胡夢(mèng)龍賀霖偉李炳志?元英進(jìn)

（1.天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072；2.天津大學(xué)化工學(xué)院天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300072）

隨著社會(huì)發(fā)展和科技進(jìn)步，人類對(duì)能源的需求逐年增多，現(xiàn)有的礦物能源已經(jīng)愈發(fā)不能滿足人類需求，可再生能源越來越受到人類的重視［1］。木質(zhì)纖維素作為世界上最為豐富的生物質(zhì)資源之一，具有來源廣泛、可循環(huán)利用、價(jià)格低廉、環(huán)境友好等特點(diǎn)，因此，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?］。木質(zhì)纖維素乙醇的生產(chǎn)至少需要以下4個(gè)單元操作：預(yù)處理，酶解，發(fā)酵和分離單元［3］。在酶解和發(fā)酵的過程中，目前同步糖化發(fā)酵技術(shù)被廣泛應(yīng)用［4］。同步糖化發(fā)酵技術(shù)將酶解和發(fā)酵整合在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，可以降低成本，簡化操作，而且通過發(fā)酵及時(shí)消耗葡萄糖，提高糖化的效率和乙醇的產(chǎn)率［5］。纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，在現(xiàn)有的纖維素酶制劑中，β-葡萄糖苷酶活性相對(duì)較弱，導(dǎo)致同步糖化發(fā)酵過程中出現(xiàn)纖維二糖積累［6］。纖維二糖對(duì)纖維素酶具有明顯的抑制作用，極大地抑制了酶解的速率［7］。 因此，Galazka 等［8］將纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT1和β-葡萄糖苷酶BGL導(dǎo)入釀酒酵母中，構(gòu)建了一株可利用纖維二糖的釀酒酵母，可將纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)后水解，能夠有效地解除纖維二糖對(duì)酶解的抑制，提高乙醇的產(chǎn)率。同時(shí)，通過將纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、β-葡萄糖苷酶和木糖代謝路徑引入釀酒酵母后，獲得的重組菌株可用于解除葡萄糖對(duì)木糖的抑制效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)五六碳糖共利用［9］。因此，將纖維二糖利用菌株應(yīng)用于木質(zhì)纖維素乙醇的工業(yè)生產(chǎn)中，可以有效地降低乙醇生產(chǎn)成本，提高乙醇的生產(chǎn)效率。

但是由于木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理的過程中條件多采用高溫高壓，導(dǎo)致一系列對(duì)微生物細(xì)胞有毒性作用的副產(chǎn)物產(chǎn)生［10］。這些副產(chǎn)物主要是來源于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解，對(duì)酵母的生長具有抑制作用，會(huì)降低酵母的乙醇產(chǎn)率和最終得率［11］。根據(jù)這些副產(chǎn)物的性質(zhì)與來源，通常將這些抑制劑分為3大類，包括呋喃類、酚類和弱酸類物質(zhì)［12］。在纖維素水解液中，這3大類抑制物大多都是同時(shí)存在，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的協(xié)同抑制作用［13］。本研究選取糠醛、苯酚和乙酸分別作為呋喃類、酚類和弱酸類抑制劑的代表進(jìn)行研究。

目前釀酒酵母菌株在以葡萄糖為碳源條件下對(duì)抑制劑的耐受性研究較多，但是纖維二糖利用途徑作為一個(gè)外源的代謝途徑，在纖維二糖為碳源條件下釀酒酵母菌株對(duì)抑制劑的耐受性還鮮有研究。纖維二糖利用菌株能否在抑制劑存在的條件下正常利用纖維二糖，對(duì)其在纖維素乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用非常重要。本研究選取本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的一株經(jīng)過基因改造的、可以高效利用纖維二糖的工業(yè)背景菌株，在外加抑制劑的條件下分別以纖維二糖或葡萄糖作為碳源進(jìn)行限氧發(fā)酵，研究了糠醛、苯酚、乙酸3種單一抑制劑以及復(fù)合抑制劑對(duì)纖維二糖發(fā)酵的影響，旨在為纖維二糖利用菌株在工業(yè)乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，降低乙醇的生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

重組釀酒酵母菌株SyBE001603，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。它以安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的安琪酵母（產(chǎn)品編號(hào)為80000012）為出發(fā)菌株，通過引入外源的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT1基因和β-葡萄糖苷酶BGL基因，以獲得快速纖維二糖利用能力。

