劉高山 李紅 牛培華 石燕 姜雙應(yīng) 徐莉立 陸柔劍 趙生倉 譚文杰

102206北京，中國疾病預(yù)防與控制中心病毒病預(yù)防控制所，衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)病毒學(xué)與病毒病重點實驗室（劉高山、牛培華、陸柔劍、譚文杰）；810007西寧，青海省疾病預(yù)防控制中心（李紅、石燕、姜雙應(yīng)、徐莉立、趙生倉）

青海地區(qū)急性呼吸道感染癥候群中人冠狀病毒及鼻病毒分子流行病學(xué)研究

劉高山 李紅 牛培華 石燕 姜雙應(yīng) 徐莉立 陸柔劍 趙生倉 譚文杰

102206北京，中國疾病預(yù)防與控制中心病毒病預(yù)防控制所，衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)病毒學(xué)與病毒病重點實驗室（劉高山、牛培華、陸柔劍、譚文杰）；810007西寧，青海省疾病預(yù)防控制中心（李紅、石燕、姜雙應(yīng)、徐莉立、趙生倉）

劉高山、李紅共同第一作者

目的了解青海地區(qū)急性呼吸道感染人群中人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）及鼻病毒（human rhinovirus，HRV）的分布，探討其分子流行病學(xué)特征。方法采集2010年5月至2015年5月青海地區(qū)急性呼吸道癥候群病例鼻咽拭子445例，采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real?time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT?PCR）方法對HCoV六種亞型（OC43，HKU1，229E，NL63，SARS和MERS）及HRV進行檢測，并分析其分子流行病學(xué)特點。結(jié)果445例樣本中共檢出HCoV 34例，檢出率7.64%，其中HCoV?OC43 19例（4.26%），HCoV?HKU1 15例（3.37%），其它亞型未檢出。HRV檢出16例，檢出率3.59%。HCoV?OC43在20?60歲年齡組檢出率最高，為9.48%，且不同年齡組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0011）。HRV在門急診病例中的檢出率比住院病例高，為6.72%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0432）。HCoV?OC43夏季檢出率最高，為7.20%（9／125），HCoV?HKU1夏季檢出率最高，為9.60%（12／125），不同季節(jié)HCoV檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝25.08，P＜0.0001）。HRV春季檢出率最高，為10.17%（6／59），不同季節(jié)檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0449）。HCoV感染陽性樣本Ct值中位數(shù)36.81（35.54?37.49），在住院病例中為36.93（35.54?37.53），在門急診病例中為36.68（31.18?36.84），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HRV陽性樣本Ct值中位數(shù)31.83（27.16?33.65），在住院病例中為28.97（26.39?33.79），在門急診病例中為32.34（30.85?33.65），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論HCoV及HRV流行高峰主要為夏季和春季，其中HCoV?OC43／HCoV?HKU1是HCoV感染的主要亞型。Ct值在一定程度上反映了HCoV和HRV在不同病例類型中病毒載量的差異。

Fund programs：China Mega?project for Infectious Disease Grants from the Ministry of Science and Technology and the Ministry of Health（2013ZX10004601，2014ZX10004001，2012ZX10004?208）；National Key Research and Development Plan（2016YFD0500301）

人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）是一種有包膜、正鏈RNA病毒，基因組全長約28?32Kb［1］。目前，HCoV有6種，其中HCoV?OC43，HCoV?229E，HCoV?HKU1，HCoV?NL63主要引起常見的急性呼吸道癥狀［1?3］。而分別在2003年出現(xiàn)的SARS?CoV以及2012年出現(xiàn)的MERS?CoV則可以引起嚴重呼吸道感染并發(fā)多器官衰竭，致死率高，引起人們高度關(guān)注［4，5］。人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）是一種常見的呼吸道感染病毒之一，超半數(shù)以上急性呼吸道感染都與之有關(guān)，同時亦可引起下呼吸道感染如肺炎［6，7］。盡管國內(nèi)外關(guān)于HCoV與HRV分子流行病學(xué)的研究很多，但我國西北地區(qū)（尤其是青海省）的相關(guān)研究甚少。為了解青海地區(qū)急性呼吸道癥候群人群中HCoV及HRV的流行情況，本研究對該地區(qū)的急性呼吸道癥候群病例鼻咽拭子中的HCoV及HRV進行檢測，并分析其流行病學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 病例定義與樣品類型2012年5月至2015年5月以青海省紅十字醫(yī)院及青海省婦產(chǎn)兒童醫(yī)院作為急性呼吸道癥候群監(jiān)測哨點收集病例，病例納入標準：急性起病，具有發(fā)熱、寒戰(zhàn)、白細胞升高、降低或分布異常等急性感染表現(xiàn)之一，且具有不同程度呼吸道臨床表現(xiàn)（包括咽痛、咽部不適、鼻塞、流涕，鼻／咽／喉明顯充血、水腫、咳嗽，咳痰、氣短，聽診呼吸音異常，胸痛等癥狀之一）。于病人就診12 h內(nèi)采集病例鼻咽拭子，放?70℃留存檢測。病例資料收集采用統(tǒng)一設(shè)計的發(fā)熱癥候群監(jiān)測調(diào)查問卷，由經(jīng)過培訓(xùn)的臨床醫(yī)師完成。內(nèi)容主要包括人口統(tǒng)計學(xué)信息，臨床癥狀、體征、血常規(guī)、臨床生化檢查、影像學(xué)檢查、主要治療和預(yù)后等信息。樣本的采集過程及臨床資料的獲取均具備知情同意。

