王燦紅，何曉山，張麗靜，霍小位，劉冬羽,韓嘉媛，李立勇，曹　麗

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明　650500)

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羧甲基茯苓多糖對(duì)氟尿嘧啶致腸炎小鼠的保護(hù)作用

王燦紅1,2，何曉山2，張麗靜1，霍小位1，劉冬羽1,韓嘉媛1，李立勇1，曹麗1

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明650500)

摘要：目的探討羧甲基茯苓多糖(carboxymethylpachymaran，CMP)對(duì)氟尿嘧啶(fluorouracil，5-Fu)所致小鼠腸黏膜炎的改善、腸道保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。方法建立5-Fu小鼠腸黏膜炎模型，隨機(jī)分組、給藥。炭末推進(jìn)法測(cè)定小鼠腸推進(jìn)率，并測(cè)量小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；生物化學(xué)方法檢測(cè)派氏集合淋巴結(jié)(PPs)勻漿上清液中活性氧類(ROS)和谷胱甘肽(GSH)的含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活力；ELISA法檢測(cè)PPs勻漿上清中IL-1β的含量；小鼠結(jié)腸做病理組織切片觀察，免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB和p-p38的表達(dá)。結(jié)果與5-Fu模型組比較，CMP能明顯延長(zhǎng)5-Fu所致的結(jié)腸縮短(P<0.01)；明顯促進(jìn)腸推進(jìn)功能(P<0.05)；結(jié)腸病理學(xué)切片顯示，CMP能明顯減輕5-Fu所致的結(jié)腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞丟失、隱窩深度變淺及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；并且明顯升高PPs勻漿上清中GSH含量、CAT和GSH-Px的活性(P<0.01或P<0.05)，降低ROS(P<0.05)和IL-1β的含量(P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示，相比5-Fu組，CMP明顯降低結(jié)腸組織NF-κB和p-p38的表達(dá)。結(jié)論CMP能夠減輕5-Fu所致小鼠結(jié)腸黏膜炎，改善5-Fu所致的腸道傳輸功能失調(diào)，并保護(hù)5-Fu對(duì)腸道的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化、抑制炎癥及抗凋亡作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：羧甲基茯苓多糖；抗氧化；氟尿嘧啶；腸黏膜炎；腸推進(jìn)；腸道保護(hù)

茯苓為多孔菌科真菌poriacocos(schw)wolf的干燥菌核，根據(jù)記載茯苓具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神之功效，為一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材[1]。茯苓多糖(pachyman)是茯苓的主要成分，其含量占茯苓干重的80%以上[2-3]。天然茯苓多糖經(jīng)氫氧化鈉、氯乙酸醚化、再加堿二次醚化最后乙醇沉淀，合成羧甲基茯苓多糖(carboxymethylpachymaran，CMP)，修飾后茯苓多糖分子量變小，黏度降低，取代度增加，水溶性升高，抗腫瘤及免疫活性等也增強(qiáng)[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多方面具有良好的藥理活性[5-7]。在腸道免疫方面，茯苓多糖能夠影響免疫抑制小鼠CD4+、CD8+細(xì)胞亞群比例及腸派氏結(jié)T、B淋巴細(xì)胞比例和細(xì)胞因子水平[8]。

氟尿嘧啶(fluorouracil，5-Fu)是臨床上治療消化道腫瘤和乳腺癌的基本藥物。然而，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，5-Fu具有較強(qiáng)的毒副作用,如造成胃腸道黏膜炎、骨髓抑制、肝、腎及心臟毒性、機(jī)體免疫功能及造血功能低下等[9]。為觀察CMP是否具有改善5-Fu所致的小鼠腸黏膜炎及腸道保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射5-Fu建立小鼠腸黏膜炎模型，通過(guò)檢測(cè)CMP對(duì)小鼠腸推進(jìn)作用、派氏集合淋巴結(jié)(PPs)勻漿上清中脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞因子分泌水平及結(jié)腸病理、炎癥、凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響，探討CMP對(duì)5-Fu所致小鼠腸黏膜炎的改善及腸道功能的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制，為茯苓多糖的臨床應(yīng)用及茯苓藥用價(jià)值的深入開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑CMP(湖南補(bǔ)天藥業(yè)股份有限公司)；氟尿嘧啶注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；活性氧類(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)均購(gòu)于南京建成生物工程有限公司；ELISA試劑盒IL-1β購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；山羊抗鼠一抗NF-κB、p-p38購(gòu)于Santa Cruz公司；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；冰醋酸、甲醛及其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器生物潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)：BCN-1360)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Napco公司，型號(hào)：5410)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司，型號(hào)：MQX 200)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus，型號(hào)：CKX 41)；離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司，型號(hào)：Labofuge 400R)。

