李順，陳麗香，彭秀華，諸蔣鳴，周曉輝

（1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 215123）

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小鼠肝癌模型研究進(jìn)展

李順1，陳麗香1，彭秀華1，諸蔣鳴2，周曉輝1

（1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 215123）

【摘要】肝癌至今仍是全球高死亡率癌癥之一。動(dòng)物模型特別是小鼠模型是研究肝癌生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、新藥篩選和治療的重要工具。近年來(lái)，各種小鼠肝癌模型的發(fā)展在一定程度上促進(jìn)了肝癌的相關(guān)研究，但是現(xiàn)有模型都有一定不足。缺乏與人類肝癌高度相似且經(jīng)濟(jì)適用的動(dòng)物模型嚴(yán)重制約著對(duì)肝癌的深入研究。隨著基因修飾技術(shù)的發(fā)展，小鼠肝癌模型的構(gòu)建更加快速、容易和方便。本文擬對(duì)用于肝癌研究的各種小鼠模型進(jìn)行概述，并著重強(qiáng)調(diào)基因修飾小鼠肝癌模型的構(gòu)建，以期為相關(guān)癌癥基因功能研究、應(yīng)用基因編輯技術(shù)研發(fā)肝癌模型提供新思路和方向。

【關(guān)鍵詞】肝癌；基因修飾；小鼠模型

世界范圍內(nèi)，肝癌在男女性中分別位居第三和第六大死亡率癌癥，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類健康和生命［1］。全球每年約有700 000新發(fā)肝癌患者和近600 000患者死于肝癌［2］。我國(guó)是全球肝癌發(fā)病率最高和死亡數(shù)最多的國(guó)家，其肝癌患者約占全球的55%。肝癌患者的5年平均存活率低于11%［3］。雖然流行病學(xué)研究表明，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黃曲霉素、酒精、亞硝胺類物質(zhì)等都與肝癌發(fā)病有關(guān)［4］。然而，具體的肝癌發(fā)生的分子機(jī)制和通路仍尚未清楚，構(gòu)建更加合適的可用于人類肝癌研究的動(dòng)物模型有助于解決該問(wèn)題。小鼠的遺傳物質(zhì)和人非常相似，且構(gòu)建小鼠模型成本較低、周期較短、基因修飾技術(shù)更容易實(shí)現(xiàn)，因此小鼠是可用于人類肝癌研究較好的模型動(dòng)物［5］。構(gòu)建可準(zhǔn)確模擬人類肝癌癥狀、又易于獲取、經(jīng)濟(jì)適用的小鼠模型不僅有助于深入探究肝癌發(fā)生和發(fā)病的分子機(jī)制，還可用于檢測(cè)和評(píng)估新的肝癌治療方法和手段，開(kāi)發(fā)新的肝癌醫(yī)學(xué)影像技術(shù)和相關(guān)藥物等，進(jìn)而促進(jìn)將實(shí)驗(yàn)室的肝癌研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用上的目標(biāo)?，F(xiàn)將有關(guān)小鼠肝癌模型研究進(jìn)行概述。

1　致癌物誘發(fā)的小鼠肝癌模型

致癌物誘發(fā)的肝癌小鼠模型經(jīng)常被用于肝癌的研究中。人類致肝癌物可分為兩類：遺傳毒性和非遺傳毒性的致癌物。遺傳毒性致癌物是指能夠與DNA反應(yīng)，引發(fā)DNA損傷而致癌的化學(xué)致癌物；非遺傳毒性致癌物則不直接與DNA反應(yīng)，通過(guò)誘導(dǎo)宿主體細(xì)胞內(nèi)某些關(guān)鍵性病損（如控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化）而導(dǎo)致腫瘤的化學(xué)致癌物［6］。遺傳毒性致癌物二乙基亞硝胺（DEN）是最常用的肝癌誘發(fā)化合物。研究表明，對(duì)12～15 d的B6C3F1雄性小鼠腹腔注射（5 μg/g體重）DEN，平均44周后，100%的B6C3F1雄性小鼠患有肝癌［7］。此外，也有利用高劑量DEN（80～90 μg/g體重）腹腔注射4～5周齡小鼠，但該方法無(wú)前述方法有效。DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型不僅可用于研究肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，還可用于評(píng)估和評(píng)價(jià)治療肝癌的化學(xué)藥物。然而，化學(xué)物誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型雖然可以建立具體的遺傳物質(zhì)改變與致癌物之間的關(guān)系［8］，但是小鼠的性別、年齡、品系和遺傳背景對(duì)肝癌發(fā)生的影響一直是用該方法構(gòu)建模型的瓶頸。

