嚴(yán)　燦，劉銀偉，吳麗麗，祝鵬輝，潘　毅

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，廣東 廣州　510060；2.南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)學(xué)院，河南 南陽(yáng)　473004)

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加味四逆散調(diào)控抑郁癥大鼠海馬BDNF、NR1表達(dá)及促進(jìn)海馬DG區(qū)神經(jīng)再生的研究

嚴(yán)燦1，劉銀偉2，吳麗麗1，祝鵬輝1，潘毅1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，廣東 廣州510060；2.南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)學(xué)院，河南 南陽(yáng)473004)

摘要：目的研究加味四逆散對(duì)抑郁癥大鼠海馬BDNF、NR1表達(dá)的調(diào)控及促進(jìn)海馬DG區(qū)神經(jīng)再生的效應(yīng)及機(jī)制。方法建立慢性應(yīng)激性抑郁癥模型。采用熒光標(biāo)記的免疫組化方法檢測(cè)海馬DG區(qū)NeuN、BrdU、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NR1)的表達(dá)水平。原位雜交技術(shù)檢測(cè)海馬DG區(qū)BDNF表達(dá)水平。結(jié)果慢性應(yīng)激能抑制海馬DG前體細(xì)胞的增殖(P<0.01)；抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)BDNF表達(dá)明顯下降(P<0.01)，NR1的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。JWSNS和氟西汀能明顯增加抑郁癥大鼠海馬DG單位面積中神經(jīng)元數(shù)目和新增殖細(xì)胞量(P<0.01)，增強(qiáng)海馬DG區(qū)BDNF的表達(dá)(P<0.01)和降低NR1的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論JWSNS能夠促進(jìn)抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，并可能通過(guò)增強(qiáng)BDNF的表達(dá)和降低NR1的表達(dá)，促進(jìn)海馬DG區(qū)的神經(jīng)再生。

關(guān)鍵詞：抑郁癥；海馬；齒狀回；神經(jīng)再生；加味四逆散；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、N-甲基-D-天冬氨酸受體1

成年中樞神經(jīng)再生(neurogenesis)是指哺乳動(dòng)物成年后中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)為基礎(chǔ)借助適宜環(huán)境產(chǎn)生成年新生神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程[1]。海馬齒狀回(dental gyrus，DG)的顆粒細(xì)胞下層(subgranular cell zone，SGZ)是成年神經(jīng)再生的最主要腦區(qū)之一 。近年來(lái)大量的研究提示，抑郁癥可能與成年海馬神經(jīng)再生下調(diào)引起海馬結(jié)構(gòu)可塑性的改變有關(guān)[2]。因此，抑制或者逆轉(zhuǎn)海馬萎縮，誘導(dǎo)海馬成體干細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)DG 區(qū)的神經(jīng)再生，已經(jīng)成為抗抑郁研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

