徐志博林振泉陳 濤

（天津大學(xué)化工學(xué)院教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津300072）

核黃素（維生素B2）是生物合成黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的重要前體物，廣泛用于飼料、食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)［1-2］。核黃素的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法以其成本低廉、環(huán)境污較小、生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢成為目前核黃素生產(chǎn)的主流方法。

目前，核黃素的主要生產(chǎn)菌株有棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）、假絲酵母（Candida famata）和枯草芽孢桿菌（B．subtilis）［3］。 由于這些菌種主要是通過多輪理化誘變之后篩選得到，經(jīng)過傳統(tǒng)誘變得到的菌株會產(chǎn)生大量不利突變，同時由于隨機突變的不確定性使得通過代謝工程進一步合理改進這些工業(yè)菌株面臨著極大的挑戰(zhàn)和困難［4］。大腸桿菌（E．coli）因其生長速度快、基因操作技術(shù)成熟、生物合成途徑以及酶的研究透徹等特征，已經(jīng)被廣泛用于氨基酸、核苷酸、生物塑料以及其它專用化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)，例如：絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸，肌苷、鳥苷、PHA、乳酸、琥珀酸和乙醇等［5］。

原核生物合成核黃素的代謝途徑如圖1所示：前體物三磷酸鳥苷（GTP）和5-磷酸核酮糖以1：2的比例，經(jīng)過GTP咪唑環(huán)的開環(huán)水解、脫氨基、還原、脫磷酸、C4單位生成、二氧四氫蝶啶合成以及核黃素合成七步酶促反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化為核黃素［6］。在B．subtilis中，核黃素生物合成相關(guān)酶的編碼基因在染色體上以操縱子的形式存在。如圖2所示［7］，該操縱子位于染色體的210°，總長度4.3 kb，由ribG、ribB、ribA、ribH、ribT5 個基因和5′端的RFN 結(jié)構(gòu)（ribO）組成。此外，在RFN結(jié)構(gòu)的上游有一個一級啟動子ribP1，ribB基因的末端和ribT基因的上游分別有兩個二級啟動子ribP2和ribP3。核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄受到FMN/FAD的反饋調(diào)節(jié)［7］。大腸桿菌ribF基因編碼產(chǎn)物為核黃素激酶和黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶，這兩個酶在枯草芽孢桿菌中是由ribC編碼，該基因的突變能夠解除枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，提高核黃素的積累［8］（圖1）。

圖1 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌核黃素生物合成途徑Fig.1 Riboflavin biosynthesis is in prokaryotes.The E．coli genes encoding each enzymatic activity are indicated on the left while the corresponding B．subtilis genes are indicated to the right.Abbreviations：Ru5P，ribulose-5-phosphate；GTP，guanosine triphosphate；DARPP，2，5-diamino-6-ribosylamino-4（3H）-pyrimidinone-5’-phosphate；ARPP，5-amino-6-（5’-phosphoribo sylamino）uracil；ArPP，5-amino-6-（5’-phosphoribitylamino）uracil；ArP，4-（1-D-ribitylamino）-5-amino-2，6-dihydroxypyrimidine；DHPB，3，4-dihydroxy-2-butanone 4-phosph ate；DRL，6，7-dimethyl-8-ribityl-lumazine；FMN，flavin mononucleotide；FAD，flavin adenine dinucleotide

圖2 枯草芽孢桿菌rib操縱子結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of the rib operon from B．subtilis．The bold arrows show the mutual arrangement and the direction of transcription for the five rib operon genes：ribG，ribB，ribA，ribH and ribT.The fine arrows denote the direction of transcription from the P1，P2 and P3 promoters in the rib operon.The hairpin structures indicate the locations of ρ-independent transcription terminators

本論文針對大腸桿菌中的核黃素生物合成途徑進行改造，使其來生產(chǎn)核黃素，主要包括枯草芽孢桿菌rib操縱子的異源表達和ribF基因的減弱表達。首先在E．coliMG1655中以質(zhì)粒形式表達B．subtilis168核黃素合成的rib操縱子。該rib操縱子由強啟動子Ptrc介導(dǎo)，同時刪除了rib操縱子5′端RFN元件和ribO調(diào)控序列，解除了rib操縱子轉(zhuǎn)錄水平的反饋抑制，并在ribG上游加入人工設(shè)計的核糖體結(jié)合位點（RBS）序列。通過酶切連接到不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，并對誘導(dǎo)劑IPTG濃度和發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化；在此最優(yōu)條件下減弱表達E．coli本身的ribF基因，最終的菌株ECX4在LB培養(yǎng)基中核黃素產(chǎn)量提高到292.3 mg·L-1，為構(gòu)建大腸桿菌核黃素生產(chǎn)菌株及其進一步改造奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和實驗儀器