*P<0.05vsnormal；#P<0.05vs5-Fu

1.3動(dòng)物♂ ICR小鼠，SPF級(jí)，16-18g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。按嚙齒類動(dòng)物飼養(yǎng)方法和條件飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.4方法

1.4.1分組、給藥健康♂ ICR小鼠32只，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、5-Fu(25 mg·kg-1)組、CMP(200 mg·kg-1)組、CMP(200 mg·kg-1)+5-Fu(25 mg·kg-1)組，每組8 只。正常組灌胃給予蒸餾水，20 mL·kg-1，每日1次，CMP組灌胃給予CMP，20 mL·kg-1，每日1次，5-Fu組，腹腔注射給藥，10 mL·kg-1，每?jī)扇?次，CMP+5-Fu組，灌胃給予CMP，20 mL·kg-1，每日1次，同時(shí)腹腔注射給予5-Fu，10 mL·kg-1，每?jī)扇?次，各組均給藥至14 d。

1.4.2CMP對(duì)5-Fu模型小鼠腸道推進(jìn)作用的影響給藥最后1 d，提前6 h禁食，正常飲水。末次給藥1.5 h后，每只小鼠灌胃炭末混懸液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的阿拉伯膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的活性炭充分混勻)0.2 mL。灌胃后20 min頸椎脫臼處死，剖腹取小腸，測(cè)量炭末推進(jìn)前端的位置及小腸的總長(zhǎng)度，計(jì)算推進(jìn)的距離與小腸全長(zhǎng)的比值為炭末推進(jìn)百分率/%：炭末推進(jìn)百分率/%=炭末前端與幽門的距離/小腸全長(zhǎng)×100%剪取盲、結(jié)直腸，分別測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度和總長(zhǎng)度，并將結(jié)腸部分組織置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，做組織病理切片觀察及免疫組化。

1.4.3CMP對(duì)5-Fu模型小鼠派氏集合淋巴結(jié)(PPs)中ROS、GSH含量和CAT、GSH-Px活性及細(xì)胞因子IL-1β含量的影響剪取小腸外壁上隆起的派氏集合淋巴結(jié)(PPs)，稱取一定重量，按1 ∶9加入生理鹽水，冰浴、充分勻漿，4℃，3 000 r·min-1，離心15 min，取上清-80℃保存，按照脂質(zhì)過(guò)氧化試劑盒和ELISA試劑盒操作要求測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.4.4免疫組化方法檢測(cè)5-Fu模型小鼠結(jié)腸組織中蛋白NF-κB和p-p38的表達(dá)末次給藥后，摘眼球取血、脫臼處死動(dòng)物，剪取結(jié)腸部分測(cè)量長(zhǎng)度后，剪取結(jié)腸前段部分約1.5 cm，置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，將固定好的組織進(jìn)行流水沖洗、梯度酒精脫水，浸蠟，包埋，6 μm切片，烤干，脫蠟，HE 染色，中性樹(shù)脂封片。免疫組化鏡檢觀察，結(jié)腸組織中NF-κB和p-p38一抗、二抗的表達(dá)情況；然后，對(duì)于蛋白陽(yáng)性表達(dá)部分(棕褐色細(xì)胞)用ImagePro-Plus 6.0軟件 (Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)進(jìn)行量化。

2結(jié)果

2.1CMP對(duì)5-Fu模型小鼠小腸長(zhǎng)度及推進(jìn)功能的影響Tab1結(jié)果顯示，與正常組比，各組小腸總長(zhǎng)度沒(méi)有明顯變化，但5-Fu組小鼠的腸推進(jìn)長(zhǎng)度明顯縮短，腸推進(jìn)率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比5-Fu組，給予CMP后小鼠的腸推進(jìn)率則明顯升高，且差異有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明CMP能夠明顯改善5-Fu所致的腸道推進(jìn)功能障礙。

2.2CMP對(duì)5-Fu模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Tab2結(jié)果顯示，與正常組相比，單用CMP能夠增加結(jié)直腸總長(zhǎng)度和結(jié)腸長(zhǎng)度，其中結(jié)腸長(zhǎng)度增加明顯(P<0.05)；單用5-Fu明顯縮短結(jié)直腸總長(zhǎng)度和結(jié)腸長(zhǎng)度，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與5-Fu組相比，給予CMP 后小鼠的結(jié)直腸總長(zhǎng)度和結(jié)腸長(zhǎng)度均明顯增加，且差異均有顯著性(P<0.01)。

