趙潤清，胡　園，李牧函，3，張　靜，4，譚　瀟，劉　屏（1.河北北方學(xué)院藥學(xué)院，河北張家口　075000；.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京　100853；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京　100853；4.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，山西太原　03004）

3，6'-二芥子?；崽锹?lián)合tenuifoliside A協(xié)同抗抑郁作用及其機(jī)制的研究

趙潤清1，2，胡園2，李牧函2，3，張靜2，4，譚瀟2，劉屏2
（1.河北北方學(xué)院藥學(xué)院，河北張家口075000；2.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京100853；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100853；4.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，山西太原030024）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.048.html

目的研究遠(yuǎn)志中3，6'-二芥子?；崽牵―ISS）和tenuifoliside A（TFSA）協(xié)同抗抑郁作用及其初步作用機(jī)制。方法采用經(jīng)典的行為絕望抑郁模型——小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為對照組、陽性藥組、DISS 5、10 mg·kg-1、TFSA 5、10 mg·kg-1、DISS 5 mg·kg-1+TFSA 5 mg·kg-1、DISS 5 mg ·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1、DISS 10 mg·kg-1+TFSA 5 mg ·kg-1和DISS 10 mg·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1；灌胃給藥7 d，觀察DISS和TFSA單體及其合用對小鼠懸尾不動時(shí)間的影響；免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠海馬及皮層內(nèi)BDNF的表達(dá)；蛋白質(zhì)印記法檢測小鼠海馬內(nèi)CRTC1、CREB、p-CREB 及BDNF的表達(dá)。結(jié)果DISS和TFSA及其二者合用均可縮短懸尾小鼠的不動時(shí)間，其中DISS（10 mg·kg-1）和TFSA（10 mg·kg-1）組與單劑量藥物組相比明顯，并穩(wěn)定縮短小鼠懸尾不動時(shí)間（P＜0.05）。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，DISS和TFSA及其合用組均可提高海馬及皮層內(nèi)BDNF的表達(dá)量（P＜0.05），同時(shí)DISS和TFSA及其合用組可增加海馬中CRTC1、CREB、p-CREB及BDNF蛋白的含量，其中合用組明顯高于單藥組（P＜0.05）。結(jié)論DISS與TFSA雙藥合用啟動CREB共轉(zhuǎn)錄因子CRTC1，激活海馬內(nèi)CREB的磷酸化，進(jìn)而增加其下游BDNF表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同抗抑郁作用。

DISS；TFSA；抑郁癥；協(xié)同作用；CREB；BDNF

抑郁癥是嚴(yán)重危害人類身心健康的一類情感性精神障礙疾病［1］。抑郁癥的治療并不樂觀?？挂钟舻幕瘜W(xué)藥物存在一系列問題，如起效慢、易復(fù)發(fā)及諸多不良反應(yīng)［2］。目前，人們將抗抑郁藥物的研發(fā)更多的轉(zhuǎn)向了中醫(yī)藥領(lǐng)域。遠(yuǎn)志在中醫(yī)臨床上經(jīng)常配伍應(yīng)用于情志疾病，其代表方劑如開心散、定志小丸等，在動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中均表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用［3］。

