侯培鋒，陳　強（福建醫(yī)科大學干細胞醫(yī)學研究院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建福州　350001）

α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌細胞增殖的機制研究

侯培鋒，陳強
（福建醫(yī)科大學干細胞醫(yī)學研究院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建福州350001）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.058.html

α-酮戊二酸二甲酯（DM-2KG）是目前在基礎(chǔ)研究中廣泛被應(yīng)用為養(yǎng)料來營救因營養(yǎng)缺失導致的細胞生長抑制［1］。據(jù)報道，在多種代謝酶發(fā)生突變?nèi)鏘DH1或SDH突變的腫瘤細胞中，當應(yīng)用DM-2KG干預(yù)后，這類代謝物進入細胞后即可轉(zhuǎn)化為PHD活化的輔助因子α-KG，激活PHD酶活性，促進缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白降解［2］，即HIF-1α蛋白的PHD經(jīng)典降解途徑。

在常氧且營養(yǎng)成分充足的條件下，DM-2KG不僅沒有促進癌細胞的生長，反而抑制癌細胞的生長，并能誘導產(chǎn)生一組干細胞樣的癌細胞［3］。本文深入探討其中的發(fā)生機制。

1　材料與方法

1.1材料DM-2KG、去鐵胺、二甲基草酰甘氨酸和環(huán)己酰亞胺（Sigma公司）；MG132（Calbiochem公司）。其他：HIF-1α（BD Bioscience），HIF-2α（Novus Biologicals），anti-Actin（Millipore），anti-CD44（Cell Signaling），anti-Ki67（Abcam），Hoechst 33342（Sigma），Image-Pro6.3軟件（Media Cybernetics），Gallios流式細胞儀（Beckman），TD-20e光度計（Turner）。

1.2方法采用無目標基因的shRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞作為對照和針對HIF-1α的shRNA-沉默MDA-MB-231細胞（MDA-MB-231/shHIF-1α）。采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Cell Signaling）檢測細胞衰老狀況。根據(jù)產(chǎn)品使用指南用ENLITEN? ATP Assay System（Promega，F(xiàn)F2000）測定ATP產(chǎn)量。采用免疫熒光染色和流式細胞術(shù)檢測細胞表面的CD44標志物；免疫熒光染色和成像技術(shù)檢測細胞總CD44標志物。采用乳腺細胞球形成試驗評估癌細胞致瘤能力。

2　結(jié)果

2.1DM-2KG抑制乳腺癌細胞生長經(jīng)DM-2KG培養(yǎng)至10 d，DM-2KG明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖及細胞內(nèi)ATP生成，也可抑制乳腺癌細胞株MCF7的集落生成大小和數(shù)量。MDA-MB-231細胞除癌細胞集落生成受抑制外，癌細胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯的肥大。將獲取的生長抑制的癌細胞集落在沒有DM-2KG的培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)10 d，癌細胞恢復(fù)了增殖和細胞集落形成能力。采用與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶試驗也證實所獲取的生長抑制的癌細胞并非衰老細胞，提示DM-2KG誘導的具備增殖可逆性的生長停滯癌細胞是一靜止休眠期細胞亞群。在營養(yǎng)成分充足的培養(yǎng)液中，DM-2KG對癌細胞的生長起抑制作用。

2.2DM-2KG誘導乳腺癌細胞高表達CD44采用Ki67low和Hochest 33342low雙染法來標記靜止休眠期細胞（G0細胞）。MDA-MB-231細胞經(jīng)DM-2KG干預(yù)4 d后，和對照組比較，G0細胞的比例從12.7% 增大到24.5%，干預(yù)7 d，比例增至31.3%。在MCF7細胞觀察到相似結(jié)果（28.3%vs 45.3%）?？梢?，乳腺癌細胞經(jīng)DM-2KG干預(yù)后可促進癌細胞向G0靜止休眠期細胞轉(zhuǎn)化。并且MDA-MB-231細胞表面表達的CD44水平增加呈時間依賴性趨勢。同樣在MCF7細胞，DM-2KG也可誘導癌細胞表面CD44高表達?？梢奃M-2KG可抑制乳腺癌細胞的增殖，并誘導產(chǎn)生一群細胞大小增大、細胞表面高表達腫瘤干細胞標志物CD44的靜止休眠期細胞。

