楊婷婷 劉辰庚 王培昌

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053)

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MicroRNA作為阿爾茨海默病標志物的研究進展

楊婷婷 劉辰庚 王培昌

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053)

阿爾茨海默?。荒X脊液miRNA；血清miRNA；AD標志物

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，早期癥狀表現(xiàn)為短期記憶喪失、失語、方向感下降，隨著病情的發(fā)展會出現(xiàn)各種神經(jīng)精神癥狀，行為異常，生活不能自理，直至死亡〔1,2〕。隨著社會發(fā)展,老齡化速度的加快,AD的患病率也逐漸上升〔3〕。據(jù)統(tǒng)計，全世界65歲以上人口患有AD為5 000多萬,并且估算2020年將增加50%〔3,4〕。我國AD人數(shù)達500萬，數(shù)據(jù)顯示，60歲人群中患病率為5%，80歲為20%〔5〕。目前AD已經(jīng)成為威脅老年人健康的第四大殺手，其死亡率僅低于心腦血管疾病、腫瘤和腦卒中，嚴重危害老年人的身體健康和生活質(zhì)量〔6〕。由于AD發(fā)病時間較晚，并且沒有特異性指標，早期很容易被忽略，很多患者被確診時已發(fā)展至癡呆階段。而患者一旦進入癡呆階段，將面臨無有效治療方法可用的尷尬。故力求在癡呆前階段對AD進行診斷和預警并進行治療干預已成為AD學界的共識。

1 MicroRNA與AD

MicroRNA(miR)是一種長度為20～24個核苷酸的5'端帶磷酸基團、3'端帶羥基的內(nèi)源性非編碼小RNA，在生物體內(nèi)具有重要作用。利用生物信息學的方法估計生物體內(nèi)約有1/3編碼蛋白的基因受miR的調(diào)控〔7〕。已有多項研究表明，miR與AD有很重要的關(guān)系。miR在細胞實驗中能調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(APP)的表達及影響Aβ沉積〔8～11〕，在AD的轉(zhuǎn)基因小鼠模型里也檢測到miR對AD的影響〔12,13〕。miR還能夠影響Tau蛋白的過度磷酸化〔14〕,細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1)被認為是Tau蛋白磷酸化過程中的關(guān)鍵酶，在鼠的神經(jīng)細胞中miR-15家族能調(diào)節(jié)ERK1的表達，從而影響Tau蛋白磷酸化的過程。而在AD患者的腦中miR-15家族的表達量明顯減少，可見miR通過影響Tau蛋白的磷酸化在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用〔15〕。故miR可能成為AD治療工具和診斷特別是早期診斷的標志物。

2 腦脊液 miR檢測分析及研究進展

早在2008年，Cogswell等〔16〕通過實驗和查文獻等方法揭示了腦內(nèi)變化的miR可通過淀粉樣作用、神經(jīng)生成、胰島素抵抗及先天性免疫方面的途徑影響AD的發(fā)病機制；而且發(fā)現(xiàn)CSF的miRs和腦內(nèi)miR的變化一致；腦脊液又具有取材方面的優(yōu)點，因此在腦脊液中尋找特異性miRs是可行的，為尋找診斷AD 的早期標志物帶來了一種思路。

2013年，胡國艷等〔17〕利用miR芯片就10例AD患者和認知正常老年人腦脊液的miR表達譜進行檢測和初步生物信息學分析，用Real-Time PCR驗證miR芯片檢測結(jié)果。結(jié)果miR芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在AD患者和認知正常老年人腦脊液中共有128個差異表達miR，其中63個上調(diào)，下調(diào)65個；另外，應(yīng)用Real-Time PCR對miR-125b和miR-132這2個上調(diào)miR進行了驗證，結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，因此認為AD患者腦脊液具有特異性的miR表達譜，提示可能在 miR表達環(huán)節(jié)找到新的AD分子標志物。