3，6'-二芥子?；崽牵―ISS）和tenuifoliside A （TFSA）作為中藥遠(yuǎn)志中的兩個(gè)寡糖酯活性單體，表現(xiàn)出了良好的抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作用。多項(xiàng)研究顯示，DISS在多個(gè)經(jīng)典的抗抑郁模型（小鼠強(qiáng)迫游泳、小鼠懸尾、大鼠強(qiáng)迫游泳、大鼠不可預(yù)知慢性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)模型）中以及體外模擬的抑郁模型（皮質(zhì)酮損傷SH-SY5Y和C6神經(jīng)細(xì)胞）中，表現(xiàn)出了有明顯的抗抑郁樣作用［4-5］。其機(jī)制可能與增加新生細(xì)胞合成DNA，而減輕皮質(zhì)酮對SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的損傷，提高抑郁模型腦內(nèi)5-HT含量、啟動調(diào)控MAPK 和CaMK通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的磷酸化，激活CRE的活化和轉(zhuǎn)錄，增加CREB的磷酸化，以及提高CREB下游靶基因BDNF的mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)［6-7］。另一個(gè)寡糖酯TFSA對神經(jīng)細(xì)胞也具有明顯的保護(hù)作用，它可通過激活MAPK通路和PI3K通路后，同樣促進(jìn)下游CREB和GSK3β的磷酸化，從而增加其下游的關(guān)鍵蛋白而發(fā)揮作用［8］。本研究首次將DISS 和TFSA兩種寡糖酯聯(lián)合使用，從整體動物層次探討其在治療抑郁中存在的抗抑郁協(xié)同作用關(guān)系，并對其相關(guān)機(jī)制作以初步探討。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑DISS和TFSA（由解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室制備，≥99%）；氟西?。‵LU）標(biāo)準(zhǔn)品，購于美國Sigma公司；一抗：α-Tubulin、CRTC1、CREB、p-CREB、BDNF羊抗兔多克隆抗體，購于美國Abcam公司；二抗：羊抗兔、羊抗鼠，購于美國Bioworld公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器動物行為學(xué)分析系統(tǒng)（上海移數(shù)有限公司）；冷凍離心機(jī)，3K15型，購于美國Sigma公司；DDHZ-300多用途臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Western blot轉(zhuǎn)印槽、電轉(zhuǎn)槽，美國BIO-RAD公司；UVP凝膠成像系統(tǒng)，EC3 Imaging Systems，美國BIO-RAD公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物昆明小鼠，♀、♂各半，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。置于室溫下，12～12 h晝夜循環(huán)光照，自由進(jìn)食、飲水。動物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境5 d后，隨機(jī)分為空白對照組、單藥組（DISS 5 mg·kg-1、DISS 10 mg·kg-1、TFSA 5 mg·kg-1、TFSA 10 mg·kg-1）、聯(lián)合給藥組（DISS 5 mg·kg-1+TFSA 5 mg·kg-1、DISS 5 mg ·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1、DISS 10 mg·kg-1+ TFSA 5 mg·kg-1、DISS 10 mg·kg-1+TFSA 10 mg ·kg-1）、陽性對照氟西汀組（20 mg·kg-1），每組12只，劑量選擇參照文獻(xiàn)［9］。

1.4小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)［10］按照分組給藥，連續(xù)灌胃7 d，于末次給藥30 min后進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)，將小鼠尾端2 cm處固定在懸尾儀吊環(huán)上，使動物呈倒掛狀態(tài)，其頭部對準(zhǔn)儀器攝像頭，采用小鼠懸尾儀器進(jìn)行錄像，小鼠懸掛2 min后，開始錄像監(jiān)測，持續(xù)4 min，記錄4 min內(nèi)小鼠的不動時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后直接斷頭取腦，冰上快速取海馬組織，存放于-80℃冰箱中備Western blot實(shí)驗(yàn)使用，每組剩余的小鼠灌注多聚甲醛做免疫組化。

1.5免疫組織化學(xué)方法測定海馬、皮層內(nèi)BDNF的表達(dá)常規(guī)石蠟切塊，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，抗原熱修復(fù)，加一抗（BDNF 1∶20），4℃過夜；加二抗，37℃恒溫箱，20 min，PBS洗3次，5 min/次；加三抗（辣根酶），37℃恒溫箱，20 min，PBS洗3次，5 min/次，DAB顯色，鏡下觀察。20×物鏡下取海馬和皮層部位攝片，用Image pro軟件檢測其陽性細(xì)胞積分光密度值（integral optical density，IOD）。

1.6小鼠海馬內(nèi)CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測定將海馬組織塊置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加400 μL裂解液（含蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑）于勻漿器中進(jìn)行勻漿，然后置于冰上，幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次，使組織盡量碾碎，裂解20 min后，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，在12 000×g 4℃離心20 min，取上清液于新的EP管中，用BCA蛋白定量法進(jìn)行定量，每組取60 μg進(jìn)行蛋白印記實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1DISS聯(lián)合TFSA對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響如Fig 1所示，與空白對照組相比，DISS（10 mg· kg-1）及TFSA（10 mg·kg-1）組均能不同程度的縮短小鼠懸尾的不動時(shí)間，抑制率分別是26.11%和27.89%（P＜0.05），而DISS（5 mg·kg-1）及TFSA （5 mg·kg-1）組則對小鼠懸尾不動時(shí)間沒有明顯的改善，但DISS與TFSA二者所有劑量合用組都能縮短小鼠懸尾的不動時(shí)間，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗抑郁作用（P＜0.05），且效果與陽性抗抑郁藥氟西?。?0 mg·kg-1）相當(dāng)，其中DISS 10 mg·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1大劑量合用組表現(xiàn)的作用最明顯，抑制率為52.60%（P＜0.05）。