1.2 核酸提取及病毒檢測使用QIAsymphony SP核酸提取純化分析儀（Qiagen，德國）提取核酸，嚴格按照說明書進行操作，最后溶到60 μl的洗脫緩沖液中。采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real?time reverse transcription?polymerase chain reaction，qRT?PCR）方法對樣本進行檢測。試劑盒為One Step PrimeScriptTMRT?PCR Kit（TaKaRa，日本），檢測HCoV及HRV的引物、探針及反應(yīng)條件參考文獻［8?9］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SAS 9.3軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比（%）表示。偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示?？ǚ綑z驗或者Fisher確切概率法進行計數(shù)資料組間的比較。Wilcoxon秩和檢驗（統(tǒng)計量Z）進行計量資料組間的比較。P＜0.05差異考慮有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般信息本次共采集發(fā)熱呼吸道患者鼻咽拭子445例，男性265例，女性180例。男女比1.42：1。中位年齡16歲，年齡最小出生1 d，最大87歲。住院病例326例，占73.26%。臨床表現(xiàn)發(fā)熱（429例，98.72%），咳嗽（296例，66.52%）為主，但也可見胃腸道反應(yīng)，如腹瀉15例，占3.37%（表1）。

2.2 病毒檢測445例鼻咽拭子樣本中，檢出HCoV 34例，檢出率7.64%，其中HCoV?OC43 19例（4.26%），HCoV?HKU1 15例（3.37%），其余亞型未檢出。HRV檢出16例，檢出率3.59%。HCoV與HRV未見混合感染。HCoV?OC43在20?60歲年齡組檢出率最高，為9.48%，且不同年齡組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0011），不同性別和病例類型中檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HCoV?HKU1在不同年齡，不同性別，不同病例類型中檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HRV在門急診病例中的檢出率比住院病例高，為6.72%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0432），而不同年齡，性別中檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 冠狀病毒和鼻病毒感染病例在不同組間分布比較Tab.1 A comparison analysis of patients with HCoV infection and HRV infection in different groups

2.3 季節(jié)分布HCoV及HRV感染分布存在季節(jié)趨勢。HCoV?OC43夏季檢出率最高，為7.20%（9／125）。HCoV?HKU1夏季檢出率最高，為9.60%（12／125）。不同季節(jié)HCoV檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝25.08，P＜0.0001）；HRV四季均可檢出，春季最高，檢出率10.17%（6／59），不同季節(jié)檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fisher’s確切概率P＝0.0449）（圖1）。

2.4 Ct值分布總體上，HCoV Ct值中位數(shù)36.81（35.54?37.49），HRV Ct值中位數(shù)31.83（27.16?33.65）。HCoV感染住院病例Ct中位數(shù)36.93（35.54?37.53），門診病例Ct值中位數(shù)36.68（31.18?36.84），二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HRV感染住院病例Ct值中位數(shù)28.97（26.39?33.79），門急診病例Ct值中位數(shù)32.34（30.85?33.65），二者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

3 討論

HCoV和HRV是呼吸道感染的常見病毒，二者在普通感冒病例檢出比例分別為10%?15%和30%?50%［6］，同時也可以引起嚴重呼吸道感染癥狀。本研究利用qRT?PCR的方法對青海地區(qū)急性呼吸道癥候群病例進行檢測，首次探討了該地區(qū)急性呼吸道感染人群中HCoV和HRV的分布情況。

圖1 冠狀病毒和鼻病毒陽性檢出季節(jié)分布Fig.1 Season distribution of patients with HCoV infection and HRV infection

陰影部分表示Ct值的概率密度估計，陰影部分的寬度表示樣本Ct觀察值落在相應(yīng)處的比例。同時，中位數(shù)，四分位數(shù)也在圖中展示圖2 不同組Ct值分布的小提琴圖Shaded area represents the density estimation of Ct values，while the width of the shading represents the proportion of observations at that value.The median，inter?quartile range are also shownFig.2 Violin plots of Ct values by different group