試劑：氨芐青霉素、奇霉素、四環(huán)素、酵母抽提物、胰蛋白胨、基因組提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；Fast Pfu高保真快速DNA聚合酶購自北京全式金，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自加拿大Fermentas公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

儀器：TU1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；SBA40C生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；超聲波破碎儀（美國Sonics＆ Materials公司）。

1.2 菌株和質(zhì)粒

菌株與質(zhì)粒見表1。

1.3 引物設(shè)計

引物設(shè)計見表2。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建

首先用試劑盒提取枯草芽孢桿菌基因組DNA并以其為模板，用引物rib1/rib2進行BSrib操縱子的PCR擴增。純化后的BSrib片段與載體pSC101分別經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接得到表達載體pSC101-BSrib。表達載體 p15A-BSrib和 pBR322-BSrib以相同方式構(gòu)建。將這3個質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到E．coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，挑選抗性克隆，提質(zhì)粒進行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定。

1.5 菌株的構(gòu)建

ECS1、ECS2、ECS3 菌株（陰性對照）的構(gòu)建：將空質(zhì)粒pSC101、p15A、pBR322分別電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 MG1655 感受態(tài)中，涂布于含有 100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

ECX1、ECX2、ECX3菌株的構(gòu)建：將構(gòu)建好的質(zhì)粒 pSC101-BSrib、p15A-BSrib、pBR322-BSrib 分別電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655感受態(tài)中，涂布于含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的 LB 平板，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 引物設(shè)計Table 2 Primers used in this study

ECX4菌株的構(gòu)建：ribF片段構(gòu)建參照文獻［10］。將構(gòu)建好的ribF片段電轉(zhuǎn)化至含有pTKRED質(zhì)粒的大腸桿菌ECX3感受態(tài)中，涂布于含有100 μg·mL-1奇霉素、10 μg·mL-1四環(huán)素、100 μg·mL-1氨芐青霉素和2mmol·L-1IPTG的LB平板，30℃過夜培養(yǎng)，挑選抗性克隆進行PCR驗證。挑取抗性單克隆于 5 mL 含有 100 μg·mL-1奇霉素、100 μg·mL-1氨芐青霉素、2mmol·L-1IPTG和0.2%L-阿拉伯糖的LB的試管中，30℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。0.2%L-阿拉伯糖用于誘導(dǎo)I-SceI核酸內(nèi)切酶表達，刪除四環(huán)素抗性基因tetA。第2天，稀釋涂布于含有100 μg·mL-1奇霉素、100 μg·mL-1氨芐青霉素、2mmol·L-1IPTG和0.2%L-阿拉伯糖的LB平板，30℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性克隆進行PCR驗證。

1.6 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母抽提物，10 g·L-1氯化鈉，121℃高壓蒸汽滅菌20min。LB 發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母抽提物，10 g·L-1氯化鈉，20.9 g·L-13-（N-嗎啉基）丙磺酸，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.4，115℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.7 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

挑取單菌落于裝有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。以初始OD600約為0.01轉(zhuǎn)接到50 mL LB中進行種子培養(yǎng)，當菌體處于對數(shù)生長期時接入到100 mL LB（500 mL搖瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，使初始OD600達到0.01左右，分別添加葡萄糖、氨芐青霉素至濃度為 10 g·L-1、100 μg·mL-1，220 r/min 振蕩培養(yǎng)。

1.8 代謝產(chǎn)物分析

細胞生長是用紫外可見分光光度計于波長600 nm處測定吸光度值。核黃素是用紫外可見分光光度計于波長444 nm處測定吸光度值，由公式Riboflavin titer＝（OD444-0.0057）×稀釋倍數(shù)/0.0321計算得到。培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀檢測。