我們前期的研究證實(shí)，中藥復(fù)方加味四逆散(Jiaweisinisan，JWSNS)具有確切的抗抑郁效應(yīng)[3-4]，本研究將通過(guò)觀察JWSNS對(duì)應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)再生以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain -derived neurotrophic factor，BDNF)和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)1(NR1)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討JWSNS抗抑郁的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1慢性應(yīng)激性抑郁癥模型采用慢性不可預(yù)計(jì)輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)動(dòng)物模型[5]并加以改進(jìn)：接受應(yīng)激處理的大鼠單獨(dú)放在一間房間內(nèi)，在21 d內(nèi)隨機(jī)接受不同類型的應(yīng)激刺激。應(yīng)激原包括：限制空間1 h、45°斜籠7 h、濕籠17 h(200 g鋪料倒100 mL水，使墊料濕透)、新入侵者(兩籠并籠)23 h、持續(xù)光照36 h、空瓶1 h、禁食禁水23 h。造模前：所有大鼠單籠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。d 1：接受雙瓶訓(xùn)練，一瓶是1%(W/V)的蔗糖水(放置在鼠籠的左側(cè))，一瓶是純水(放置在鼠籠的右側(cè))，訓(xùn)練48 h (d 1 9 ∶30至 d 3 9 ∶30)；d 3： 9 ∶30開始禁食禁水23 h，至d 4 8 ∶30；進(jìn)行1 h糖水消耗實(shí)驗(yàn)。根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體重情況進(jìn)行分組。造模期：每天8 ∶30灌胃，模型組與正常組分房飼養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)。d 1 9 ∶30～10 ∶30限制空間1 h。d 2, 20 ∶30,至d 3, 8 ∶30持續(xù)光照36 h。d 3, 9 ∶30～ 16 ∶30 45°斜籠7 h。d 4, 9 ∶30,至d 5, 8 ∶30,兩籠并籠，新入侵者23 h。d 5, 9 ∶30,開始禁水3 h，12 ∶30～13 ∶30空瓶1 h,15 ∶30,至d 6, 8 ∶30濕籠17 h。d 6, 16 ∶00至d 7 15 ∶00開始禁食禁水23 h。d 8 8 ∶30至d 9 20 ∶30持續(xù)光照36 h。d 10 9 ∶30至d 11 8 ∶30兩籠并籠，新入侵者23 h。d 11 9 ∶30開始禁水3 h，12 ∶30～13 ∶30空瓶1 h；15 ∶30～16 ∶30限制空間1 h。d 12 9 ∶30～16 ∶30 45°斜籠7 h；16 ∶30至d 13 9 ∶30濕籠17 h。d13 9 ∶30至d 14 8 ∶30開始禁食禁水23 h。d 14 15 ∶30～16 ∶30限制空間1 h。d 15 9 ∶30至d 16 8 ∶30兩籠并籠，新入侵者23 h。d 16 8 ∶30至d 17 20 ∶30持續(xù)光照36 h。d 18 9 ∶30開始禁水3 h，12 ∶30～13 ∶30空瓶1 h，15 ∶30至d 19 8 ∶30濕籠17 h。d 20 9 ∶30～16 ∶30 45°斜籠7 h。16 ∶00至d 21：15 ∶00開始禁食禁水23 h。d 21 15 ∶00～16 ∶00開始糖水消耗實(shí)驗(yàn)(包括測(cè)體重)。

1.2動(dòng)物及分組給藥SPF級(jí)Wistar大鼠，♂性，體質(zhì)量180～220 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0039901。大鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，在光暗周期為12h，溫度為(23±2)℃的安靜環(huán)境適應(yīng)并訓(xùn)練共計(jì)2周后，根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體重情況進(jìn)行分組。分為4組：正常組(Control，不施加任何刺激)、模型組(Model)、 JWSNS組(JWSNS，每天早上8 ∶30灌胃中藥復(fù)方JWSNS，每次2 mL，相當(dāng)于臨床成人用藥劑量的2倍)和鹽酸氟西汀組(fluoxetine hydrochloride，每天早上8 ∶30灌胃1mL·(100 g)-1，相當(dāng)于臨床成人用藥劑量的1倍)。正常組及模型組每次灌胃等量蒸餾水。其中正常組大鼠與其余各組大鼠分房飼養(yǎng)。

1.3主要藥品、試劑及儀器JWSNS由柴胡、白芍、枳殼、枸杞子、干地黃等組成。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材。將中藥制成粗粉，按比例取以上中藥粗粉加8倍量水浸泡30 min，沸騰后文火加熱30 min汁；第2煎直接加6倍量水煎煮，沸騰后文火加熱30 min取汁。合并兩次所得藥液，4層紗布過(guò)濾，待稍冷卻后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液至含生藥1.69×103g·L-1藥液常溫冷卻后，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。鹽酸氟西汀膠囊由Patheon France生產(chǎn)，禮來(lái)蘇州制藥有限公司提供，規(guī)格：20 mg/粒，產(chǎn)品批號(hào)：8147A，用生理鹽水將膠囊內(nèi)粉末配制成0.18 g·L-1混懸液，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?-溴-2-脫氧脲苷(5-BrdU)：購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：20080126。4%多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080103。中性樹膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20080513。DEPC購(gòu)自AMRESCO公司，批號(hào)：080210。Triton X-100購(gòu)自AMRESCO公司，批號(hào)：080723。驢血清購(gòu)自廣州蕊特生物科技有限公司，批號(hào)：080816。兔來(lái)源BrdU抗體購(gòu)自北京博奧森公司，批號(hào)：bs-0917R。Alexa Fluor?488 donkey anti-rabbit IgG購(gòu)自MP(invitrogen)公司，批號(hào)：439378。Mouse Anti-NeuN購(gòu)自Millipore公司，批號(hào)：LV1519148。Alexa Fluor?594 donkey anti-mouse IgG購(gòu)自MP(Invitrogen)公司，批號(hào)：56568A。BDNF原位雜交試劑盒、DAB染色試劑盒、原位雜交專用PBS均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Rabbit polyclonal to BDNF購(gòu)自Abcam公司，批號(hào)76313。Rabbit polyclonal to NMDAR1 a/b/c/d購(gòu)自Abcam公司，批號(hào)：73676。主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABORATA4000，德國(guó)Heidolph公司)；冰凍切片機(jī)(CM 1850型，德國(guó)Leica公司)；超純水器(Nexpower 1000，韓國(guó)Human coporation公司)；pH計(jì)(59000-20，美國(guó)COLE-PARMER公司)；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(1X 71，日本OLYMPUS公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media-Cybornetics，美國(guó))。