1.2 培養(yǎng)基

液體YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖 20 g/L。

液體 YPC培養(yǎng)基：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨20 g/L，纖維二糖 20 g/L。

固體YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂粉 20 g/L。

固體 YPC培養(yǎng)基：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨20 g/L，纖維二糖 20 g/L，瓊脂粉 20 g/L。

培養(yǎng)基均采用121℃高溫滅菌20min。

1.3 乙醇發(fā)酵

抑制劑的添加：在發(fā)酵接種前將糠醛、苯酚、乙酸分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，對(duì)照組不添加抑制劑。加入乙酸后，為了保證不同乙酸濃度發(fā)酵液pH值的一致性，培養(yǎng)基初始pH值用無菌的10 mol/L NaOH調(diào)成pH值5.5。

纖維二糖發(fā)酵：用接種環(huán)從平板上挑取釀酒酵母單菌落，接種到含3 mL YPC培養(yǎng)基的試管中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h后，將一級(jí)種子以初始OD600＝0.2轉(zhuǎn)接到含有50 mL YPC培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng) 12 h。 按照初始 OD600＝1.0，取相應(yīng)體積的二級(jí)種子培養(yǎng)液，4 000 r/min離心5min收集細(xì)胞，將細(xì)胞接種到裝有50 mL YPC培養(yǎng)基的100 mL細(xì)口三角瓶中，瓶口用插有針頭的3號(hào)橡膠塞密封，34℃，150 r/min限氧培養(yǎng)。

葡萄糖發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)基采用液體YPD培養(yǎng)基，其余方法同纖維二糖發(fā)酵。

1.4 細(xì)胞密度與發(fā)酵產(chǎn)物測定

菌株生長情況通過紫外可見分光光度計(jì)測定吸光值，吸收波長為600 nm。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)10 000 r/min離心5min后取上清液，通過高效液相色譜測定纖維二糖、葡萄糖和乙醇的濃度。液相色譜條件為：Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱，Waters 1515高壓泵，Waters 2414示差檢測器，色譜柱柱溫控制在65℃，檢測器溫度控制在50℃，流動(dòng)相采用5mmol/L的硫酸，流速控制在 0.6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株對(duì)糠醛的耐受性研究

Palmqvist等［14］的研究表明，糠醛會(huì)降低細(xì)胞的生物量、比生長速率和乙醇的產(chǎn)率。預(yù)處理液中的糠醛含量根據(jù)纖維素原料的來源與預(yù)處理的方式的不同而變化，但大多在0.5～1.9 g/L的范圍內(nèi)［15］。本研究選取4個(gè)濃度梯度進(jìn)行研究，分別為0.5、1.0、2.0 和 3.0 g/L。

由圖1可以看出，當(dāng)糠醛濃度為0.5 g/L時(shí)，糠醛對(duì)菌株的纖維二糖消耗和乙醇生產(chǎn)影響不顯著。當(dāng)糠醛濃度高于0.5 g/L時(shí)，隨著糠醛濃度的提高，菌株SyBE001603的發(fā)酵時(shí)間延長，當(dāng)濃度為3.0 g/L時(shí)，菌株生長24 h才進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速率明顯降低。隨著糠醛濃度的提高，菌株的纖維二糖消耗速率與不含有抑制劑的對(duì)照組相比分別降低了24.9%、40.0%、51.4%（表1），乙醇產(chǎn)率分別降低了26.1%、47.2%、65.7%，纖維二糖的利用和乙醇的生產(chǎn)得到明顯的抑制，但菌株在3.0 g/L的糠醛存在的條件下依然可以生長發(fā)酵，具有一定的糠醛耐受能力。

圖1 不同糠醛濃度對(duì)菌體生長a），纖維二糖消耗b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.1 Influence of furfural concentration on cell growth a），cellobiose consumption b）and ethanol productivity c）