2　肝癌移植性的小鼠肝癌模型

由于肝癌移植小鼠模型適用對(duì)抗癌藥物臨床前評(píng)價(jià)的研究，因此構(gòu)建肝癌移植小鼠模型得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。早期的移植模型主要是通過(guò)同基因品系小鼠腫瘤的移植。隨后，通過(guò)移植人的肝癌細(xì)胞或組織塊到免疫缺陷小鼠中構(gòu)建肝癌模型［9］。例如：無(wú)胸腺和毛發(fā)的裸鼠（缺乏T淋巴細(xì)胞和T、B細(xì)胞功能削弱）［10］；重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficient，SCID）［11］被廣泛用來(lái)構(gòu)建移植瘤模型。1963年，Tang等［12］首次報(bào)道建立人肝癌細(xì)胞系用于移植瘤模型構(gòu)建，隨后 HepG2、Hep3B、SMMC-7721和HuH7等細(xì)胞系也被廣泛地應(yīng)用于肝癌移植瘤模型中。上述這些肝癌的移植小鼠模型可以通過(guò)異位和原位移植。異位移植的實(shí)現(xiàn)主要是通過(guò)移植腫瘤細(xì)胞和組織到小鼠皮下；人肝癌細(xì)胞通過(guò)異位移植到小鼠皮下已經(jīng)廣泛大量地用于抗肝癌藥物的臨床前評(píng)估。腫瘤形成速度快、勞動(dòng)力要求小、成本相對(duì)較低、可無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)到腫瘤大小是異位移植的主要優(yōu)勢(shì)。而原位移植主要是通過(guò)漿膜下注射和外科原位移植（surgical orthotopical implantation）腫瘤塊。外科原位移植腫瘤塊通常大小約為1 mm3，來(lái)源于人肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本或者來(lái)源于皮下生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞塊。有許多研究報(bào)道微環(huán)境在惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中有著非常重要的影響［13］。例如：通過(guò)皮下移植的許多腫瘤細(xì)胞系并不能自發(fā)的發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，而通過(guò)原位移植時(shí)它們可發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，提示腫瘤細(xì)胞與器官特異性因子（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞）的相互作用對(duì)肝癌的發(fā)生非常重要。由于該原因，基于異位模型的治療結(jié)果必須要經(jīng)過(guò)原位移植模型進(jìn)行下一步驗(yàn)證。因此，這些原位移植的模型在腫瘤形態(tài)、微環(huán)境、轉(zhuǎn)移性和對(duì)抗癌藥物的反應(yīng)等方面很好地模擬了人肝癌發(fā)生的情況。但肝癌原位移植模型的缺點(diǎn)是外科移植手術(shù)程序較為復(fù)雜并且價(jià)格昂貴，此外，對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和藥物反應(yīng)的檢測(cè)沒(méi)有異位移植模型容易。盡管通過(guò)異位和原位移植方法構(gòu)建的肝癌模型可以用于臨床前檢測(cè)和評(píng)價(jià)抗癌藥物，但是這些模型在病人實(shí)際抗腫瘤效果上的預(yù)測(cè)價(jià)值較差。這些嚴(yán)重限制了肝癌的移植小鼠模型的用途和價(jià)值。

3　HBV和HCV感染的小鼠肝癌模型

人類的肝癌80%以上是由于乙肝病毒和（或）丙肝病毒感染所致［14］。因此，在過(guò)去的十幾年中，多種乙肝和丙肝病毒性感染的動(dòng)物模型被建立并研究。由于人的HBV和HCV不能誘發(fā)鼠的肝細(xì)胞發(fā)生肝炎，建立這些HBV和HCV的動(dòng)物模型時(shí)通常需要嵌入人肝細(xì)胞。Chisari等［15］在1985年通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法把HBV的DNA序列整合到小鼠的宿主基因組DNA中，從而構(gòu)建HBV感染慢性攜帶者的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。隨后，攜帶由HBV啟動(dòng)子或肝臟特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的HBV基因組和單個(gè)HBV基因（如：表達(dá)表面膜蛋白，X蛋白（HBx），核心蛋白和前核心蛋白）的多轉(zhuǎn)基因小鼠模型被大量建立［16］。利用同樣的方法，表達(dá)HCV多蛋白，單獨(dú)的核心蛋白或結(jié)合包膜蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型隨后也被建立［17］。這些模型可以用來(lái)研究體內(nèi)肝臟損傷和細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并為病毒基因可以起始和促進(jìn)肝腫瘤的發(fā)生提供了確鑿的證據(jù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒外膜大蛋白和X蛋白，HCV的核心蛋白是肝癌發(fā)生的核心因子。然而由于已報(bào)道的HBV和HCV小鼠模型可以引發(fā)自身對(duì)HBV和HCV的免疫耐受，因此這些模型對(duì)肝癌發(fā)生的影響的研究是在缺乏免疫應(yīng)答的情況下進(jìn)行。此外，這些HBV和HCV小鼠模型的肝癌發(fā)生相對(duì)不可預(yù)測(cè)性，且受小鼠品系影響較大，這些方面大大阻礙了用HBV和HCV感染小鼠作為研究肝癌的模型。