1.9 核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶酶活測定

在添加10 g·L-1葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長期時收集菌液，12 000×g、4℃離心10min，收集菌體；用2 mL 的 0.1mmol·L-1pH 7.5磷酸緩沖液溶液（4℃預(yù)冷）洗滌2次，懸浮在2 mL同樣的緩沖液中，進一步用超聲波破碎菌體；4℃條件下，13 000×g離心10min去除菌體等雜質(zhì)，得上清即為粗酶液，放置冰上備用。核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶活性測定參照Bandyopadhyay［11］方法。 蛋白濃度測定參照 Bradford［12］方法，以牛血清蛋白作為參照。

2 結(jié)果與討論

2.1 rib操縱子的克隆

將rib操縱子上游的調(diào)控序列刪除之后同時也將ribG的RBS序列也刪除，因此在引物rib1中加入合成的RBS序列。然后以B．subtilis168基因組DNA為模板，以rib1/rib2為引物，PCR擴增得到B．subtilis染色體上的核黃素操縱子基因（BSrib）片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，在大小約3.5 kb處有目的條帶，與理論值相同（圖3a）。將擴增得到的BSrib片段用EcoRI和BamHI雙酶切，并分別和表達載體pSC101、p15A和pBR322連接后得到最終質(zhì)粒 pSC101-BSrib、p15A-BSrib和 pBR322-Bsrib。 對以上3個表達質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別在3.5和4.9 kb，3.5和3.9 kb，3.5和4.1 kb有條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3b）。對pSC101-BSrib、p15A-BSrib和 pBR322-BSrib質(zhì)粒中的rib操縱子測序后發(fā)現(xiàn)與NCBI公布的核酸序列完全一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 核黃素操縱子BSrib表達質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證Fig.3 Construction and identification of BSrib operon expression plasmid.a）BSrib fragment produced by PCR.b）Identification of expression plasmid digested with EcoRI and BamHI.1：BSrib PCR fragment；2：pSC101-BSrib；3：p15A-BSrib；4：pBR322-Bsrib；M：1 kb DNA ladder

2.2 質(zhì)?？截悢?shù)對核黃素產(chǎn)量的影響

將過表達枯草芽孢桿菌核黃素操縱子的重組質(zhì)粒 pSC101-BSrib（低拷貝）、p15A-BSrib（中等拷貝）和pBR322-BSrib（高拷貝）分別電轉(zhuǎn)化到菌株E．coliMG1655中得到菌株ECX1、ECX2和ECX3。為測定不同質(zhì)?？截悢?shù)對核黃素產(chǎn)量的影響，在37℃、2mmol·L-1IPTG濃度條件下對其進行搖瓶發(fā)酵實驗。如表3所示，隨質(zhì)?？截悢?shù)的增加，核黃素產(chǎn)量大幅度提高。與低拷貝質(zhì)粒pSC101-BSrib相比，高拷貝質(zhì)粒pBR322-BSrib的核黃素產(chǎn)量和得率分別增加了1.8和1.3倍。同時，將帶有空質(zhì)粒pSC101、p15A和 pBR322的陰性對照菌株 ECS1、ECS2和ECS3在相同條件下發(fā)酵，結(jié)果并未檢測到有核黃素生成。

表3 不同質(zhì)?？截悢?shù)對生產(chǎn)核黃素的影響Table 3 Effect of plasmid copied on riboflavin production

2.3 不同IPTG濃度對核黃素產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中很多參數(shù)會影響核黃素的生產(chǎn)，包括誘導(dǎo)劑IPTG濃度、溫度等。其中誘導(dǎo)劑IPTG濃度是影響核黃素發(fā)酵生產(chǎn)的重要因素。IPTG濃度過高，很大程度上會抑制菌體生長，造成核黃素產(chǎn)量降低。IPTG濃度過低則導(dǎo)致核黃素操縱子的表達不充分，也會影響核黃素產(chǎn)量。為了增加核黃素的積累，優(yōu)化發(fā)酵條件，探討了不同的IPTG濃度對菌株ECX3發(fā)酵的影響。

如表4所示，研究了 0.05、0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol·L-1IPTG濃度下菌株ECX3在37℃時生產(chǎn)核黃素的狀況。結(jié)果表明0.10mmol·L-1為最適宜濃度，在此條件下核黃素產(chǎn)量為233.2 mg·L-1。與 2.00mmol·L-1IPTG濃度相比，產(chǎn)量提高91.8%。