如圖2所示，以葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，糠醛對(duì)菌株的生長、糖耗和乙醇生產(chǎn)都有明顯的抑制。隨著糠醛濃度的升高，菌株的生長速率和最大生物量都有明顯的降低。當(dāng)糠醛濃度超過0.5 g/L時(shí)，發(fā)酵3 h后，葡萄糖的消耗量與不含糠醛的對(duì)照組相比分別降低了16.3%、36.9%和51.5%，菌株的耗糖能力受到糠醛的影響?？啡?duì)酵母細(xì)胞的中心碳代謝相關(guān)的酶有抑制作用，而且可以抑制蛋白質(zhì)和RNA的合成，降解DNA［16］。而且糠醛會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧積累，對(duì)細(xì)胞的線粒體膜、液泡膜、核染色質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等產(chǎn)生損傷［17］。因此在纖維二糖和葡萄糖分別作為單一碳源時(shí)，糠醛對(duì)菌株的生長、糖利用以及乙醇的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生抑制，抑制程度均隨濃度的提高而增大。

表1 3種單一抑制劑和復(fù)合抑制劑對(duì)菌株SyBE001603纖維二糖發(fā)酵的影響Table 1 Influence of three single inhibitor and multiple inhibitors on the cellobiose fermentation of strain SyBE001603

圖2 以葡萄糖作為碳源時(shí)，糠醛對(duì)菌株的生長a），糖耗b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.2 Effect of furfural on cell growth a），glucose consumption b）and ethanol productivity c）when using glucose as the sole carbon source

2.2 菌株對(duì)苯酚的耐受性研究

酚類物質(zhì)的毒性與相對(duì)分子質(zhì)量和取代基位置有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量越小毒性越大［18］。本研究選擇相對(duì)分子質(zhì)量最小的苯酚作為酚類物質(zhì)的代表，選取4個(gè)濃度梯度進(jìn)行研究，分別為0.2、0.5、0.8和 1.5 g/L。

由圖3可以看出，當(dāng)苯酚濃度低于1.5 g/L時(shí)，苯酚對(duì)菌株的生長和纖維二糖消耗基本沒有產(chǎn)生抑制，而且當(dāng)苯酚濃度低于0.8 g/L時(shí)，細(xì)胞的生長和纖維二糖利用略快于對(duì)照組，細(xì)胞的生物量也有所增加。而當(dāng)苯酚濃度為 1.5 g/L時(shí)，菌株SyBE001603的生長受到明顯抑制，與不含苯酚的對(duì)照組相比，纖維二糖消耗速率降低40.1%，乙醇產(chǎn)率降低45.5%（表1）。苯酚的加入對(duì)乙醇的得率有一定的影響，當(dāng)苯酚的濃度高于0.5 g/L時(shí)，乙醇的得率均降至對(duì)照的91%左右。

圖3 苯酚濃度梯度對(duì)菌體生長a），纖維二糖消耗b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.3 Effect of phenol concentration on cell growth a），cellobiose utilization b）and ethanol productivity c）

當(dāng)以葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，苯酚濃度的提高對(duì)菌株產(chǎn)生了明顯的抑制。0.2 g/L的苯酚對(duì)菌株的生長和生產(chǎn)沒有產(chǎn)生顯著影響，當(dāng)苯酚濃度超過0.2 g/L時(shí)，隨著濃度的提升，菌株的糖耗速率、乙醇產(chǎn)率和生物量均有明顯的下降，見圖4。

圖4 以葡萄糖為碳源時(shí)，不同苯酚濃度對(duì)菌體生長a），葡萄糖利用b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.4 Influence of different phenol concentration on cell growth a），glucose consumption b）and ethanol productivity c）when using glucose as the sole carbon source

菌株的最大生物量分別降低了3.5%、9.3%、29.7%。發(fā)酵3 h葡萄糖的消耗量分別降低了6.4%、21.4%、43.0%，乙醇的產(chǎn)量分別降低了22.3%、46.0%、59.8%。由此可見，相比于以葡萄糖作為碳源，以纖維二糖作為碳源時(shí)菌株對(duì)苯酚的耐受能力有所增強(qiáng)，而且在發(fā)酵過程中低濃度苯酚的存在反而促進(jìn)了細(xì)胞的生長和纖維二糖利用。苯酚主要作用于細(xì)胞膜，通過破壞細(xì)胞膜的完整性，從而影響細(xì)胞膜的選擇性透過能力和胞內(nèi)的酶反應(yīng)環(huán)境［15］。苯酚的存在會(huì)降低細(xì)胞膜上脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量的比例，改變細(xì)胞膜的功能［19］。纖維二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過細(xì)胞膜上的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT1實(shí)現(xiàn)，由此可推測低濃度苯酚存在時(shí)，苯酚通過作用于細(xì)胞膜，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞膜上的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生影響，對(duì)纖維二糖由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用，有利于纖維二糖的利用。

