劉　楊，薛　薇，李　敏，齊文淵，高　妍，胡　欣，李可欣（衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京　100730）

LC-MS/MS法測定腦透析液中人參皂苷Rg1濃度及對(duì)其體內(nèi)和體外探針回收率的考察

劉楊，薛薇，李敏，齊文淵，高妍，胡欣，李可欣
（衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京100730）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.050.html

目的建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，用于測定腦透析液中人參皂苷Rg1的濃度，并基于該方法考察Rg1在體外及大鼠海馬、腦室的體內(nèi)探針回收率，為Rg1在大鼠腦內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。方法高效液相色譜采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），以甲醇-水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.4 mL·min-1?？疾毂痉椒ǖ奶禺愋?、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度以及穩(wěn)定性。分別采用將探針置于不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液以及將探針植入對(duì)應(yīng)腦區(qū)后通入不同濃度灌流液的方法，考察微透析探針對(duì)人參皂苷Rg1的體外以及體內(nèi)回收率，并進(jìn)一步比較兩者間的差異。結(jié)果人參皂苷Rg1的保留時(shí)間為1.91 min，線性范圍為0.1～50 μg·L-1，日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于15%。微透析探針對(duì)人參皂苷Rg1的體外回收率為（4.05±0.28）%，體內(nèi)回收率為（26.96± 4.45）%，且在9 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論LC-MS/MS法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于大鼠腦微透析樣品中人參皂苷Rg1的濃度測定。探針對(duì)Rg1的體外回收率可能受溫度等多因素影響而低于體內(nèi)回收率，因此體內(nèi)回收率更接近體內(nèi)透析環(huán)境和過程，是校正透析液濃度的可靠方法。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；人參皂苷Rg1；微透析；探針回收率；體外；體內(nèi)

人參自古被稱為益智良藥，其主要藥理活性成分為人參皂苷［1］，其中人參皂苷Rg1為一種原人參三醇型皂苷［2］。大量研究表明，人參皂苷Rg1與改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)病變［3］、促進(jìn)神經(jīng)再生［4-5］、激活學(xué)習(xí)記憶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［6-8］和提高神經(jīng)可塑性［9-10］等關(guān)系密切，由于其主要作用部位為腦，因此考察其在學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的吸收程度尤為重要。目前較常用的考察腦內(nèi)藥物濃度的方法為微透析方法［11］，然而檢測到的微透析液中藥物濃度不等同于腦內(nèi)真實(shí)藥物濃度，因此需進(jìn)行探針回收率校正?？疾焯结樆厥章室话惴譃轶w內(nèi)和體外兩種方法［12］，本文即通過建立LC-MS/MS法測定大鼠腦脊液中人參皂苷Rg1的濃度，進(jìn)而考察探針體外與體內(nèi)回收率，并比較兩者之間的差異，為今后進(jìn)一步研究其在各腦區(qū)中的分布奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1藥品與試劑復(fù)方氯化鈉注射液（Ringer’s，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司），人參皂苷Rg1對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量93.4%，批號(hào)110703-201128），紫杉醇（中國食品藥品檢定研究院，含量99.6%，批號(hào)100382-201102），甲醇（美國Fisher公司），超純水（法國 Millipore公司 Milli-QA10 Synthesis制備）。

1.2儀器AB API 5000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（ESI）（美國AB SCIEX公司）；SHIMADZU 20AD高效液相色譜儀，含LC-30AD型二元液相泵（日本島津公司）。

1.3動(dòng)物清潔級(jí)Sprague Dawley大鼠（北京，維通利華公司），♂，250～300 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

2　方法

2.1LC-MS/MS法檢測透析液中Rg1濃度

2.1.1溶液配制人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液的配制：精密稱取人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品10.72 mg，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶解并定容至50 mL，制成200 mg·L-1的Rg1儲(chǔ)備溶液。

