倪方方，王博林，宋騰蛟，袁小鳳（浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江杭州　310053）

納米銀顆粒的毒性效應及作用機制研究進展

倪方方，王博林，宋騰蛟，袁小鳳
（浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江杭州310053）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.002.html

納米銀（AgNP）是指粒子直徑在1～100 nm的金屬銀單質，現已廣泛應用于多個領域。研究發(fā)現，AgNP的毒性特征與其粒徑大小有一定的關系，粒徑越小，毒性越強，一般來說20 nm左右毒性最強。進入機體后在體內各器官均有分布，但濃度有明顯差異，有的在腎臟中還表現出性別差異。AgNP進入生物機體各器官會產生一定的毒性效應。AgNP對體外細胞的毒性往往表現出劑量效應，而體內實驗中，其毒性效應會隨著作用對象及作用方式的不同而不同。此外，AgNP還會產生一定的生殖毒性，使親代生殖特性降低，并可通過母體胎盤傳遞到子代體內，對子代的生長發(fā)育造成一定的影響。AgNP毒性作用機制主要通過產生自由基導致器官的氧化應激損傷；藥酶代謝活力降低導致代謝障礙；亦有相關基因表達的缺陷，及某些分子如轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）所致的蛋白酶表達異常。總之，AgNP可對生物有機體產生毒性，我們在應用的同時要對其生物安全性進行評價，最大程度地減少甚至避免其對我們的損害。

納米銀顆粒；粒度特性；體內分布；毒性效應；氧化應激；Nrf2；酶代謝活力

近年來，納米技術迅猛發(fā)展，納米材料已經廣泛應用于各個領域。納米銀顆粒（silver nanoparticles，AgNP）作為一種最常見的納米材料，其在各方面的應用價值已經得到了廣泛的認可。目前，AgNP已被廣泛應用于醫(yī)療保健、食品、化妝品、紡織品及其他各種生活日用品等領域［1-3］。由于銀顆粒自身的毒性、納米尺寸效應及銀離子的可調釋放性，使得AgNP溶液具有較高的抑菌及殺菌性，與此同時，也使AgNP具有一定的生物毒性。與普通銀相比，AgNP在電學、光學和催化等眾多方面具有更優(yōu)異的性能。科技的迅猛發(fā)展帶來的是產品的更替，人們在日常生活中接觸到AgNP的機會越來越多，特別是在醫(yī)學領域，AgNP產品可直接應用于人體與皮膚、血液接觸。因此，有必要研究AgNP的毒性機制，對其安全性作出評價，才能更好地應用于臨床?；谝陨显颍疚膶gNP的毒性機制研究現狀做一綜述。

1　AgNP顆粒暴露途徑及其毒性劑量效應

1.1機體暴露AgNP顆粒的途徑AgNP是金屬納米材料中的典型代表，近年來AgNP產品的產量不斷攀升，由于其特殊的性能，已被廣泛應用于各個領域。如銀功能化紡織品及塑料制品［4］、AgNP食物儲存盒［5］、AgNP抗菌廚具［6］、Ag-NP保鮮袋［7］等。如此一來，AgNP便可通過呼吸道、消化道、皮膚甚至生殖道等途徑進入機體。在AgNP對機體的毒性實驗研究中，有學者通過口服［8］、吸入［9］、水溶液接觸［10］、鼻內灌注［11］、靜脈注射［12］、腹腔注射［13］、皮膚接觸［14］及陰道灌注［14］等方式研究了AgNP對機體造成的毒性。結果表明，無論AgNP以何種方式與機體接觸，均可能對機體產生一定程度的毒性效應。

1.2AgNP毒性劑量效應體外實驗發(fā)現，AgNP粒子對細胞的毒性影響呈現出劑量效應。一般來說，低劑量無毒性，只有達到一定的劑量才會產生毒性作用，只是不同的細胞產生毒性的劑量不同。Kawata等［16］將AgNP作用于人肝癌細胞HepG2時，劑量低于0.5 mg·L-1不僅無毒，反而會促進細胞增殖，而劑量高于1.0 mg·L-1則產生明顯的細胞毒性。用AgNP感染人外周血單核細胞PBMCs發(fā)現，1～3 mg ·L-1AgNP并未對血凝素介導的細胞增殖產生抑制；而大于3 mg·L-1時可對干擾素γ和腫瘤壞死因子α水平產生明顯抑制；濃度達10 mg·L-1時可明顯降低細胞因子5水平［17］。