1.4糖水消耗實(shí)驗(yàn)所有大鼠在完成1周的單籠飼養(yǎng)適應(yīng)后，接受1周的雙瓶訓(xùn)練，每日清晨添加糖水或純水。之后所有大鼠禁食禁水23 h，進(jìn)行1 h糖水消耗實(shí)驗(yàn)，測(cè)量基礎(chǔ)糖水偏愛度和基礎(chǔ)體重。經(jīng)過(guò)禁食禁水23 h后，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的d 21 15 ∶00～16 ∶00再次進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)，測(cè)量造模后糖水偏愛度和體重。糖水偏愛度/%=造模后糖水偏愛度/基礎(chǔ)糖水偏愛度×100%。

1.5大鼠海馬DG區(qū)NeuN、BrdU表達(dá)檢測(cè)距離實(shí)驗(yàn)取材前3 d(每天固定同一時(shí)間)連續(xù)使用BrdU腹腔注射(每次用量：50 mg·kg-1，臨用時(shí)用滅菌生理鹽水配制成濃度為10 g·L-1水溶液)。制備冰凍切片：3.5%水合氯醛〔35 mg·(100 g)-1，即1 mL·(100 g)-1〕腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水10 min后換用4%多聚甲醛液(pH 7.14)灌注30 min，斷頭取腦。腦組織放入4%多聚甲醛，4℃環(huán)境下后固定4 h。取出后用PBS表面沖洗2次，再浸入30%的蔗糖PBS溶液中脫水過(guò)夜。組織塊下沉后取出，ORC包埋冷凍后使用冷凍切片機(jī)在距離前囪3.14～4.52 mm的范圍內(nèi)連續(xù)冠狀切片，片厚20 μm。把切片加載至多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片，室溫干燥后放入-20℃冰箱保存。免疫組化熒光標(biāo)記程序：將盛載標(biāo)本的切片盒從-20℃轉(zhuǎn)置4℃平衡30 min，再轉(zhuǎn)置室溫平衡30 min?？乖迯?fù)：用耐高溫塑料盒盛600 mL檸檬酸鹽緩沖液放入高壓鍋，不加壓力閥，加熱至液體沸騰，將切片放入沸騰的緩沖液中，加壓力閥，繼續(xù)加熱3 min至噴氣。冷卻至室溫取出，用蒸餾水洗5 min，PBS/0.1% Triton洗5 min×3次。冰上用1 mol·L-1HCl孵育10 min，打開待標(biāo)記組織細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)。用2 mol·L-1HCl在室溫下孵育10 min，然后轉(zhuǎn)入37℃濕盒內(nèi)孵育20 min。用0.1 mol·L-1硼酸緩沖液在室溫下處理12 min，PBS洗5 min。用5%驢血清(PBS/0.1% Triton、1 mol·L-1甘氨酸稀釋)室溫下封閉60 min。小心吸去樣品周圍液體，用混合一抗工作液(PBS/0.1% Triton稀釋。NeuN稀釋比例1 ∶200；BrdU稀釋比例1 ∶350)4℃孵育過(guò)夜。PBS洗5 min×3次。用混合二抗工作液(PBS/0.1% Triton稀釋，稀釋比例均為1 ∶400)，室溫下避光孵育2 h。PBS洗(避光)5 min×3次。用50%甘油碳酸鹽緩沖液封片，避光放置30 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。圖像的采集和分析：用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行采集和分析。采集過(guò)程中在同一視野下分別切換Olympus 1X71顯微鏡的WB、WG激發(fā)濾光片激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記物Alexa Fluor?488、Alexa Fluor?594，對(duì)采集到的圖像分組(同一視野下的2張片為一組)以16位灰度圖形模式進(jìn)行保存。分析時(shí)用Image-Pro Plus軟件載入所保存的圖片，按照軟件使用指南用顏色通道工具對(duì)同組的2張圖片進(jìn)行重疊，將所有照片反相(Invert Image)后在DG區(qū)創(chuàng)建AOI，分別計(jì)算AOI區(qū)域BrdU和NeuN的平均光密度，間接進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的分析。