Tab2Effect of CMP on length of colon in model

*P<0.05vsnormal；##P<0.01vs5-Fu

2.3CMP對(duì)5-Fu模型小鼠派氏集合淋巴結(jié)中脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的影響Tab3結(jié)果顯示，與正常組比較，5-Fu組ROS的含量明顯增加(P<0.01)，GSH含量、CAT和GSH-Px的活性均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；表明小鼠腸道發(fā)生明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；與5-Fu組相比，CMP能使ROS含量明顯減少(P<0.05)，GSH含量明顯增加(P<0.05)，CAT和GSH-Px活性明顯升高(P<0.01或P<0.05)，提示CMP能明顯減輕5-Fu所致的小鼠氧化損傷。

*P<0.05,**P<0.01vsnormal；#P<0.05,##P<0.01vs5-Fu

2.4CMP對(duì)5-Fu模型小鼠派氏集合淋巴結(jié)中細(xì)胞因子IL-1β的影響Tab4結(jié)果顯示，與正常組比較，5-Fu組IL-1β的含量明顯增加(P<0.05)，表明小鼠腸道發(fā)生炎癥性損傷；與5-Fu組相比，CMP明顯降低IL-1β含量(P<0.01)，提示CMP能夠減輕5-Fu所致的小鼠腸黏膜炎。

Tab4Effect of CMP on IL-1β in supernatant

*P<0.05vsnormal;##P<0.01vs5-Fu

2.5CMP對(duì)5-Fu模型小鼠結(jié)腸的病理組織學(xué)觀察Fig 1結(jié)腸病理切片顯示，正常小鼠腸黏膜絨毛表面完整，固有層可見(jiàn)小血管、毛細(xì)血管、淋巴管。黏膜下層疏松結(jié)締組織，富有血管、淋巴管，肌層和漿膜層次清晰。相比正常組，5-Fu組小鼠結(jié)腸腸黏膜表面不完整，上皮杯狀細(xì)胞丟失嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)黏膜肌層。相比單用5-Fu，給予CMP處理后結(jié)腸黏膜組織病變、上皮杯狀細(xì)胞丟失、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞損傷等均明顯減輕，結(jié)腸黏膜表面相對(duì)完整。

2.6CMP對(duì)結(jié)腸組織中NF-κB和p-p38表達(dá)的影響Fig 2～5小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和p-p38免疫組化的結(jié)果顯示，相比5-Fu組，CMP能明顯減少NF-κB和p-p38的表達(dá)，表明CMP能夠明顯減輕5-Fu所致小鼠腸黏膜炎。

3討論

氟尿嘧啶是治療消化道腫瘤和乳腺癌的基本藥物,但其有較嚴(yán)重的副作用。如骨髓抑制、心臟毒性、腹瀉、肝損傷和黏膜炎,其中黏膜炎是影響化療療效的主要毒副作用[11]。5-Fu對(duì)腸黏膜屏障的損傷主要包括：直接損傷腸黏膜，絨毛萎縮，吸收、傳遞功能降低，出現(xiàn)腹瀉；毛細(xì)血管組織缺血，釋放大量氧自由基ROS，損傷膜結(jié)構(gòu)，使機(jī)體循環(huán)被破壞、清除自由基能力降低，進(jìn)而發(fā)生氧化損傷[12-13]。腸炎發(fā)生的主要作用機(jī)制與p38MAPK通路的過(guò)度激活[14]及NF-κB通路的激活有關(guān)，NF-κB信號(hào)能夠調(diào)節(jié)許多炎癥因子基因的表達(dá)[15]，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放[16]。

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vs5-Fu

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vs5-Fu

本研究結(jié)果顯示，CMP能改善5-Fu所致小腸推進(jìn)功能的降低；并增加5-Fu模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度，說(shuō)明CMP能夠改善5-Fu所致小鼠腸道傳輸功能的障礙。CMP明顯減輕5-Fu所致結(jié)腸黏膜組織病變、上皮杯狀細(xì)胞丟失及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，使結(jié)腸黏膜表面相對(duì)完整，并且明顯降低派氏集合淋巴結(jié)過(guò)氧化物ROS含量，增加抗氧化物GSH含量和抗氧化物酶CAT和GSH-Px的活性；提示CMP能夠明顯減輕5-Fu所致小鼠腸道過(guò)氧化損傷和結(jié)腸黏膜炎病理狀態(tài)。另外，CMP還能明顯降低炎癥因子IL-1β的釋放；明顯減少結(jié)腸組織中NF-κB蛋白的表達(dá)，提示CMP能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，降低細(xì)胞炎癥因子IL-1β的釋放，進(jìn)而減輕炎癥的發(fā)生，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]；CMP還能通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路的激活，減少結(jié)腸組織p-p38的表達(dá)，對(duì)結(jié)腸組織的細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。以上結(jié)果均提示，CMP能夠促進(jìn)小鼠腸道蠕動(dòng)，減輕化療藥物所致腸道黏膜免疫功能低下帶來(lái)的過(guò)氧化病理?yè)p傷和炎癥。證實(shí)CMP能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腸道免疫功能，進(jìn)而抑制氧化損傷及炎癥產(chǎn)生并起到保護(hù)腸道的作用。