2.3 菌株對(duì)乙酸的耐受性研究

乙酸的存在會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物量的降低，影響菌株的生長和發(fā)酵性能［20］。未解離的乙酸分子是脂溶性的，可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后乙酸分子在胞內(nèi)解離，降低胞內(nèi)的pH值。為了保持胞內(nèi)的pH值平衡，ATPase水解ATP產(chǎn)生能量，將質(zhì)子泵出細(xì)胞以維持細(xì)胞內(nèi)pH值為中性［21］。同時(shí)胞內(nèi)的乙酸根離子不能被泵出胞外，在胞內(nèi)逐漸累積，對(duì)細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制。乙酸在木質(zhì)纖維素水解液中廣泛存在，濃度多在1.6～4.4 g/L的范圍內(nèi)［15］，因此本研究選用 0.5、1.0、1.5、2.5 和 4.0 g/L共5個(gè)濃度梯度進(jìn)行研究。

由圖5可知，以纖維二糖作為碳源時(shí)，隨著乙酸濃度的提高，菌株的生長速率明顯降低，當(dāng)乙酸濃度為4 g/L時(shí)，需要36 h才能將纖維二糖消耗完，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期生長，發(fā)酵時(shí)間延長了3倍。菌株的最大生物量分別降低了12.1%、28.5%、41.2%、53.2%、57.7%，纖維二糖利用速率分別降低了10.1%、25.4%、40.3%、53.0%、75.5% （表1）。 由此可知，在纖維二糖作為碳源的條件下菌株對(duì)乙酸非常敏感，乙酸對(duì)菌株的纖維二糖利用能力有顯著的影響，乙酸濃度越高對(duì)菌株的抑制作用越強(qiáng)。

當(dāng)把發(fā)酵碳源選為葡萄糖時(shí)，乙酸濃度對(duì)生物量有明顯影響，見圖6。

圖5 乙酸對(duì)菌體生長a），纖維二糖利用b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.5 Effect of acetic acid on cell growth a），cellobiose utilization b）and ethanol productivity c）

圖6 乙酸對(duì)菌體生長a），葡萄糖利用b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.6 Influence of acetic acid on cell growth a），glucose utilization b）and ethanol productivity c）

隨著乙酸濃度的提高，菌株的最大生物量分別降低了9.3%、11.5%、19.4%、25.7%、37.0%。但是在發(fā)酵過程中菌株的葡萄糖消耗速率卻有一定提高，加入乙酸后乙醇的最終濃度也都有1% ～2%的提高。Palmqvist等［10］的研究證明，當(dāng)細(xì)胞外乙酸濃度較低時(shí)，乙酸可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生ATP，促進(jìn)乙醇的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)胞外乙酸濃度較高的時(shí)候，細(xì)胞必須產(chǎn)生足量的ATP來維持胞內(nèi)的pH值，從而抑制細(xì)胞的生長，導(dǎo)致生物量的降低。由此可知，在以葡萄糖作為碳源的時(shí)候，菌株對(duì)乙酸有較強(qiáng)的耐受能力，盡管菌株的生物量得到了抑制，但是一定濃度乙酸（0.5～4.0 g/L）的存在促進(jìn)了葡萄糖的消耗和乙醇的產(chǎn)生。而在以纖維二糖作為碳源的時(shí)候，乙酸對(duì)菌株產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。

因此對(duì)乙酸的耐受能力成為菌株利用纖維二糖生產(chǎn)乙醇的一個(gè)限制因素。菌株的外源纖維二糖水解路徑主要包括纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和β-葡萄糖苷酶，本研究所選用的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT1和β-葡萄糖苷酶GH1-1均來自粗糙脈孢菌［8］。纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT1是一種依賴于質(zhì)子梯度的同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在纖維二糖發(fā)酵過程中需要消耗較多的能量［22］。在細(xì)胞外乙酸存在的條件下，細(xì)胞需要消耗ATP將質(zhì)子泵出。同時(shí)在限氧條件下TCA循環(huán)沒有被激活，ATP的產(chǎn)生受限［23］。因此在限氧條件下乙酸對(duì)纖維二糖的代謝產(chǎn)生抑制，降低了菌株的纖維二糖代謝速率。提高纖維二糖利用菌株對(duì)乙酸的耐受能力，是纖維二糖利用菌株應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵問題。在接下來的研究中，可以考慮通過選用依靠協(xié)同擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)纖維二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 CDT2［22，24］，減少轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的 ATP 消耗，或者選用纖維二糖磷酸化酶代替β-葡萄糖苷酶，減少纖維二糖代謝過程中的ATP消耗［25］，來提高菌株對(duì)乙酸的耐受能力。