體內實驗中，王醒等［18］發(fā)現，AgNP凍干粉口服對小鼠的最大耐受濃度為6 mg·kg-1。Park等［19］發(fā)現小鼠口服AgNP溶液高于1 mg·kg-1時，堿性磷酸酶及谷草轉氨酶水平明顯升高。當改變給藥方式，通過鼻內灌注則發(fā)現0.1 mg·kg-1水平即會對SD大鼠小腦神經膠質細胞造成損害［11］。此外，給藥方式相同也會因研究對象不同而產生不同的劑量效應。例如，Seiffert等［20］通過鼻內滴注的方法研究了0.1 mg·kg-1的AgNP溶液對BN及SD大鼠的肺毒性，而在相同的處理條件下，BN大鼠出現了嚴重的嗜中性及嗜酸性粒細胞反應，SD大鼠僅在d 1出現輕微的嗜中性粒細胞反應。綜上所述，AgNP的毒性效應不僅與其濃度有關，還與作用對象及暴露方式有關。

2　AgNP顆粒的粒度特性及其體內分布

2.1粒度特性AgNP的毒性取決于其粒度大小、形狀、化學合成、表面積及表面電荷等，尤其是粒度特性影響最大。研究表明，AgNP的毒性大小與其粒徑有一定的關系，即粒徑小的AgNP顆粒更容易進入細胞，從而產生更高的毒性效應。與微米銀相比，AgNP進入小鼠體內之后，可造成小鼠肝的毒性效應，使肝細胞凋亡［21］；不同粒徑的AgNP對生物產生的毒性效應不同，研究發(fā)現，5～20 nm的AgNP對生物的毒性效應大于其它粒徑的AgNP［22-24］。

此外，AgNP的性質極不穩(wěn)定，在溶液中易發(fā)生團聚，使粒度大小增加，結果就必然會影響其特性。因此，在實驗中需充分考慮到影響其穩(wěn)定性的因素。目前的研究中為了增加溶液的穩(wěn)定性，采用檸檬酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮及胎牛血清等來包裹 AgNP，對保持其顆粒的穩(wěn)定有一定的成效［12，25-26］。

Cha等［21］比較了13 nm的AgNP及2～3.5 μm的微米銀對小鼠肝毒性的影響，結果顯示AgNP造成了小鼠肝細胞凋亡，而微米銀并未產生細胞毒性。Ivask等［22］研究10、20、40、60和80 nm的AgNP對細菌、酵母、藻類、甲殼類及哺乳動物細胞毒性的影響，發(fā)現10 nm粒徑的毒性最強。在人類細胞如肺細胞、肝癌細胞、胃細胞及乳腺細胞的毒性實驗中，發(fā)現5 nm大小AgNP表現出了更強的細胞毒性［23］。Gliga等［24］發(fā)現10 nm的AgNP對人類肺細胞有最強毒性，而Hamilton等［27］的研究則表明，20 nm的AgNP對人類肺細胞及巨噬細胞的毒性最強。總之，與其他較大粒徑金屬AgNP相比，5～20 nm的金屬AgNP普遍表現出更高的細胞毒性。

2.2體內分布迄今為止，一般采用電感耦合等離子體質譜來研究AgNP在鼠、兔子、魚、果蠅等動物體內器官的分布特性。研究發(fā)現，高濃度AgNP進入動物體內會在一些器官中累積，從而造成相應毒性。已經證實，AgNP進入家兔體內之后，在肝、腎、脾、肺、腦、睪丸及胸腺中均有分布［25］。其進入老鼠體內之后，在脾中含量最高，其次為肝、肺、腎［28］，其中肝和心對AgNP毒性反應最敏感［8］。AgNP的分布不僅表現出器官差異，還表現出性別差異。有研究表明，AgNP在♀鼠腎中的含量遠高于♂鼠［29-31］。除此之外，AgNP還可穿過血腦屏障，對腦組織造成損害［19］，亦可穿過胎盤屏障進入子鼠體內［32-34］。

3　AgNP的毒性效應

一般來說，由于納米粒徑太小，機體不能很好地抵抗AgNP對機體的損害，這就使得AgNP可以通過呼吸道、消化道、皮膚等各種途徑到達體內，從而產生一定的毒性效應。目前，AgNP對肝及肺的毒性效應是研究的熱點。