1.6大鼠海馬DG區(qū)BDNF表達(dá)檢測(cè)制備冰凍切片的步驟同上，然后將切片盒從-20℃轉(zhuǎn)置4℃平衡30 min，再轉(zhuǎn)置室溫平衡30 min。免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記程序，一抗工作液：BDNF用PBS/0.25% Triton稀釋，稀釋比例1 ∶150。其余步驟同上。原位雜交DAB染色程序：將切片盒從-20℃轉(zhuǎn)置4℃平衡30 min，再轉(zhuǎn)置室溫平衡30 min。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：室溫下用0.6% H2O2處理30 min，蒸餾水洗滌3次。消化：室溫下切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1 mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)消化2 min，原位雜交用PBS洗5 min×3次，蒸餾水洗1次。后固定：室溫下用1%多聚甲醛/0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2～7.6，含有0.1% DEPC)固定10 min，蒸餾水洗滌3次。預(yù)雜交：每張切片加20 μL預(yù)雜交液連同濕盒放入40℃恒溫箱2 h，吸取多余液體。雜交：每張切片20 μL雜交液，放入38℃恒溫箱雜交過(guò)夜。雜交后洗滌：揭掉蓋切片，37℃水溫2×SSC洗滌5 min×2次；37℃ 0.5×SSC洗滌15 min×1次；37℃ 0.2×SSC洗滌15 min×2次。封閉：滴加封閉液放入37℃恒溫箱30 min，甩去多余液體。滴加生物素化鼠抗地高辛放入37℃恒溫箱60 min，原位雜交用PBS洗5 min×4次。滴加SABC放入37℃恒溫箱20 min，原位雜交用PBS洗5 min×3次。滴加生物素化過(guò)氧化物酶放入37℃恒溫箱20 min，原位雜交用PBS洗5 min×4次。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒(1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻)顯色20～30 min，充分水洗。封片觀察：酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。圖像的采集和分析：步驟同上。

1.7大鼠海馬DG區(qū)NR1免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記檢測(cè)制備冰凍切片步驟同上，將切片盒從-20℃轉(zhuǎn)置4℃平衡30 min，再轉(zhuǎn)置室溫平衡30 min。免疫組織化學(xué)熒光標(biāo)記程序，一抗工作液：NMDA R1用PBS/0.25% Triton稀釋，稀釋比例1 ∶50。其余步驟同上。圖像的采集和分析：步驟同上。

2結(jié)果

2.1各組大鼠糖水偏愛度的變化與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛度明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，JWSNS組和Fluoxetine hydrochloride組大鼠糖水偏愛度沒有下降(P<0.01，Tab1)。

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsmodel

2.2各組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖情況的比較海馬部位的CA3區(qū)和DG區(qū)為NeuN陽(yáng)性標(biāo)記的集中區(qū)，BrdU陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞散在海馬各處，以

**P<0.01vscontrol；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel；##P<0.01vsFluoxetine hydrochloride

CA3區(qū)和DG區(qū)最為集中。模型組、JWSNS組以及Fluoxetine hydrochloride組BrdU標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度值均低于正常組(P<0.01)，JWSNS組和Fluoxetine hydrochloride組的平均熒光強(qiáng)度值高于模型組(P<0.01)。

模型組和西藥組的NeuN標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值明顯低于正常組(P<0.01)。JWSNS組平均熒光強(qiáng)度值明顯高于模型組(P<0.05)和Fluoxetine hydrochloride組(P<0.01)。

BrdU-NeuN聯(lián)合標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值的比較結(jié)果表明，模型組高于正常組(P<0.01)。BrdU-NeuN聯(lián)合標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值與BrdU標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值比值的比較結(jié)果表明，模型組、JWSNS組以及Fluoxetine hydrochloride組均明顯高于正常組(P<0.01)。JWSNS組明顯低于模型組(P<0.01)和Fluoxetine hydrochloride組(P<0.05，Tab2，F(xiàn)ig 1)。