紫杉醇（內(nèi)標(biāo)）溶液的配制：精密稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品10.35 mg，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶解并定容至50 mL，制成200 mg·L-1的紫杉醇儲(chǔ)備溶液。

2.1.2生物樣品預(yù)處理精密量取10 μL微透析樣品置于1.5 mL PCR離心管中，加入10 μL甲醇混勻后，再加入100 μL紫杉醇（內(nèi)標(biāo)）溶液，混勻，加入進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣。

2.1.3色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters）；流動(dòng)相：A相：水，B相：甲醇；流速：0.4 mL·min-1；洗脫程序：0～0.5 min 10% ～90%甲醇，0.5～2.5 min 90%甲醇，2.5～2.7 min 90% ～10%甲醇，2.7～3.5 min 10%甲醇，總分析時(shí)間為3.5 min，梯度流速恒定為0.4 mL·min-1，柱溫：40℃；自動(dòng)進(jìn)樣器：4℃；進(jìn)樣量為10 μL。

樁基工程是房屋建筑工程領(lǐng)域中的重要組成部分，承載著房屋建筑結(jié)構(gòu)支撐、房屋地基承載力提升的重要使命，其施工質(zhì)量的高低直接影響房屋建筑施工質(zhì)量與使用安全、穩(wěn)定與可靠。對(duì)此，在當(dāng)前房屋建筑項(xiàng)目規(guī)?；?、大數(shù)量、多樣化發(fā)展背景下，需明確認(rèn)知與掌握樁基施工技術(shù)，加強(qiáng)質(zhì)量檢測，以提升樁基施工質(zhì)量，為房屋建設(shè)奠定良好基礎(chǔ)。

2.1.4質(zhì)譜條件電噴霧電離源（ESI），離子源電壓：5500 V，離子源溫度：500℃；離子源氣體1（N2）壓力：50 psi（1 psi≈6.9 kPa）；離子源氣體2（N2）壓力：60 psi；氣簾氣（N2）壓力：20 psi；碰撞氣壓（CAD）壓力：7 psi；去簇電壓（DP）均為200 V；碰撞電壓（EP）均為20 V；射入電壓（2CE）：47 V（Rg1），32 V（內(nèi)標(biāo)紫杉醇）；碰撞室射出電壓（CXP）：20 V （Rg1），14 V（內(nèi)標(biāo)紫杉醇）；正離子模式檢測；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；待測物離子反應(yīng)分別為：m/z 823.5→m/z 643.7（Rg1），m/z 876.9→m/z 308.5（內(nèi)標(biāo)紫杉醇）。

2.2人參皂苷Rg1的探針回收率考察

2.2.1體外探針回收率考察用Ringer’s溶液配制成濃度為25 μg·L-1人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液，將探針置于其中，平衡2 h后，每30 min收集1次樣品，共收集3個(gè)樣品。以同樣的方法采集探針外液濃度（CECF）分別為50、100 μg·L-1的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液的透析樣品，并測定對(duì)應(yīng)透析液中Rg1濃度（Cdialysate），計(jì)算公式為：R（in vitro）=Cdialysate/CECF×100%。

2.2.2大鼠體內(nèi)探針回收率考察♂ SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，每組灌流液濃度（Cperfusate）分別為1、10、50 μg·L-1，定位腦區(qū)均為腦室（LV）及海馬（HIP）。將大鼠麻醉，定位側(cè)腦室（前鹵后0.8 mm，旁開2.4 mm，硬膜下3.4 mm）以及海馬（前鹵后5.6 mm，旁右開5.0 mm，硬膜下5.2 mm）后，在腦區(qū)內(nèi)埋置探針引導(dǎo)管，將接受以上手術(shù)的大鼠正常飼養(yǎng)3 d后，依次將兩個(gè)探針植入導(dǎo)管抵達(dá)兩目標(biāo)腦區(qū)，再將探針連入由Ringer’s溶液配制的對(duì)應(yīng)濃度的人參皂苷Rg1灌流系統(tǒng)，灌流液流速調(diào)至1.5 μL·min-1，平衡2 h后開始微透析液的收集工作，每0.5 h收集1次樣品，共收集9 h。其計(jì)算公式為：R（in vivo）=［（Cperfusate-Cdialysate）/Cperfusate］× 100%。