4　基因修飾性的小鼠肝癌模型

隨著小鼠基因打靶技術(shù)和基因編輯工具的發(fā)展（如：ZFN（zinc finger nucleases）［18］、TALENs（transcriptionactivator-likeeffectornucleases）［19］和CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated endonuclease cas9））［20］，利用這些技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的基因修飾肝癌小鼠模型已經(jīng)有了相應(yīng)報(bào)道。Dubois等［21］構(gòu)建了人的抗凝血酶啟動(dòng)子III（antithrombin-III）啟動(dòng)的SV40 T-Ag（simian virus 40 T-antigen）的小鼠模型，這些小鼠模型在8月齡時(shí)100%檢測(cè)到有肝癌的發(fā)生，其中10%有肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Murakami等［22］構(gòu)建出在肝臟中同時(shí)過(guò)表達(dá)c-myc和TGF-a的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型（Alb-c-myc/MT-TGF-a）。Santoni-Rugiu等［23］證實(shí)了該雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型在8月齡中，100%的雄性和30%的雌性個(gè)體中檢測(cè)到有肝癌的發(fā)生，并且該雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型比僅過(guò)表達(dá)cmyc或 TGF-a的小鼠要更早、更快地發(fā)生肝癌。Fan等［24］報(bào)道了?；o酶A氧化酶（Aox）敲除小鼠模型，該模型表現(xiàn)出重度脂肪肝，最終導(dǎo)致分散的細(xì)胞死亡，脂肪性肝炎，脂肪瘤和癌癥。此外，Mdr2敲除小鼠模型也有報(bào)道［25］。該模型缺乏可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)卵磷脂到膽小管膜上的肝臟特異性的P-糖蛋白，最終導(dǎo)致炎癥引發(fā)的肝癌的發(fā)生。Lou等［26］構(gòu)建了肝臟特異性條件表達(dá)的SV40 T-Ag小鼠模型，在該小鼠模型中，兩翼帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的終止信號(hào)位于SV40 T-Ag基因的前面，因此該SV40 T-Ag基因可以被能夠特異性地在肝臟中表達(dá)Cre重組酶的腺病毒載體啟動(dòng)表達(dá)。Cre重組酶誘導(dǎo)SV40 T-Ag在肝臟中表達(dá)5個(gè)月后，該模型能夠觀察到明顯的肝腫瘤。隨后，有些研究團(tuán)隊(duì)采用條件性啟動(dòng)原癌基因突變策略構(gòu)建了相應(yīng)的小鼠肝癌模型。Colnot等［27］通過(guò)基因修飾方法，在APC（adenomatous polyposis coli）雙等位基因14號(hào)外顯子兩翼上添加loxP位點(diǎn)，通過(guò)在肝臟中特異表達(dá)Cre重組酶后可以使得APC基因在肝臟中缺失，進(jìn)而構(gòu)建基于APC缺失的小鼠肝癌模型。在該模型中，67%的小鼠在Cre重組酶處理后的8～9個(gè)月可以觀察到明顯的肝腫瘤。此外，miRNAs的異常表達(dá)在肝癌中也被證實(shí)［28］，由于 miRNA可能是潛在的肝癌治療方法［29］，與miRNA相關(guān)的基因修飾肝癌模型也被相應(yīng)地建立。全敲除MiR-122（KO）和肝臟特異性敲除（LKO）MiR-122小鼠模型分別在5周和8～10周開(kāi)始出現(xiàn)炎癥，89%的雄性和23%的雌性小鼠（KO）在10月齡出現(xiàn)肝癌腫瘤，而50%雄性和10%雌性小鼠（LKO）在12月齡出現(xiàn)肝腫瘤［30］。Zhang等［31］利用TALENs技術(shù)成功在H2.35細(xì)胞系中敲除肝癌細(xì)胞中常見(jiàn)發(fā)生突變的β-catenin（Ctnnb1）和APC，進(jìn)而通過(guò)高壓水動(dòng)力法運(yùn)送β-catenin（Ctnnb1），并結(jié)合腺病毒包裹APC TALENs，成功在活體小鼠內(nèi)敲除該兩基因，構(gòu)建肝癌模型。Xue等［32］利用高壓水動(dòng)力法運(yùn)送CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活體小鼠肝臟中同時(shí)敲除抑癌基因Pten和p53成功構(gòu)建小鼠肝癌模型，該研究表明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在活體小鼠肝臟中敲除抑癌和原癌基因。此外，Wnt信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子Ctnnbl基因，它表達(dá)β-catenin，在肝癌中經(jīng)常發(fā)生突變，該研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合高壓水動(dòng)力法運(yùn)送Ctnnb1 sgRNAs，Cas9，長(zhǎng)度為200個(gè)核苷酸的ssDNA到FVB小鼠肝臟，成功使得Ctnnbl基因在4個(gè)位點(diǎn)上從絲氨酸/蘇氨酸突變到丙氨酸。這些研究表明，基因修飾技術(shù)（特別是TALENs和CRISPR/Cas9）為建立肝癌模型提供了快速、簡(jiǎn)單和可靠的方法，為相關(guān)基因功能研究提供了新思路。