本研究共采集鼻咽拭子樣本445例，其中檢測到HCoV 34例，檢出率7.64%，與北京，香港，泰國，意大利等地研究報道［10?13］的HCov在不同人群中的陽性檢出率（2.6%?16.82%）相一致，但明顯高于天津（1.64%）［14］、廣東（2.43%）［15］、成都（0.99%）［16］等省地發(fā)熱呼吸道病人中HCoV的檢出率，這種差異可能與入組病例構(gòu)成、病例采集時間、地點及檢測方法不同有關(guān)。本研究顯示HCoV流行高峰在夏秋季，廣州［17］研究報道HCoV?OC43流行高峰在夏季，HCoV?HKU1主要在冬季，而北京［10］研究報道HCoV?OC43主要流行在春季，HCoV?HKU1沒有明顯季節(jié)流行特點。青海、北京和廣州分別位于高原、平原和沿海地區(qū)，考慮到三研究均采用qPCR的方法進行HCoV檢測，提示高原地區(qū)HCoV?OC43季節(jié)分布與沿海相似但與平原地區(qū)不同上，而HCoV?HKU1與平原及沿海地帶都不同。同時考慮到本研究樣本量較少，因此更多的研究病例是找到季節(jié)流行特點的重要因素。本研究中HCoV?OC43在20?］60歲年齡組檢出率較高，與之前北京地區(qū)研究［10，18］（各年齡組檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義）有差異，但要注意到HCoV?HKU1在60歲以上年齡組中檢出率較高，與其研究一致，提示HKU1在60歲以上人群更容易感染。

多項研究表明HRV在急性呼吸道感染兒童中檢出率約14.2%?23%［19?20］，但潘明等［16］報道發(fā)熱呼吸道癥候群患者中HRV檢出率4.97%。本研究HRV檢出率與之相比略有差異，提示HRV分布存在著地區(qū)間的差異。雖然HRV不同年齡、不同性別檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在住院病例中的檢出率（6.72%）與門急診病例檢出率（2.45%）的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HRV在住院患者中有更高的檢出率，但HRV與住院患者疾病嚴重程度之間的關(guān)系需要更多的研究去證實［19］。HRV在四季均可檢出，與Onyango等［19］研究結(jié)果相一致。但應(yīng)注意，在青海地區(qū)春季HRV有檢出率更高。

qRT?PCR的Ct值在一定程度上反映了檢測樣本中起始病毒載量，F(xiàn)uller JA等［21］報道臨床表現(xiàn)嚴重的群體有著更低的Ct值，即病毒載量更高。本研究中對病例就診12 h內(nèi)采集的鼻咽拭子標本檢測，HCoV與HRV的Ct值中位數(shù)分別為36.81、31.83，提示急性呼吸道感染病例就診時HCoV與HRV病毒載量分布不同，但二者在發(fā)熱呼吸道患者疾病進展的作用，還需要更多研究去證實。HCoV和HRV的Ct值在不同病例類型中分布不同，提示不同類型病例就診時處于不同病毒載量的感染狀態(tài)。

青海地區(qū)作為一個相對封閉的高原地區(qū)，HCoV和HRV有著自己的流行特點。HCoV檢出率高，主要分布在夏秋季節(jié)，主要流行型別為HCoV?OC43／HKU1；HRV全年均可檢出，主要分布在春季?？傮w上，青海地區(qū)急性呼吸道感染病例就診時HCoV及HRV處在不同的病毒載量感染狀態(tài)。本研究闡明了HCoV及HRV在分子流行病學(xué)特點，為青海省急性發(fā)熱呼吸道感染病例的檢測及預(yù)防控制提供了依據(jù)。

［1］ Zumla A，Hui DS，Perlman S.Middle east respiratory syndrome［J］.Lancet，2015，386（9997）：995?1007.doi：10.1016／S0140?6736（15）60454?8.

［2］ Gaunt E，Hardie A，Claas E，et al.Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E，HKU1，NL63，and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real?time PCR method［J］.J Clin Microbiol，2010，48（8）：2940?2947.doi：10.1128／JCM.00636?10.

［3］ Fouchier RA，Hartwig NG，Bestebroer TM，et al.A previously undescribed coronavirus associated with respiratory disease in humans［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（16）：6212?6216.doi：10.1073／pnas.0400762101.

［4］ Zaki AM，van Boheemen S，Bestebroer TM，et al.Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia［J］.N Engl J Med，2012，367（19）：1814?1820.doi：10.1056／NEJMoa1211721.

［5］ Drosten C，Gunther S，Preiser W，et al.Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome［J］.N Engl J Med，2003，348（20）：1967?1976.doi：10.1056／NEJMoa030747.