3　結(jié)果

3.1方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1特異性按“2.1.2”樣品預(yù)處理方法處理空白R(shí)inger's溶液、空白R(shí)inger's溶液加人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品、空白R(shí)inger's溶液加內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品、大鼠腦微透析樣品。采用“2.1.3”及“2.1.4”中色譜、質(zhì)譜方法檢測并比較。結(jié)果表明，在選定的條件下，基線噪音小，人參皂苷Rg1與腦內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)得到良好的分離，峰形良好，且與內(nèi)標(biāo)互不干擾。保留時(shí)間為1.91 min，見Fig 1。

3.1.2線性關(guān)系考察精密量取Rg1儲(chǔ)備液適量，用甲醇∶水=1∶1（V∶V）溶液依次稀釋成50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后分別取20 μL，并加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻后進(jìn)樣測定。以待測物峰面積Y為縱坐標(biāo)，待測物濃度X為橫坐標(biāo)，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。由結(jié)果可知，人參皂苷Rg1的線性范圍是0.05～50 μg·L-1。典型標(biāo)準(zhǔn)曲線為：^Y=0.265X+4.65e-007（R2=0.9991）。

3.1.4樣品穩(wěn)定性考察

3.1.4.1儲(chǔ)備液室溫放置穩(wěn)定性從-80℃取出配制濃度為200 mg·L-1人參皂苷Rg1儲(chǔ)備液分裝液，室溫放置10 h后，與新取出的Rg1儲(chǔ)備液各稀釋5份，分別按照“2.1.2”項(xiàng)下樣品預(yù)處理方法進(jìn)行處理，并進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，Rg1放置10 h后與新配制樣品峰面積的RSD（n=5）分別為1.8%及6.3%，比值為0.99，表明Rg1儲(chǔ)備液在室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4.2樣品處理后進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性按“3.1.2”項(xiàng)下方法配制濃度為0.1、2、40 μg·L-13個(gè)濃度質(zhì)控溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后測定，并代入新配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各濃度，12 h后重新進(jìn)樣，并將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。結(jié)果顯示，4℃進(jìn)樣器的放置12 h的處理后的透析液樣品準(zhǔn)確度均在85%～115%之間，表明人參皂苷Rg1處理后在4℃進(jìn)樣器中至少能穩(wěn)定放置12 h。

3.1.4.3樣品短期室溫放置穩(wěn)定性考察用甲醇∶Ringer’s溶液=1∶1（V∶V）配制Rg1 10、200、4 000 μg·L-13個(gè)濃度的樣品各5份，再分別吸取10 μL至990 μL的Ringer’s溶液中，得到Rg1濃度為0.1、2、40 μg·L-1的3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，置于室溫，于2 h后按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣測定，代入新配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，結(jié)果顯示各質(zhì)控點(diǎn)準(zhǔn)確度均在85%～115%之間，表明Rg1樣品在室溫至少能穩(wěn)定放置2 h。

3.2人參皂苷Rg1的探針回收率

3.2.1Rg1體外探針回收率按照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，Rg1體外探針回收率結(jié)果見Tab 2，結(jié)果表明，Rg1在3種濃度標(biāo)準(zhǔn)外液中探針回收率相對(duì)穩(wěn)定。

3.2.2Rg1體內(nèi)探針回收率按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，Rg1在3種灌流液濃度下體內(nèi)探針回收率在9 h內(nèi)的均值見Tab 3，9 h內(nèi)各采樣點(diǎn)的側(cè)腦室及海馬內(nèi)回收率見Fig 2，由結(jié)果可見，Rg1在腦室及海馬以3個(gè)濃度的灌流液得到的回收率差異均無顯著性（P＞0.05），且在9 h內(nèi)回收率較穩(wěn)定。