在AgNP對肝的毒性研究中，體內實驗顯示，AgNP進入鼠體內之后，會造成肝的氧化應激損傷［8，12］，產生炎癥反應［35］，出現肝水腫及肝細胞質的松散［28］，亦可導致肝細胞變性、退化、壞死甚至凋亡［13］。體外細胞毒性實驗顯示，Ag-NP可抑制肝微粒體代謝酶CYP2C和CYP2D的活性，進而導致肝功能異常［36］。由此可以看出，肝作為有機體“最大的化工廠”，可將體內的異物代謝降解，從而阻止異物在體內循環(huán)，正因為如此，AgNP對機體的毒性效應均會表現出肝臟毒性。有趣的是，Faedmalekia等［37］發(fā)現 AgNP對肝癌細胞HepG2的復制產生了強烈的抑制作用，由此推斷AgNP可能成為新一代的抗癌藥物。

在AgNP對肺的毒性研究中，有學者通過氣管滴注的方式使其進入大鼠體內，結果發(fā)現，AgNP造成了血-肺泡上皮透過屏障的損害，產生氧化應激，激活嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞，使其數量明顯升高，進而導致炎癥細胞因子如白細胞介素13及免疫球蛋白E的產生，介導炎癥反應［20］。通過其他方式如靜脈注射進入體內后，AgNP造成了小鼠肺部炎癥細胞浸潤，并出現肺泡壁增厚等病理改變［28］。體外細胞實驗中，通過給予人肺A549細胞20 nm的AgNP，結果導致白細胞介素8（IL-8）的分泌明顯升高，提示細胞產生了炎癥反應［38］。而對人肺細胞給予10 nm AgNP，結果肺細胞的 DNA出現了損傷，從而造成了肺細胞的毒性效應［24］。

AgNP的生殖毒性研究中，體外細胞實驗顯示，AgNP造成了大鼠胚胎細胞基因表達的差異，誘導了胚胎細胞MMP3的明顯高表達，從而可能造成細胞各種生物學功能的障礙和細胞基質的嚴重破壞［39］。同樣，AgNP可使斑馬魚的胚胎孵化時間延長，幼魚體長減小，產生發(fā)育畸形等形態(tài)學變化［40］。體內生殖毒性實驗中，研究表明，母體孕期暴露Ag-NP可造成肝的氧化應激損傷［41］，并可通過胎盤屏障或母乳傳遞至子鼠體內［33-35］。AgNP還可對♂大鼠的生殖系統(tǒng)產生一定的影響，減少大鼠附睪精子數量，使睪丸精小管的形態(tài)發(fā)生改變，且精子數量的減少呈現出了一定的時間、粒度及劑量的依賴性［42］。AgNP亦可降低大鼠頂體精子及質膜的完整性，使線粒體活性降低，精子的畸形率增加，從而使青春期的開始時間延遲［43］。

此外，AgNP還可造成其它器官的毒性，如腎、心、腦、脾等。體外人腎細胞HEK293的毒性實驗顯示［44］，AgNP造成了腎細胞DNA氧化應激損傷。體內實驗中［8］，AgNP使大鼠心臟部位的超氧離子產生增多，產生氧化應激，造成了心臟的損傷。腦神經的毒性實驗中［45］，體外實驗選用大鼠小腦顆粒神經元細胞（CGCs），實驗顯示，AgNP暴露可誘導神經細胞內氧化水平升高，進一步啟動半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）通路，實現依賴凋亡途徑的細胞毒性效應；活體動物實驗表明，AgNP對SD大鼠具有一定的神經毒性，其毒性機制可能與小腦區(qū)域損傷有關。由此可見，AgNP會對機體器官造成毒性已經毋庸置疑，而其毒性的原因多與氧化應激導致的炎癥反應相關。

4　AgNP毒性作用機制

目前，關于AgNP毒性的研究主要包括體內及體外研究兩個方面。體內研究的主要對象為動物，如大鼠、小鼠、魚等；體外研究主要進行的是各類的細胞實驗。相關研究揭示的AgNP的毒性機制主要有如下幾個方面。