Fig 1　Effects of the administration of DISS and TFSA on the immobility time of mice subjectedto tail suspension test（n=12）

2.2免疫組織化學(xué)法檢測DISS和TFSA及二者合用對小鼠海馬及皮層內(nèi)BDNF蛋白含量變化的影響免疫組織化學(xué)結(jié)果如Fig 2所示，經(jīng)Image pro分析結(jié)果如Fig 3可知，與對照組相比，氟西汀組及DISS（10 mg·kg-1）和TFSA（10 mg·kg-1）組可明顯增加海馬內(nèi)BDNF的表達(dá)（P＜0.05），雙藥合用所有劑量組與其單用相比明顯增加BDNF的表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同加強(qiáng)效應(yīng)；同時(shí)DISS、TFSA單藥及雙藥合用均可提高皮層內(nèi)BDNF的表達(dá)（Fig 4），其中高劑量（10 mg·kg-1）的雙藥合并組最大程度的增加了BDNF的表達(dá)水平（P＜0.05）。

Fig 2　Effects of administration of DISS and TFSA on expressions of BDNF in mice hippocampus and cortex（20×）

Fig 3　Effects of administration of DISS and TFSA on expressions of BDNFin mice hippocampus

Fig 4　Effects of administration of DISS and TFSA onespressions of BDNF in mice cortex

Fig 5　Effects of DISS and TFSA on CRTC1expression in mice hippocampus

Fig 6　Effects of DISS and TFSA on p-CREB/CREB expression in mice hippocampus

2.3DISS和 TFSA及二者合用對小鼠海馬內(nèi)CREB通路相關(guān)蛋白含量變化的影響如Fig 5所示，與空白對照組相比，DISS和TFSA單藥組、合藥組各組均可增加小鼠海馬內(nèi)CRTC1蛋白的表達(dá)，其中DISS 10 mg·kg-1和TFSA 10 mg·kg-1及其合用效果最明顯（P＜0.01）。由Fig 6可知，與對照組相比，氟西汀組及DISS和TFSA各組可明顯增加海馬內(nèi)p-CREB/CREB的表達(dá)（P＜0.05），表明DISS和TFSA均可增加小鼠海馬內(nèi)CREB的活化，誘導(dǎo)p-CREB表達(dá)增加，二者合用組效果與其單藥組相比更加明顯，表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同作用。如Fig 7所示，DISS、TFSA單藥及雙藥合用均可提高海馬內(nèi)BDNF的表達(dá)（P＜0.05），各合藥組與其單藥合用相比明顯的增加BDNF的表達(dá)（P＜0.05），其中高劑量（10 mg·kg-1）的雙藥合并組最大程度增加了BDNF的表達(dá)水平（P＜0.05），這與免疫組化的結(jié)果相一致。

Fig 7　Effects of DISS and TFSA on BDNF expression in mice hippocampus

3　討論

涂海華等［11］發(fā)現(xiàn)某些寡糖酯類化合物可能是遠(yuǎn)志中主要的生物活性物質(zhì)，并可作為抗老化和腦保護(hù)新藥開發(fā)的先導(dǎo)化合物。此次研究采用經(jīng)典絕望模型（小鼠懸尾模型）評價(jià)了遠(yuǎn)志中兩個(gè)寡糖酯TFSA和DISS合用抗抑郁的作用效果。首先在整體動物水平上證明了DISS和TFSA的協(xié)同抗抑郁效果。進(jìn)一步的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，DISS與TFSA聯(lián)用能夠明顯增加CREB相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用。