2.3DM-2KG誘發(fā)乳腺癌細胞靜止休眠狀態(tài)和干細胞樣表型是HIF-1α介導驗證MDA-MB-231/shHIF-1α細胞HIF-1α的敲減效率，采用兩株經(jīng)shRNA干預(yù)過的MDA-MB-231細胞進行干預(yù)。經(jīng)DM-2KG干預(yù)7 d后，MDA-MB-231/ shCON細胞和MDA-MB-231/shHIF-1α細胞相比，前者可明顯獲取更多的靜止休眠亞群癌細胞。DM-2KG明顯增加了MDA-MB-231/shCON細胞總 CD44蛋白的表達，而對于MDA-MB-231/shHIF-1α細胞，DM-2KG干預(yù)前后，總 CD44蛋白水平基本沒有太大改變，提示DM-2KG上調(diào)乳腺癌細胞高表達 CD44是受HIF-1α介導的。可見，HIF-1α在DM-2KG誘發(fā)干細胞樣癌細胞的過程中發(fā)揮重要作用。

3　討論

乳腺癌治療過程中常出現(xiàn)耐藥情況，導致多療程化療后療效變差，對信號通路的研究成為耐藥機制研究的一大熱點［4］。本研究證實常氧條件下，DM-2KG作用于乳腺癌細胞后會使細胞出現(xiàn)假缺氧反應(yīng)，并誘發(fā)癌細胞出現(xiàn)兩個結(jié)局：①DM-2KG抑制乳腺癌細胞的生長，誘發(fā)一亞組處于靜止期的癌細胞；②DM-2KG誘發(fā)一腫瘤干細胞樣的癌細胞亞群，該亞群癌細胞具有自我更新，高致瘤能力等的特點。HIF-1α蓄積會導致乳腺癌細胞增殖停滯，DM-2KG不僅可以調(diào)控乳腺癌細胞向干細胞樣癌細胞轉(zhuǎn)化，而且通過其誘導產(chǎn)生的HIF-1α使一群乳腺癌細胞轉(zhuǎn)化成干細胞樣癌細胞狀態(tài)，而且這群癌細胞具備有強致瘤能力和高腫瘤增殖力。推測DM-2KG通過HIF-1α誘發(fā)產(chǎn)生的靜止期癌細胞可能是乳腺癌細胞向干細胞樣癌細胞轉(zhuǎn)化過程中的一個重要條件。代謝物DM-2KG可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白水平而誘導產(chǎn)生干細胞樣癌細胞。

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［4］ 張梅，袁霞，徐波，等.蛋白酶體抑制劑YSYO1A不依賴NF-κB通路抑制乳腺癌細胞增殖及誘導凋亡研究［J］.中國藥理學通報，2014，30（3）：330-5.

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Mechanism of inhibition of breast cancer cell proliferation by α-dimethyl 2-oxoglutarate

HOU Pei-feng，CHEN Qiang

（Stem Cell Institute for Medical Research of Fujian Medical University，Key Laboratory of Tumor of Translational Medicine of Fujian Province，Dept of Medical Oncology，F(xiàn)ujian Union Hospital，F(xiàn)uzhou350001，China）

α-酮戊二酸類似物；缺氧誘導因子-1α；靜止期細胞；乳腺癌干細胞；脯氨酰羥化酶2；靶點

DM-2KG；HIF-1α；quiescent cell；breast cancer stem cell；PHD2；target

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.029

A文章編號：1001-1978（2016）05-0738-02中國圖書分類號：R329.24；R737.902.2；R916.4

2016-02-15，

2016-03-21

福建省衛(wèi)計委醫(yī)學創(chuàng)新項目（No 2015-CXB-15）

侯培鋒（1976-），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail：peifenghou@sina.com