Tab 2　Probe recovery of Rg1 in vitro（±s）

CECF/Cdialysate/μg·L-1R（in vitro）/ μg·L-11234% 25　1.072　0.976　0.879　0.967　3.91±0.31 50　2.033　2.219　1.977　2.067　4.10±0.20 100　3.865　3.899　4.125　4.357　4.04±0.23

Tab 3　Probe recovery of Rg1 in vivo（±s，n=5）

CperfusateR（in vivo）/% /μg·L-1LV　HIP 1 25.94±9.04　23.62±10.7 10　26.93±5.41　25.89±6.91 50　23.68±5.27　23.72±5.83

Fig 2　Relationship between probe recovery of Rg1 in rats and time（±s，n=5）

4　討論

本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測，靈敏度高，且線性范圍寬。此外，采用的液相方法中，流動(dòng)相為甲醇、水，配制簡單且對(duì)色譜柱損傷小，且該法分析時(shí)間短，同時(shí)該方法具有樣品處理方法簡單、所需樣品量小、可行性高的優(yōu)點(diǎn)。

在采用HPLC-MS/MS方法檢測時(shí)，各組分響應(yīng)在使用正離子模式比使用負(fù)離子模式時(shí)強(qiáng)，靈敏度高，且人參皂苷Rg1及內(nèi)標(biāo)的加鈉母離子［M+ Na］+比其各自的加氫母離子［M+H］+響應(yīng)更高。對(duì)MS/MS方法優(yōu)化后，采用多反應(yīng)離子監(jiān)控模式對(duì)各組分進(jìn)行檢測。

此外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)配制人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)直接用Ringer’s溶液稀釋準(zhǔn)確度差，不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，而增加稀釋液中有機(jī)相比例，有明顯改善。因此推測為Rg1在Ringer’s溶液中溶解度低的原因所致，為方便配制，本實(shí)驗(yàn)最終選擇用甲醇∶Ringer’s溶液=1∶1（V∶V）溶液逐級(jí)稀釋的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。然而由于基質(zhì)不同，標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性有很大差異，因此，本文在考察樣品室溫放置穩(wěn)定性時(shí)，采取先用甲醇 ∶Ringer’s溶液=1∶1 （V∶V）溶液逐級(jí)稀釋到目標(biāo)濃度的100倍，再用Ringer’s溶液將每個(gè)濃度稀釋到目標(biāo)濃度的方法。此外，由于本實(shí)驗(yàn)中的樣品采集后立即進(jìn)行測定，因此未考察樣品長期放置穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)所建立的用于檢測透析液中人參皂苷Rg1含量的LC-MS/MS方法具有簡單快速、靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可用于測定微透析實(shí)驗(yàn)中探針體外及體內(nèi)回收率，并比較兩者間的差異。

微透析方法中，對(duì)采集的透析液濃度進(jìn)行校正、得到腦間質(zhì)液中藥物的真實(shí)濃度是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前探針回收率的測定有多種方法，可分為體內(nèi)和體外兩類方法。本研究根據(jù)給藥后大鼠腦透析液中藥物濃度范圍及對(duì)兩種探針回收率的預(yù)估，分別選擇3個(gè)濃度對(duì)探針進(jìn)行體內(nèi)和體外考察。