5　結(jié)論和展望

理想的肝癌模型應(yīng)能準(zhǔn)確反映癌癥生物特性和行為，充分模擬人類腫瘤微環(huán)境，且容易操作和獲取。雖然目前尚無(wú)最理想的小鼠肝癌模型存在，但現(xiàn)有的動(dòng)物模型在研究人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展上仍是非常寶貴的資源和工具。通常，異位移植物和原位移植小鼠肝癌模型可用于檢測(cè)新的治療方法，且原位移植小鼠模型非常適用于研究肝癌的轉(zhuǎn)移；而基因修飾肝癌動(dòng)物模型擁有較高的癌癥轉(zhuǎn)移率，在研究肝癌發(fā)生的分子機(jī)制方面是非常好的模型。隨著基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，高質(zhì)量的小鼠肝癌模型將會(huì)有利于提高和改善對(duì)肝癌的研究和綜合治療方法的研發(fā)?，F(xiàn)已有通過(guò)高壓水動(dòng)力法運(yùn)送CRISPR/Cas9質(zhì)粒到成年小鼠肝臟敲除原癌基因和抑癌基因；后面可結(jié)合腺病毒或慢病毒包裹CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活體小鼠中敲除肝癌相關(guān)的原癌和抑癌基因，以期提高活體組織中的編輯效率。在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建小鼠肝癌模型中，也可采用Cas9-FokI和Cas9D10A系統(tǒng)來(lái)編輯小鼠肝癌相關(guān)的原癌和抑癌基因，以降低脫靶效應(yīng)。此外，在構(gòu)建小鼠肝癌模型研究中小鼠和人之間的差異性在研究過(guò)程中也應(yīng)該被考慮，如小鼠的代謝特征和免疫系統(tǒng)與人有著較大差異，下一步可以探索研究人源化小鼠模型用于肝癌模型的構(gòu)建?？傊?，繼續(xù)研發(fā)更適合的小鼠肝癌模型，對(duì)于探討肝癌發(fā)生的分子機(jī)制、癌癥信號(hào)通路、新型生物標(biāo)記物、靶向藥物的開(kāi)發(fā)等方面可提供必要工具，以期最終加速將實(shí)驗(yàn)室的肝癌研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用。

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A brief review on the progress of mouse models of liver cancer

LI Shun1，CHEN Li-xiang1，PENG Xiu-hua1，ZHU Jiang-ming2，ZHOU Xiao-hui1
（1.Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China，2.School of Basic Medical and Biological Sciences，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

【Abstract】Liver cancer remains one of the leading cause of cancer death in the world.Animal models，especially mouse models，are important tools for studying the biological characteristics，pathogenesis，new drug screening and therapy of liver cancer.Up to now，although the development of various animal models accelerates the research of liver cancer，all the existing models have their own disadvantages.Lacking of economical and applicable animal models that can mimic the human liver cancer seriously restrict the further study of liver cancer.With the development of genetically modified technologies，it provides a fast，easy and reliable method to establish liver cancer models.In this review，we describe the different types of mouse models used in liver cancer research，with emphasis on genetically engineered mice used in this field，which may open an avenue for functional cancer genomics and generation of liver cancer models by using gene editing technologies.

【Key words】Liver cancer；Genetical modification；Mouse model

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0213-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.020

［基金項(xiàng)目］國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究973發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB519005）；上海市科技發(fā)展基金實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究項(xiàng)目（15140904000）；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題項(xiàng)目（20154Y0075）。

［作者簡(jiǎn)介］李順（1986-），男，助理研究員，博士，從事基因修飾動(dòng)物模型研究，E-mail：lishun86@126.com。

［通訊作者］周曉輝（1973-），男，研究員，博士，E-mail：zhouxiaohui@shaphc.org。

Corresponding author：ZHOU Xiao-hui，Email：zhouxiaohui@shaphc.org

［收稿日期］2015-11-13