2.4 菌株對(duì)復(fù)合抑制劑的耐受性研究

在纖維素水解液中，呋喃類、酚類和弱酸類物質(zhì)大多是共同存在的，共同發(fā)揮抑制作用［10］。根據(jù)水解液中各類抑制劑的濃度［26］以及菌株對(duì)單一抑制劑的耐受能力，本研究選取3個(gè)濃度梯度：M1，糠醛 0.5 g/L，苯酚 0.2 g/L，乙酸 0.5 g/L；M2，糠醛1.0 g/L，苯酚 0.5 g/L，乙酸 1.0 g/L；M3，糠醛2.0 g/L，苯酚 0.8 g/L，乙酸 1.5 g/L。 在復(fù)合抑制劑存在的條件下，隨著抑制劑濃度的增加，菌株的各項(xiàng)生長和生產(chǎn)指標(biāo)均有所下降，見圖7。

圖7 復(fù)合抑制劑對(duì)菌體生長a），纖維二糖利用b）和乙醇生產(chǎn)c）的影響Fig.7 Influence of multiple inhibitors on cell growth a），cellobiose utilization b）and ethanol productivity c）

最大生物量分別降低了11.0%、25.5%、37.1%，纖維二糖消耗速率分別降低了10.4%、28.5%、58.9%，乙醇產(chǎn)率分別降低了 29.4%、33.7%、64.1%，乙醇得率分別降低了 5.5%、9.2%、11.9%（表1）。在復(fù)合抑制劑條件下，菌株的纖維二糖消耗速率、乙醇產(chǎn)率、乙醇得率均低于相同濃度的單一抑制劑條件。由此可見，當(dāng)糠醛、苯酚和乙酸共同存在的時(shí)候，復(fù)合抑制劑表現(xiàn)出的是對(duì)菌株纖維二糖利用的協(xié)同抑制作用，協(xié)同抑制作用均強(qiáng)于單一抑制作用。在2.0 g/L糠醛、0.8 g/L苯酚、1.5 g/L乙酸3種復(fù)合抑制劑存在的條件下，菌株SyBE001603仍然可以將培養(yǎng)基中的纖維二糖消耗完全，展示了對(duì)復(fù)合抑制劑的耐受能力，可以作為底盤菌株進(jìn)一步改造，提高對(duì)抑制劑的耐受能力，有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中以提高纖維素乙醇的產(chǎn)率。

3 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室保藏的基因工程重組酵母菌株SyBE001603，在纖維二糖作為單一碳源的條件下，可以分別耐受 3.0 g/L 糠醛、1.5 g/L 苯酚、4.0 g/L乙酸以及含有2.0 g/L 糠醛、0.8 g/L 苯酚、1.5 g/L乙酸的復(fù)合抑制劑。糠醛對(duì)菌株纖維二糖利用能力和葡萄糖利用能力均會(huì)產(chǎn)生抑制，抑制程度均隨濃度的提高而增大。苯酚對(duì)菌株的葡萄糖利用能力有明顯的抑制作用，但是低濃度的苯酚對(duì)菌株的纖維二糖利用有一定的促進(jìn)作用，高濃度的苯酚對(duì)菌株有毒害作用，抑制細(xì)胞的生長和發(fā)酵。乙酸對(duì)菌株纖維二糖利用的抑制作用最為明顯，對(duì)乙酸的耐受能力是菌株能否應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題之一。

［1］Zhong C，Cao Y，Li B，et al．Biofuels in China：Past，present and future［J］.Biofuels，Bioproducts and Biorefining，2010，4（3）：326-342

［2］Brethauer S，Wyman C E.Review：Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production［J］.Bioresource Technology，2010，101（13）：4 862-4 874［3］Talebnia F，Karakashev D，Angelidaki I.Production of bioethanol from wheat straw：An overview on pretreatment，hydrolysis and fermentation ［J］.Bioresource Technology，2010，101（13）：4 744-4 753