2014年，Kiko等〔18〕用qRT-PCR的方法檢測了6種(miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-34a、miR-125b和miR-146a)在AD患者腦中變化很大的miR，據(jù)報道，AD患者腦中miR-29a和miR-29b的減少，導致了腦中BACE1表達的增加，然而在本實驗中發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦脊液中miR-29a和miR-29b明顯高于正常對照組，因此猜想腦脊液中miR-29a和miR-29b可能來源于大腦，這些miRs可能是AD患者的大腦中分泌到腦脊液中去的，但是具體的原因仍待進一步證實。miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者腦中明顯升高，但在本實驗中發(fā)現(xiàn)miR-34a、miR-146a和miR-125b在AD患者腦脊液中是顯著減少的。因此認為AD患者腦中miR-34a、miR-146a和miR-125b是不能被分泌到發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液中的。同樣在AD患者腦中富含miR-9，但是在AD患者腦脊液卻沒有miR-9水平的變化。提示可能是這些miR的釋放方式不同。這個實驗為進一步探索腦脊液中AD分子標志物提供了可能。

2015年van Harten等〔19〕發(fā)現(xiàn)miR-139-5p、miR-519-3p和miR-181-5p在AD病人的腦脊液中表達水平比較低，而miR-590-5p和miR-223-5p在AD病人的腦脊液中表達水平增高。在65歲以上的遲發(fā)性AD中，7種miR呈現(xiàn)出明顯的不同，在65歲以下的早發(fā)型AD中12種miR呈現(xiàn)出明顯的不同miR-532-3p在早發(fā)型AD中有重要作用。經(jīng)過各種實驗證實，認為在遲發(fā)性AD中l(wèi)et-7a最可能成為標志物，并認為let-7a功能上可能與APP的表達有關(guān)。而在早發(fā)型AD中則認為miR-532-3p最可能。

同年Müller等〔20〕通過定量PCR，檢測腦脊液中miR-27a、miR-29a、miR-29b和miR-125b的含量及通過血細胞刺激法分析發(fā)現(xiàn)，在無細胞的腦脊液中，miR-27a的水平與對照組無明顯差異，這與之前研究的AD病人腦脊液中miR-27a的表達水平降低是不同的，一種可能的原因是腦脊液中細胞的影響。而AD病人無細胞腦脊液中miR-29a的表達水平是顯著上調(diào)的，有效區(qū)別了對照組與AD患者。但是當腦脊液中有血細胞影響時，miR-29a的表達水平卻出現(xiàn)明顯下降。AD病人無細胞腦脊液中miR-125b是輕微上調(diào)的，但是它基本不受腦脊液血細胞的影響。而且實驗發(fā)現(xiàn)miR-27a和miR-29a的水平受腦脊液中血細胞的影響是十分迅速的，這對腰穿檢測無細胞腦脊液中這些miR帶來了巨大的挑戰(zhàn)，盡管如此，miR-29a還是一個有希望的AD 分子標志物〔20〕。

3 血清 miR檢測分析及研究進展

在2012年有學者研究發(fā)現(xiàn)在大部分AD患者的血清中miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29a和miR-29b的水平下調(diào)〔21〕，為尋找血清學AD診斷標志物提供了依據(jù)，2014年Tan等〔22〕用qRT-PCR的方法對miR-9、miR-29a、miR-29b、miR-101、miR-125b和miR-181c進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-125b和miR-181c的水平下調(diào)，而miR-9的水平是上調(diào)的。并且繪制受試者工作特征曲線顯示miR-125b具有68.3%的特異性和80.8%的敏感性，更重要的是血清中miR-125b的水平與AD患者的MMSE評分呈負相關(guān)。因此認為miR-125b可能成為AD的無創(chuàng)血清標志物。