綜上所述，CMP能夠減輕臨床常用化療藥物5-Fu的腸道毒副作用，提示在氟尿嘧啶化療時(shí)，輔以CMP在減輕腸道毒性，提高腸道免疫功能，改善生活質(zhì)量等方面具有積極意義；而CMP亦具有抗癌作用，提示CMP可能對(duì)腫瘤治療具有減毒增效作用，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心完成。曹麗老師負(fù)責(zé)指導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及論文修改；王燦紅主要負(fù)責(zé)動(dòng)物造模、給藥、生化、病理實(shí)驗(yàn)以及論文的撰寫；何曉山老師協(xié)助本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路的制訂；張麗靜、霍小位、劉冬羽、韓嘉媛和李立勇均參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。)

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racil(5-Fu)-induced mice intestinal mucositis and explore its mechanisms. MethodsICR mice were assigned randomly to four groups:normal group(n=8；receiving pure water orally for 14 d)，CMP group(n=8；200 mg·kg-1CMP for 14 d orally)，5-Fu group(n=8；25 mg·kg-15-Fu for 7 d，intraperitoneally(i.p.)，and CMP+5-Fu group(n=8；200 mg·kg-1CMP for 14 d orally and 25 mg·kg-15-Fu for 7 d，i.p.).At day 14the mice were sacrificed.The intestinal propelling rate and the colon length were measured.ROS，GSH and IL-1βcontents，and CAT，GSH-Px activities in homogenate supernatant of PPs were measured by kits for observing the effects of CMP on mice lipid peroxidation and intestinal mucosal inflammatory induced by 5-Fu.Colon tissues were used for hematoxylin and eosin(HE) staining for the determination of the effect of CMP on mice colon histopathology，immunohistochemistry for the protein levels of NF-κB and p-p38.ResultsCMP significantly extended colon lengths，accelerate the intestinal propelling rates，reduced colonic mucosa epithelium goblet cell loss，inflammatory cells infiltration，and crypt depth shallow induced by 5-Fu.CMP obviously reduced ROS and IL-1β contents，and prevented reductions in homogenate supernatant of PPs GSH content，CATand GSH-Px activities by 5-Fu administration，and also reduced the expression of NF-κB and p-p38 in colon tissues. However，CMP alone had no effect on the colon of normal mice.ConclusionThe current study demonstrates that CMP may have significant protective effects against 5-Fu-induced intestinal mucositis.Its mechanism may be related to enhancing the antioxidant activity，anti-inflammatory and anti-apoptotic effects.

Protective effects of CMP on 5-Fu-induced intestinal mucositis of mice

WANG Can-hong1,2, HE Xiao-shan2,ZHANG Li-jing1,HUO Xiao-wei1,LIU Dong-yu1, HAN Jia-yuan1, LI Li-yong1, CAO Li1

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China;2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,China)

Key words:carboxymethylpachyman；antioxidant；fluorouracil；intestinal mucosal inflammatory；intestine propulsion；intestinal protection

Abstract:AimTo evaluate the mucosal-protective effects of carboxymethylpachyman(CMP) on Fluorou-

收稿日期:2015-12-04,修回日期:2016-02-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題—早期成藥性評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)(No 2012ZX09501001-004)；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)—綜合性新藥研究開(kāi)發(fā)技術(shù)大平臺(tái)—?jiǎng)?chuàng)新藥物研究開(kāi)發(fā)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)(No 2012ZX09301-002-001-026)

作者簡(jiǎn)介：王燦紅(1986-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理與應(yīng)用，E-mail: xinzhuangjianpo@163.com； 曹麗(1966-)，女，博士，研究員，研究方向：天然藥物抗腫瘤藥理學(xué)，Tel：010-57833222，E-mail: lcao@implad.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.009

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0484-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R322.45；R516.101；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.018.html