［4］Hahn-H?gerdal B，Galbe M，Gorwa-Grauslund M F，et al．Bio-Ethanol：The fuel of tomorrow from the residues of today［J］.Trends in Biotechnology，2006，24（12）：549-556

［5］Hasunuma T，Kondo A.Consolidated bioprocessing and simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulose to ethanol with thermotolerant yeast strains［J］.Process Biochemistry，2012，47（9）：1 287-1 294

［6］Chauve M，Mathis H，Huc D，et al．Comparative kinetic analysis of two fungalβ-glucosidases［J］.Biotechnology for Biofuels，2010，3（6）：1-8

［7］Voutilainen S P，Puranen T，Siikaaho M，et al．Cloning，expression，and characterization of novel thermostable family 7 cellobiohydrolases［J］.Biotechnology and Bioengineering，2008，101（3）：515-528

［8］Galazka J M，Tian C，Beeson W T，et al．Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production［J］.Science，2010，330（6 000）：84-86

［9］Ha S J，Galazka J M，Kim S R，et al．EngineeredSaccharomyces cerevisiaecapable of simultaneous cellobiose and xylose fermentation［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108（2）：504-509

［10］Palmqvist E，Hahn-H?gerdal B.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates.II：Inhibitors and mechanisms of inhibition［J］.Bioresource Technology，2000，74（1）：25-33

［11］Ding M，Wang X，Yang Y，et al．Comparative metabolic profiling of parental and inhibitors-tolerant yeasts during lignocellulosic ethanol fermentation［J］.Metabolomics，2012，8（2）：232-243

［12］Parawira W，Tekere M.Biotechnological strategies to overcome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production：Review［J］.Critical reviews in Biotechnology，2011，31（1）：20-31

［13］Palmqvist E，Grage H，Meinander N Q，et al．Main and interaction effects of acetic acid，furfural，andphydroxybenzoic acid on growth and ethanol productivity of yeasts［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，63（1）：46-55

［14］Palmqvist E，Almeida J S，Hahn-H?gerdal B.Influence of furfural on anaerobic glycolytic kinetics ofSaccharomyces cerevisiaein batch culture［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，62（4）：447-454

［15］Almeida J R，Modig T，Petersson A，et al．Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates bySaccharomyces cerevisiae［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2007，82（4）：340-349

［16］Liu Z.Genomic adaptation of ethanologenic yeast to biomass conversion inhibitors［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73（1）：27-36

［17］Allen S A，Clark W，McCaffery J M，et al．Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage inSaccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnology for Biofuels，2010，3（2）：1-10

［18］Klinke H B，Thomsen A，Ahring B K.Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，66（1）：10-26

［19］Keweloh H，Weyrauch G，Rehm H J.Phenol-Induced membrane changes in free and immobilizedEscherichia coli［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1990，33（1）：66-71

［20］Larsson S，Palmqvist E，Hahn-H?gerdal B，et al．The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood［J］.Enzyme and Microbial Technology，1999，24（3）：151-159

［21］Russell J B，Diez-Gonzalez F.The effects of fermentation acids on bacterial growth［J］.Advances in Microbial Physiology，1997，39：205-234

［22］Kim H，Lee W H，Galazka J M，et al．Analysis of cellodextrin transporters fromNeurospora crassainSaccharomyces cerevisiaefor cellobiose fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（3）：1 087-1 094

［23］Spiro S，Guest J R.Adaptive responses to oxygen limitation inEscherichia coli［J］.Trends in Biochemical Sciences，1991，16（8）：310-314

［24］Lian J，Li Y，Hamedirad M，et al．Directed evolution of a cellodextrin transporter for improved biofuel production under anaerobic conditions in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnology ＆ Bioengineering，2014，111（8）：1 521-1 531

［25］Ha S J，Galazka J M，Joong O E，et al．Energetic benefits and rapid cellobiose fermentation bySaccharomyces cerevisiaeexpressing cellobiose phosphorylase and mutant cellodextrin transporters［J］.Metabolic Engineering，2013，15：134-143

［26］Martinez A，Rodriguez M E，Wells M L，et al．Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime［J］.Biotechnology Progress，2001，17（2）：287-293