A line：nerve cells tagged by NeuN；B line：proliferated cells tagged by BrdU；C line：A and B. The 1 st row：Control；The 2 nd row：Model；The 3 rd row：JWSNS；The 4 th row：Fluoxetine hydrochloride

2.3各組大鼠海馬DG區(qū)BDNF表達(dá)的比較海馬BDNF陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域主要集中于CA3區(qū)和DG區(qū)。與正常組相比，模型組BDNF表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度值明顯減弱(P<0.01)。與模型組相比，JWSNS組和Fluoxetine hydrochloride組平均熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.01)，BDNF表達(dá)增強(qiáng)。與Fluoxetine hydrochloride組相比，JWSNS組BDNF表達(dá)明顯增高(P<0.01，F(xiàn)ig 2，3)。

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsmodel；##P<0.01vsFluoxetine hydrochloride

A：Control；B：Model；C：JWSNS；D：Fluoxetine hydrochloride

2.4各組大鼠海馬DG區(qū)NMDAR1表達(dá)的比較海馬NMDA R1陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域主要集中于CA3區(qū)和DG區(qū)。與正常組相比，模型組NMDA R1表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度值明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，JWSNS組和Fluoxetine hydrochloride組平均熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01)，NMDA R1表達(dá)減弱。JWSNS組與Fluoxetine hydrochloride組相比，差異無(wú)顯著性(Fig 4，5)。

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsmodel

A：Control；B：Model；C：JWSNS；D：Fluoxetine hydrochloride

3討論

海馬是情緒整合和高級(jí)精神活動(dòng)中樞，海馬DG區(qū)的顆粒細(xì)胞下層存在的神經(jīng)前體細(xì)胞 (neuronal progenitor cells，NPCs)可逐漸增殖、分化、遷移進(jìn)入顆粒層，產(chǎn)生樹、軸突并不斷發(fā)生可塑性變化，與周圍神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，整合到海馬功能的神經(jīng)環(huán)路中。各類研究證實(shí)應(yīng)激和抑郁癥患者的海馬體積發(fā)生改變，表現(xiàn)為海馬萎縮及神經(jīng)元的減少[6]。雖然目前尚未清楚海馬萎縮與抑郁癥之間的因果關(guān)系，但研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥在細(xì)胞水平產(chǎn)生的一個(gè)明顯效應(yīng)就是促進(jìn)成年海馬的神經(jīng)再生[7]。因此，成熟腦海馬神經(jīng)再生是抑郁障礙治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

BrdU標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值主要反映單位面積中新增殖細(xì)胞的量的多少，而NeuN標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度值主要反映單位面積中神經(jīng)細(xì)胞的量的多少。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)中處于增殖狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量以及單位面積的神經(jīng)元數(shù)量出現(xiàn)下降，說(shuō)明慢性應(yīng)激能抑制海馬前體細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷和再生障礙。JWSNS和氟西汀能增加DG單位面積中神經(jīng)元數(shù)目和新增殖細(xì)胞量，具有促進(jìn)海馬神經(jīng)再生的效應(yīng)。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain -derived neurotrophic factor，BDNF)廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，具有神經(jīng)再生和修復(fù)功能。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激和促抑郁條件會(huì)導(dǎo)致海馬部位 BDNF 表達(dá)減少，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加，再生能力降低[8]。大鼠DG區(qū)注入BDNF 可以增加神經(jīng)再生，并能在行為學(xué)上產(chǎn)生抗抑郁的效果；阻斷BDNF 的表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)，海馬DG區(qū)的神經(jīng)再生受到抑制，并出現(xiàn)抑郁癥相關(guān)的行為學(xué)改變[9]。因此，中樞BDNF 表達(dá)水平的升高或降低與人或動(dòng)物抑郁樣行為的表現(xiàn)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)BDNF表達(dá)下降，而JWSNS和氟西汀能增強(qiáng)抑郁癥大鼠BDNF的內(nèi)源性合成和分泌表達(dá)。