早在1985年，Steru等提出的懸尾實(shí)驗(yàn)，廣泛作為抗抑郁藥物活性篩選的行為學(xué)檢測方法，因其快速、方便、價(jià)廉、對多種抗抑郁藥物有效，被廣為接受和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)的原理均為將動物置于不可逃脫的環(huán)境中，動物拼命掙扎，企圖逃脫，在經(jīng)過努力仍不能擺脫困境后，出現(xiàn)間斷性不動，顯示“行為絕望“狀態(tài)。這種“行為絕望”狀態(tài)與抑郁癥類似［9，12］。記錄實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生行為絕望過程中的主要參數(shù)，如不動時(shí)間，可用于抗抑郁藥物活性的篩選，絕大多數(shù)抗抑郁藥物均可縮短實(shí)驗(yàn)動物不動時(shí)間。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中DISS（10 mg·kg-1、20 mg·kg-1）和TFSA （10、20 mg·kg-1）可呈現(xiàn)劑量依賴趨勢改善懸尾小鼠的行為學(xué)指標(biāo)，但雙藥大劑量（20 mg·kg-1）的合用并未表現(xiàn)出明顯的抗抑郁協(xié)同作用。本研究小鼠懸尾試驗(yàn)中，DISS與TFSA的低劑量（5 mg· kg-1）對懸尾小鼠行為學(xué)沒有明顯的影響作用，但DISS（5、10 mg·kg-1）與TFSA（5、10 mg·kg-1）合用的抗抑郁作用明顯超過了DISS和TFSA（5、10 mg ·kg-1）單獨(dú)作用，提示DISS與TFSA在小、中劑量（5、10 mg·kg-1）合用時(shí)具有協(xié)同增強(qiáng)作用。同時(shí)DISS（10 mg·kg-1）單獨(dú)作用時(shí)的抗抑郁活性，與課題組前期研究結(jié)果一致［13］，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)TFSA在小鼠懸尾模型中表現(xiàn)出抗抑郁活性。

抑郁癥患者的邊緣系統(tǒng)部分腦區(qū)結(jié)構(gòu)改變、功能受損、神經(jīng)元再生出現(xiàn)障礙，大腦海馬與情感體驗(yàn)和認(rèn)知功能密切，因此由于海馬神經(jīng)元再生障礙導(dǎo)致的抑郁和情緒失控的研究備受關(guān)注。各種神經(jīng)遞質(zhì)作用于大腦特異性腦區(qū)，由CREB等介導(dǎo)的基因表達(dá)，在相應(yīng)腦區(qū)產(chǎn)生一些發(fā)揮保護(hù)性作用的物質(zhì)，如BDNF［14-16］。因此，目前大量的研究聚焦于5-HT和神經(jīng)營養(yǎng)通路中的關(guān)鍵組件轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），作為研究抑郁癥的病因和抗抑郁藥物作用的靶點(diǎn)［17-19］，該通路由上游多條信號通路（主要是MAPK、CaMK和PI3K通路）調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致CREB磷酸化。同時(shí) CREB的共轉(zhuǎn)錄因子之一（CRTC1）受胞質(zhì)Ca2+和cAMP信號的傳感器，以去磷酸化方式活化后，傳遞突觸活動信號到細(xì)胞核介導(dǎo)CRE靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)CRE靶基因的表達(dá)，如BDNF、c-fos、nr4a2等［20］，參與抑郁相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)DISS（5～20 mg·kg-1）對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamicpituitary-adrenal cortex axis，HPA）激素水平具有調(diào)節(jié)作用，但只有中、高劑量（10～20 mg·kg-1）DISS增加抑郁動物海馬中磷酸化CREB表達(dá)，并能提高CREB下游靶基因 BDNF的 mRNA及蛋白的表達(dá)［21］。C6細(xì)胞株和原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)TFSA的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與激活TrkB/BDNF，最終促進(jìn)BDNF表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)針對CREB通路的機(jī)制研究與動物行為學(xué)研究結(jié)果一致，5～10 mg·kg-1DISS與TFSA合用，可明顯增加絕望模型中小鼠海馬區(qū)CRTC1、p-CREB和BDNF的蛋白表達(dá)，比小劑量單藥劑量組效果更好。中藥制劑中不同有效成分，可能通過藥動學(xué)和藥效學(xué)兩方面產(chǎn)生協(xié)同作用?？赡軝C(jī)制包括：多靶向效應(yīng)協(xié)同；改善溶解度、吸收速度及提高生物利用度；消除或中和不良效應(yīng)［22］。推測DISS和TFSA在一定劑量和比例合用時(shí)，在中樞海馬區(qū)CREB相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)通路，產(chǎn)生多靶位協(xié)同增強(qiáng)作用，共同作用提高海馬神經(jīng)元再生和促進(jìn)神經(jīng)元保護(hù)，發(fā)揮抗抑郁作用。