表4 不同IPTG濃度對生產(chǎn)核黃素的影響Table 4 Effect of IPTG concentration on riboflavin production

2.4 不同溫度對核黃素產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物生長和調(diào)節(jié)生命活動的重要因素，嚴格保持菌體的生長繁殖和生長合成所需的最適溫度，對穩(wěn)定發(fā)酵過程、縮短發(fā)酵周期、提高發(fā)酵產(chǎn)量有一定的現(xiàn)實意義。

在上述最適宜IPTG濃度條件下，分別考察了菌株ECX3在33、35、37、42和44℃ 5個溫度下的核黃素生成情況，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高，核黃素產(chǎn)量呈升高趨勢。溫度超過42℃以后，核黃素產(chǎn)量下降。42℃為最適宜溫度，在此條件下核黃素產(chǎn)量最高，為251.4 mg·L-1。這可能是因為GTP環(huán)水解酶II是核黃素生物合成的限速酶，其最適作用溫度為42℃［13］。

表5 不同溫度對生產(chǎn)核黃素的影響Table 5 Effect of temperature on riboflavin production

2.5 ribF基因?qū)它S素產(chǎn)量的影響

為了減弱工程菌株ECX3核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶（ribF）的表達以降低FMN和FAD的合成，并提高核黃素的積累。將構(gòu)建好的ribF片段電轉(zhuǎn)化到重組感受態(tài)細胞并涂布在四環(huán)素平板，30℃過夜培養(yǎng)，挑選抗性克隆進行PCR驗證。其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4a）所示，在約2 kb處有目的條帶，符合預(yù)期結(jié)果。四環(huán)素抗性基因tetA被刪除后，挑選陽性克隆進行PCR驗證。其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4b）所示，在789 bp處有目的條帶，2 kb處沒有條帶，證明四環(huán)素抗性基因tetA已經(jīng)被刪除，并測序驗證。ribF無痕操作成功，基因組上原有的ribF啟動子和調(diào)控序列替換為J23115啟動子，ECX4菌株的構(gòu)建成功。

首先從酶學(xué)特性考察菌株ECX4中核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶的表達效果，對ECX3和ECX4的核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶酶活進行了測定。菌株ECX4核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶比酶活為1.02 ±0.06 nmol·（min mg-protein）-1，而對應(yīng)的野生型菌株為1.58 ±0.10 nmol·（min mg-protein）-1，重組菌的比酶活降低了35.4%。

圖4 ECX4工程菌株的構(gòu)建Fig.4 Construction of the engineering strain ECX4 by λ-Red recombination.a）Insertion of tetA for replacing the promoter ribF.b）Deletion of tetA gene.M：1 kb DNA ladder

為測定菌株 ECX4生產(chǎn)核黃素的能力，在0.1mmol·L-1IPTG、42℃條件下對重組菌株ECX4和出發(fā)菌株ECX3進行發(fā)酵實驗。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示菌株ECX4生產(chǎn)了292.3 mg·L-1核黃素，比野生菌提高了16.3%。Mack等［8］發(fā)現(xiàn)在B．subtilis中突變核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶，能夠顯著降低該酶的酶活，從而提高核黃素的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

1）本研究以大腸桿菌E．coliK-12 MG1655出發(fā)菌株，以質(zhì)粒的形式過量表達枯草芽孢桿菌B．subtilis的rib操縱子，實現(xiàn)了核黃素的積累，并且核黃素合成能力隨著質(zhì)粒拷貝數(shù)的增加而增強。然后對誘導(dǎo)劑IPTG濃度和發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，0.1mmol·L-1IPTG和42℃為核黃素生產(chǎn)的最佳條件。該條件下菌株ECX3的核黃素產(chǎn)量達到 251.4 mg·L-1。

2）通過無痕基因操作技術(shù)，減弱工程菌株ECX3核黃素激酶/黃素腺嘌呤二核苷酸氨酰轉(zhuǎn)移酶（ribF）的表達，得到菌株ECX4。搖瓶發(fā)酵核黃素產(chǎn)量達到292.3 mg·L-1，與ECX3相比，產(chǎn)量提高了16.3%。在后續(xù)的研究中，通過分子生物學(xué)手段進一步改造，以降低副產(chǎn)物、提高核黃素產(chǎn)量，這對大腸桿菌產(chǎn)核黃素的研究具有重要的意義。

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