4.1個體水平

4.1.1氧化應激水平的改變氧化應激是指機體或細胞內氧自由基的產生與清除失衡，導致活性氧及活性氮在體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程。一般主要通過檢測超氧離子及丙二醛的含量來判斷氧化應激水平的高低。AgNP進入機體之后，被機體當成毒性物質本能地從肝臟中排出，而此過程是由巨噬細胞的內吞作用完成，當機體重復進行此過程的時候導致了肝臟氧自由基的產生，從而產生氧化應激損傷［35］。活性氧的生成及氧化應激能引起一系列的血液生化指標的改變，如膽固醇、ALT/AST、甘油三酯等；導致炎癥反應，進而使炎癥細胞因子如白細胞介素6及α干擾素等產生增加；此外還可產生DNA損害、遺傳突變及腫瘤。相關研究人員進行的AgNP毒性實驗表明，AgNP引起的細胞毒性、炎癥反應、DNA損傷和凋亡均與氧化應激及脂質過氧化物的產生有關［8，44，46-47］。

4.2分子水平

4.2.1酶代謝活力的改變肝藥酶是“肝臟微粒體混合功能酶系統(tǒng)”的簡稱。此酶系是滑面內質網上的一組混合功能氧化酶系，主要能催化許多結構不同藥物氧化過程的氧化酶系。其中最重要的是細胞色素P450單氧化酶系。P450是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，它參與內源性物質和包括藥物、環(huán)境化合物在內的外源性物質的代謝。肝臟是AgNP毒性作用的主要靶向器官，肝臟中的代謝酶如CYP450活性的改變，會對機體的生理功能等造成一定程度的影響。相關研究表明，AgNP降低了CYP450酶的活力而改變了其功能，進而干涉了機體的代謝［48-49］。Kulthong等［14］進行的AgNP對大鼠肝臟CYP450酶活性的影響表明，AgNP對肝藥酶超家族中的細胞色素 2C（CYP2C）及細胞色素 2D （CYP2D）活性產生了強烈的抑制作用，進而影響了肝藥酶的功能；有體外細胞實驗表明，AgNP抑制了角化細胞HaCat及肺細胞A549中硒蛋白的合成，并對硒蛋白合成的關鍵酶硫氧還蛋白還原酶-1的活性產生了抑制［50］；亦有實驗表明，AgNP可改變膽堿酯酶的活力，對乙酰膽堿酯酶（AchE）及丁酰膽堿酯酶（BchE）的活性產生抑制［51］；改變過氧化氫酶結構，提高其活性，從而造成機體各種生理活動及功能的改變［52］。膽堿酯酶及過氧化氫酶活性的改變或許是AgNP毒性的另外可能機制。

4.2.2基因水平的異常AgNP的基因毒性研究發(fā)現，Ag-NP可明顯改變大鼠腦部基因的表達，已經確定大腦有468個基因、小腦有952個基因表達改變是由AgNP引起的，其中，大腦的73個基因、小腦的144個基因的表達產物改變相對較大［49］。而這種基因表達的改變在 Dong等［29］進行的AgNP對大鼠腎臟的基因毒性實驗中也有所體現，此實驗表明，AgNP使大鼠腎104個基因的表達增加了1.3倍。Gliga等［24］研究了10 nm、40 nm及75 nm的AgNP顆粒對人類肺細胞的毒性，結果顯示所有實驗組均產生了DNA損傷。Cha等［21］通過對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞系Huh-7給予AgNP處理，3 d之后，細胞的DNA含量明顯減少，并出現了細胞凋亡，RNA微陣列分析顯示與細胞凋亡及炎癥反應相關的基因已經明顯改變。Huang等［53］進行的大鼠神經細胞毒性實驗顯示，AgNP改變了炎癥應答及免疫應激反應中的免疫介質基因，如趨化因子13（CXCL13）、巨噬細胞膠原結構受體（MARCO）及谷胱甘肽合成酶（GSS）的表達，從而造成了神經細胞變形性的損害及神經紊亂。