影響探針回收率的因素較多，除了受灌流液流速的影響外，還與藥物透過探針的曲折度有關(guān)，藥物透過越曲折，其透過探針的量越少，回收率越低。因此，考察體內(nèi)回收率時(shí)由于探針處于腦組織中，理論上其回收率應(yīng)較體外回收率低。然而，本研究發(fā)現(xiàn)探針對(duì)Rg1的體外回收率較低，而體內(nèi)回收率明顯高于體外回收率，分析原因可能為：藥物透過濃度較高的探針至組織中后，會(huì)受組織中微脈管運(yùn)輸及代謝的作用繼續(xù)向周圍擴(kuò)散，且藥物代謝速率及微脈管轉(zhuǎn)運(yùn)速率越快，藥物擴(kuò)散速率越快，與探針內(nèi)濃度差越大，從而促進(jìn)藥物繼續(xù)透過探針進(jìn)入組織內(nèi)［13］，而體外不存在該作用。此外，探針?biāo)幁h(huán)境溫度也與其回收率有關(guān)，溫度越高，回收率越大，因此體內(nèi)較高的溫度有利于提高探針回收率。綜上所述，以上原因可能導(dǎo)致體外回收率較體內(nèi)回收率低。

由于體內(nèi)回收率的實(shí)驗(yàn)過程更接近在體透析過程，更適于藥代動(dòng)力學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)證明了Rg1的體外回收率與體內(nèi)回收率差異有顯著性，在今后校正腦透析液中Rg1濃度時(shí)，將采用體內(nèi)回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)探針對(duì)Rg1的體內(nèi)回收率在9 h內(nèi)較穩(wěn)定，因此，在考察腦內(nèi)Rg1濃度時(shí)，可直接采取各時(shí)間點(diǎn)回收率的平均值進(jìn)行校正，而不需對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用不同的回收率分別進(jìn)行校正。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了靈敏度高、準(zhǔn)確性好的LC-MS/MS方法，用于測定透析液中Rg1濃度，基于該方法我們考察并比較了探針體外回收率以及大鼠體內(nèi)回收率間的差異。因此，本實(shí)驗(yàn)的研究可為今后準(zhǔn)確測定給藥后各腦區(qū)中透析液中Rg1濃度，并通過回收率校正得到腦內(nèi)真實(shí)濃度奠定基礎(chǔ)，具有一定的研究意義。

（致謝：本課題是在衛(wèi)生部北京醫(yī)院臨床藥理室完成的，感謝史愛欣主任為本課題提供的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)以及對(duì)所遇到困難的耐心解答，同時(shí)感謝李可欣、薛薇等老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助與大力支持。）

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Determination of ginsenoside Rg1 in intracerebral dialysate by LC-MS/MS and comparison of in vivo and in vitro recovery of microdialysis probe

LIU Yang，XUE Wei，LI Min，QI Wen-yuan，GAO Yan，HU Xin，LI Ke-xin
（Dept of Pharmacy，Beijing Hospital，Beijing100730，China）

AimTo establish a LC-MS/MS method to measure the concentration of ginsenoside Rg1 in intracerebral dialysate and compare the probe recovery in vitro and in vivo.MethodsThe assay was conducted with a ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）.The mobile phase consisted of methanol and ultrapure water and it was detected by gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min-1.Specificity，linear range，precision and accuracy，stability were evaluated to investigate the reliability of the method.The recovery of ginsenoside Rg1 in probe in vitro and in vivo was compared.ResultsThe retention time of ginsenoside Rg1 was 1.91 min，the linear range was 0.1～50 μg ·L-1，intra-day and inter-day precisions were less than 15%.The recovery of ginsenoside Rg1 was （4.05±0.28）%in vitro and（26.96±4.45）%in vivo.ConclusionThe LC-MS/MS method is accurate，sensitive，and reproducible for quantitative determination of ginsenoside Rg1 in microdialysate.The probe recovery of ginsenoside Rg1 in vivo is higher than in vitro，and both are stable in different concentrations.

LC-MS/MS；ginsenoside Rg1；microdialysis；probe recovery；in vitro；in vivo

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.025

A

1001-1978（2016）05-0722-05中國圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R322.81；R944.1

2015-12-22，

2016-01-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81303250）

劉楊（1990-），女，碩士，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：liuyang90421@163.com；李可欣（1962-），女，主任藥師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：kexinli6202@163.com