谷氨酸是一種重要的興奮性中樞神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸調(diào)控的突觸及神經(jīng)可塑性在抑郁癥的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)及抑郁癥的治療中都非常關(guān)鍵[10]。研究表明，其在精神分裂癥、情感障礙和神經(jīng)發(fā)育障礙中都占有重要的地位。谷氨酸受體分為離子型和代謝型，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是離子型的谷氨酸受體。NMDA 受體(NR)的亞基按基因型分為：NR1、NR2(A、B、C 和D)和NR3(A和B)3個(gè)家族，其中，NR1 為NR必需的功能亞基，而亞單位NR1、NR2B與抑郁癥的關(guān)系最為密切[11]。應(yīng)激可導(dǎo)致海馬細(xì)胞外谷氨酸濃度的增加，使NR過(guò)度激活，NR興奮時(shí)主要引起Ca2+、Na+內(nèi)流以及K+外流， 從而引起胞內(nèi)信號(hào)通路激活，而過(guò)量的鈣離子內(nèi)流則會(huì)引起神經(jīng)元的死亡，導(dǎo)致抑郁的發(fā)生[12]。激活NR可以抑制海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，阻斷此受體會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果。NR通過(guò)配體門控性Ca2+超載介導(dǎo)海馬的神經(jīng)再生過(guò)程。因此內(nèi)源性的谷氨酸水平和 NR的活性是維持神經(jīng)再生的重要因素[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激使大鼠海馬DG區(qū)NR1的表達(dá)明顯升高，從而對(duì)DG區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性作用。JWSNS和氟西汀能逆轉(zhuǎn)NR1的過(guò)度表達(dá)，減弱神經(jīng)興奮性毒性作用，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率，促進(jìn)海馬神經(jīng)再生。

綜上所述，JWSNS能夠促進(jìn)慢性應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，并能通過(guò)增強(qiáng)BDNF表達(dá)和降低N R1表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)海馬DG區(qū)神經(jīng)再生的效應(yīng)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)基礎(chǔ)理論治則治法實(shí)驗(yàn)室完成，參與人員除論文作者外，還有王劍研究員、碩士生劉書考、任雪梅，在此一并致謝！)

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Regulatory of Jiaweisinisan on expression of hippocampal BDNF,NR1 and dental gyrus neurogenesis in rats with chronic stressed-depression

YAN Can1，LIU Yin-wei2，WU Li-li1，ZHU Peng-hui1，PAN Yi1

(1.DeptofBasicTheoryofTraditionalChineseMedicine，GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guanzhou510060,China;2.ZhangzhongjingChineseMedicineCollege，NanyangInstituteofTechnology，Henan473004，China)

Key words：depression；hippocampus；dental gyrus；neurogenesis；jiaweisinisan；brain -derived neurotrophic factor；N-methyl-D-aspartate receptor 1

Abstract：AimTo study the regulatory of Jiaweisinisan on expression of hippocampal BDNF, NR1 and dental gyrus (DG) neurogenesis in rats with chronic stressed-depression and its possible mechamisms.MethodsChronic unpredictable mild stress was used to establish the rat model of stressed depression. The expression of BrdU, NeuN, brain -derived neurotrophic factor(BDNF) and N-methyl-D-aspartate receptor1(NR1)in hippocampal dental gyrus were detected by fluorescently labeled immunohistochemical method. In addition，BDNFmRNA was detected by in situ hybridization.ResultsChronic stress could inhibit the proliferation of neural precursors in hippocampal DG (P<0.01)；the expression of BDNF decreased significantly in DG in model rats(P<0.01)，while the expression of NR1 increased significantly(P<0.01). JWSNS and Fluoxetine hydrochloride significantly enhanced the amount of new proliferating cells and the number of neurons in unit area of DG(P<0.01)，increased the expression of BDNF(P<0.01) and decreased the expression of NR1 in DG(P<0.01).ConclusionJWSNS could promote the neuronal proliferation in hippocampal DG of rat with chronic stressed-depression，and may exert an effect of promoting the proliferation of neurons in hippocampal DG by enhancing the expression of BDNF and decreasing the expression of NR1.

收稿日期:2015-11-09,修回日期:2016-02-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30500660)

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)燦(1970-)，男，博士，教授，研究方向：情志致病機(jī)理與中醫(yī)藥防治，Tel：020-39358032，E-mail：yancan999@sina.com; 吳麗麗(1973-)，女，博士，教授，研究方向：情志致病機(jī)理與中醫(yī)藥防治，通訊作者，Tel：020-39358032，E-mail：13822218911@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.025

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0569-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R289.5；R322.81；R749.42；R971.43

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.050.html