4.2.3小分子物質水平的調控轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）是細胞防御過氧化應激的重要調節(jié)因子，可以上調一系列解毒酶和抗氧化蛋白的基因表達，從而減輕活性氧（ROS）和親電子物質介導的細胞損害。在生理狀態(tài)下，Nrf2與其特異性受體Kelch樣ECH相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap 1）結合，在胞質內形成復合物以抑制Nrf2的活性；當機體處于應激等狀態(tài)時，Nrf2與Keap1解離被激活［54］。AgNP可誘導活性氧的產生，發(fā)生氧化應激導致細胞損傷，其可下調肝細胞8-氧橋鳥嘌呤DNA糖基化酶-1（OGG1）的活性，使OGG1 mRNA及蛋白質的表達降低，結果使8-氧橋鳥嘌呤生成增多，從而產生強烈的氧化應激反應，導致DNA損傷［55］。在腸細胞實驗中，AgNP戲劇性地增加了CACO-2腸細胞血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達［56］，而Nrf2在調控OGG1及HO-1的表達中扮演著重要角色。由此可見，Nrf2相關的信號通路在AgNP產生的氧化應激損傷中起著重要作用。在AgNP對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性研究中，有研究發(fā)現，氧化應激是造成秀麗隱桿線蟲生殖毒性的主要機制，而PMK-1 p38絲裂原活化蛋白激酶（PMK-1 p38 MAPK）在氧化應激損傷中發(fā)揮著重要作用，谷胱氨肽S-轉移酶（GST）、缺氧誘導因子（HIF-1）在調控 PMK-1 p38 MAPK的活性中發(fā)揮著重要的作用［57］。

此外，在對AgNP的細胞毒性研究中發(fā)現，當AgNP的濃度增加時，其對細胞中線粒體的毒性效應會增強，從而導致線粒體功能急劇下降，線粒體膜的滲漏、壞死，進而導致細胞凋亡［58］。

5　結語

AgNP作為重要的納米材料，在各領域得到了普遍認可，其應用與生產生活密不可分，尤其是在醫(yī)療領域，作為抗菌劑直接與患者接觸，故在治療的同時，也存在對人體健康的潛在危害。目前的研究表明，AgNP對泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)均發(fā)現有不同程度的副作用；體內及體外的細胞實驗均可推斷，長期低劑量暴露或急性大劑量暴露后，AgNP對人體的各個器官系統(tǒng)也會有不同程度的危害。然而，AgNP毒性的研究目前還不全面，還有許多問題有待解決。首先，AgNP的物理化學參數表征、實驗染毒方式、劑量、時間等的科學依據，以便結果的可比性；其次，探討納米材料在不同介質中性質以及狀態(tài)的變化，尋找使AgNP保持穩(wěn)定性的方法，比如在體內的聚集性會影響納米材料原來的性質；再次，在看到AgNP臨床療效明顯的同時，應該更加關注其毒性的潛在危害，了解AgNP對人體各系統(tǒng)的影響及其作用機制，從而為安全使用AgNP提供理論依據。

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Toxic effect and mechanism of silver nanoparticles

NI Fang-fang，WANG Bo-lin，SONG Teng-jiao，YUAN Xiao-feng
（College of Life Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou310053，China）

Silver nanoparticles（AgNP），the metallic silver particles with the diameter of 1～100 nm are now widely used in many fields.Many researches show that the smaller size of Ag-NP，the stronger toxicity it shows.Generally speaking，AgNP with 20 nm shows strongest toxicity.After entering the body，they are distributed in different organs in the body，and the distribution in the kidney shows a certain gender difference.They also produce some toxic effects after entering body organs.AgNP often exhibit dose effect on the toxicity in vitro cells，while in vivo experiments，their toxic effects change with the different objects and ways of acting.In addition，AgNP can produce toxic effects on reproduction，and may cause parental reproductive activity to deteriorate，and pass the toxic effects to offspring through the placenta to exert a negative influence on the growth and development of the offspring.The toxicity mechanisms of AgNP are oxidative stress injury caused by producing free radicals；metabolic disorders caused by reducing of drug metabolic enzyme activity；and also related gene expression defects and certain molecules，such as transcription factor NF-E2-related factor 2（Nrf2）protease caused by abnormal expression.In short，AgNP can be toxic to organisms，and we must evaluate their biological safety when we use it，to minimize or even avoid the danger it brings about.

AgNP；size character；distribution in body；toxicity；oxidative stress；Nrf2；metabolic enzyme activities

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.001

A

1001-1978（2016）05-0593-06

R-05；R114；R321.4；R348.3；R394.2；R916.3

2016-01-05，

2016-02-10

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（No 201474286）；浙江省自然科學基金資助項目（No LY16H280006）

倪方方（1990-），女，碩士生，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：641534898@qq.com；袁小鳳（1976-），女，博士，副教授，研究方向：微生物與生化藥學，通訊作者，E-mail：13184220300@163.com