DISS和 TFSA具有類似寡糖酯結(jié)構(gòu)，針對CREB磷酸化通路相關(guān)的兩藥聯(lián)合使用，可以同時(shí)啟動MAPK、CaMK和PI3K通路參與CREB Ser133磷酸化依賴，同時(shí)參與 CTRC1調(diào)控的非CREBSer133磷酸化的下游基因轉(zhuǎn)錄，如BDNF，進(jìn)而多靶位協(xié)同增強(qiáng)CREB-BDNF通路的活性，激活神經(jīng)營養(yǎng)通路和提高海馬的神經(jīng)分化神經(jīng)存活及保護(hù)有關(guān)的基因表達(dá)，比單獨(dú)使用可能取得更明顯的療效。進(jìn)而以達(dá)到降低用藥劑量，提高藥物療效，為其開發(fā)新一代的高效低毒的抗抑郁藥提供了思路，但具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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The administration of DISS and TFSA are used to activate CREB transcription factor CRTC1，and activate the phosphorylation of CREB in the hippocampus，and then increase the expression of BDNF in the hippocampus and plays a synergistic antidepressant effect.

Study on synergistic antidepressant effect of 3，6-disinapoyl
sucrose combined with tenuifoliside A and its possible mechanism

ZHAO Run-qing1，2，HU Yuan2，LI Mu-han2，3，ZHANG Jing2，4，TAN Xiao2，LIU Ping2
（1.Dept of Pharmacy，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei075000，China；2.Dept of Clinical Pharmacology，General Hospital of PLA，Beijing100853，China；3.Dept of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100853，China；4.Dept of Chinese Medicine，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan030024，China）

AimTo study the synergistic anti-depression effect of 3，6-disinapoyl sucrose（DISS）and tenuifoliside A（TFSA）from Radix Polygalae and the preliminarymechanism.MethodsUsing the classicalbehavioral despair and depression model of mouse tail suspension test，120 mice were divided into control group，positive group，DISS 5 mg·kg-1group，DISS 10 mg·kg-1group，TFSA 5 mg·kg-1group，TFSA 10 mg·kg-1group，DISS 5 mg·kg-1+TFSA 5 mg· kg-1group，DISS 5 mg·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1group，DISS 10 mg·kg-1+TFSA 5 mg·kg-1group and DISS 10 mg·kg-1+TFSA 10 mg·kg-1group randomly.They were given intragastric injection for 7 days continuously，to observe the effect of DISS and TFSA monomer and its combination on the time of mouse tail suspension.Expression of BDNF in the hippocampus of mice was detected by immunohistochemistry.The expressions of CREB，pCREB，CRTC1 and BDNF in the hippocampus of mice were detected by Western blot method.ResultsThe administration of DISS and TFSA could shorten the immobility time of mice subjected to the tail.DISS（10 mg·kg-1）and TFSA（10 mg·kg-1）group were significantly lower than single dose drug group（P＜0.05）.DISS and TFSA and the combination groups could increase the expression of BDNF in hippocampus and cortex by immunohistochemistry（P＜0.05）.At the same time，the contents of CREB，CRTC1，pCREB and BDNF protein in the hippocampus were increased by DISS and TFSA，and the combination group was significantly higher than the single drug group（P＜0.05）.Conclusion

3，6-disinapoyl sucrose；tenuifoliside A；depression；synergistic effect；CREB；BDNF

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.024

A

1001-1978（2016）05-0716-07

R-332；R284.1；R322.81；R749.42；R971.43

2016-01-04，

2016-02-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81173579）

趙潤清（1989-），女，碩士生，研究方向：中藥神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：zrq19890316@163.com；胡園（1980-），女，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：huyuan1980619@126.com