2014年，Tan等〔23〕用qRT-PCR的方法檢測了6種(miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p)在AD患者與對照組具有明顯差異的miR。其中miR-342-3p的改變最具敏感性和特異性，且血清中miR-342-3p的含量越高，患者的認知能力下降越嚴重，病程越長，這可能對疾病的發(fā)展和預后判斷提供了幫助。2015年Xie等〔24〕用qRT-PCR方法定量檢測了miR-206、miR-132、miR-193b、miR-130b、miR-20a、miR-296和miR-329的水平，發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-132在MCI患者血清中明顯升高；ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-132的聯(lián)合檢測產(chǎn)生最大的曲線下面積。他們還應(yīng)用TargetScan等生物信息檢索系統(tǒng)預測靶基因，用DAVID方法識別生物學過程。生物信息顯示BDNF和SIRT1是miR-206和miR-132的靶基因。在MCI的患者血清中BDNF和SIRT1的表達下調(diào)與miR-206和miR-132的上調(diào)是一致的。BDNF 和 SIRT1與學習和記憶功能有關(guān)。因此認為miR-206和miR-132的聯(lián)合檢測可能成為MCI患者的最佳血清學標志物。同年，Dong〔25〕又用高通量測序技術(shù)篩查了AD與正常對照組血清中的miR的表達情況，并在個體水平用RT-qPCR方法證實了發(fā)生改變的miR。結(jié)果顯示與對照組相比，AD患者血清中有四個miR(miR-31、miR-93、miR-143和miR-146a)發(fā)生顯著性降低。應(yīng)用ROC曲線分析方法顯示這四種miR可能成為AD潛在的標志物。

4 外吐小體內(nèi)miR檢測對AD診斷的價值

2015年，本實驗室使用超速離心法提取癡呆期AD患者(DAT)、輕度認知障礙患者(MCI)和健康對照組血清和腦脊液外吐小體并檢測其miR-193b水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCI和DAT患者腦脊液及血清外吐小體內(nèi)miR-193b水平均低于對照組，且DAT組低于MCI組，差異均有統(tǒng)計學意義〔26〕。因此認為血清外吐小體內(nèi)miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標志物。但該研究仍屬于小樣本研究且未納入pre-MCI受試者，因此外吐小體內(nèi)miR是否能夠成為AD的早期診斷標志物有待于進一步研究。

體液miR的來源眾多，包括凋亡和壞死的組織細胞的miR釋放。細胞的被動滲漏和主動分泌等〔27〕。人體中運輸miR的載體主要包括蛋白；脂蛋白以及微囊泡和外吐小體等。其中外吐小體可在分泌細胞的支配下主動轉(zhuǎn)運特定的miR，此類循環(huán)miR可看做是某些細胞經(jīng)由外吐小體這一載體向靶細胞發(fā)送的信息，那么他的表達是否具有專一性，能否成為AD檢測的標志物呢，有待于我們?nèi)パ芯俊?/p>

而且雖然目前尚無直接的證據(jù)證實miR能自由的通過血腦屏障，但研究表明組成血腦屏障的細胞可主動分泌微囊泡和外吐小體〔28,29〕，這些微囊泡和外吐小體內(nèi)可能包含有腦組織向外周組織或是外周組織向腦組織所傳遞的信號。因此，了解外吐小體內(nèi)miR表達水平的變化可能較體液總miR測定更有利于疾病的診斷和治療監(jiān)測。

5 結(jié) 語

越來越多的研究表明，體液miR對于AD的診斷和治療具有較大的潛在價值〔30,31〕。雖然CSF直接接觸腦組織，較血液尿液而言其更能反映中樞系統(tǒng)的病理生理改變，但臨床醫(yī)生和檢驗工作者不得不面對的是，對于已經(jīng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀的AD患者，其神經(jīng)心理學評分往往已經(jīng)出現(xiàn)異常，這時對其進行CSF的抽取和檢驗往往得不到患者和家屬的認可。故血液、尿液等較易獲得的體液標本中是否存在能作為AD特別是早期AD檢測標志物將成為AD診斷研究領(lǐng)域的一個熱點。

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〔2016-01-19修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學基金青年基金(No.81401734)

王培昌(1965-)，男，教授，博士生導師，主要從事衰老及相關(guān)疾病機制研究及標志物篩選。

楊婷婷(1992-)，女，碩士，主要從事衰老及相關(guān)疾病標志物篩選研究。

R741.02

A

1005-9202(2016)20-5190-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.124