［6］ Heikkinen T，Jarvinen A.The common cold［J］.Lancet，2003，361（9351）：51?59.doi：10.1016／S0140?6736（03）12162?9.

［7］ Brownlee JW，Turner RB.New developments in the epidemiology and clinical spectrum of rhinovirus infections［J］.Curr Opin Pediatr，2008，20（1）：67?71.doi：10.1097／MOP.0b013 e3282f41cb6.

［8］ Niu P，Shen J，Zhu N，et al.Two?tube multiplex real?time reverse transcription PCR to detect six human coronaviruses［J］.Virol Sin，2016，31（1）：85?88.doi：10.1007／s12250?015?3653?9.

［9］ Gunson R，Collins T，Carman W.Real?time RT?PCR detection of 12 respiratory viral infections in four triplex reactions［J］.J Clin Virol.，2005，33（4）：341?344.doi：10.1016／j.jcv.2004.11. 025.

［10］ Lu R，Yu X，Wang W，et al.Characterization of human coronavirus etiology in chinese adults with acute upper respiratory tract infection by real?time RT?PCR assays［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38638.doi：10.1371／journal.pone.0038638.

［11］ Leung TF，Li CY，Lam WY，et al.Epidemiology and clinical presentations of human coronavirus NL63 infections in hong kong children［J］.J Clin Microbiol，2009，47（11）：3486?3492. doi：10.1128／JCM.00832?09.

［12］ Dare RK，F(xiàn)ry AM，Chittaganpitch M，et al.Human coronavirus infections in rural thailand：A comprehensive study using real?time reverse?transcription polymerase chain reaction assays［J］. J Infect Dis，2007，196（9）：1321?1328.doi：：10.1086／521308.

［13］ Canducci F，Debiaggi M，Sampaolo M，etc.Two?year prospective study of single infections and co?infections by respiratory syncytial virus and viruses identified recently ininfants with acute respiratory disease［J］.J Med Virol，2008，80（4）：716?723. doi：10.1002／jmv.21108.

［14］ 董曉春，李琳，李佳萌，等.天津市發(fā)熱呼吸道癥候群不同類型樣本的病毒病原特征分析［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，（03）：43?46.

［15］ 王雅靜，武婕，康敏，等.2009—2012年廣東省發(fā)熱呼吸道綜合征病毒性病原譜分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2016，（08）：1197?1202.

［16］ 潘明，李天舒，劉李，等.成都市發(fā)熱呼吸道癥候群患者病毒感染調(diào)查［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2011，（11）：861?864.

［17］ 張素粉，徐霖，羅虹嬌，等.2012?2015年廣州地區(qū)人冠狀病毒及其亞型流行病學(xué)特征［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，04：430?433.

［18］ 胡琴，陸柔劍，彭堃，等.人冠狀病毒OC43在北京成人呼吸道感染患者中感染的初步分析［J］.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜，2014，28（2）：117?119.doi：10.3760／cma.j.issn. 1003?9279.2014.02.014.

［19］ Onyango CO，WelchSR，MunywokiPK，etal.Molecular epidemiology of human rhinovirus infections in kilifi，coastal kenya［J］.J Med Virol，2012，84（5）：823?831.doi：10.1002／jmv.23251.

［20］ Lu QB，Wo Y，Wang LY，et al.Molecular epidemiology of humanrhinovirusinchildrenwithacuterespiratorydiseasesin chongqing，china［J］.Sci Rep，2014，4.doi：10.1038／srep06686.

［21］ Fuller JA，Njenga MK，Bigogo G，et al.Association of the CT values of real?time PCR of viral upper respiratory tract infection with clinical severity，kenya［J］.J Med Virol.，2013，85（5）：924?932.doi：10.1002／jmv.23455.

Molecular epidemiology of human coronavirus and rhinovirus among patients with acute respiratory syndrome in Qinghai Province

Liu Gaoshan，Li Hong，Niu Peihua，Shi Yan，Jiang Shuang Ying，Xu Lili，Lu Roujian，Zhao Shengcang，Tan Wenjie

Key Laboratory of Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，China CDC，Beijing 102206，China（Liu GS，Niu PH，Lu RJ，Tan WJ）；Center for Disease Control and Prevention of Qinghai Province，Xining 810007，China（Li H，Shi Y，Jiang SY，Xu LL，Zhao SC）

Liu Gaoshan and Li Hong are the first author who contributed equally to the article

Tan Wenjie，Email：tanwj28＠yahoo．com；Zhao Shengcang，Email：qhzhaoshengcang＠163．com

Acute respiratory syndrome；Human coronavirus：Human rhinovirus；Quantitative real?time reverse transcription polymerase chain reaction；Epidemiology

譚文杰，Email：tanwj28＠yahoo.com；趙生倉，Email：qhzhaoshengcang＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003?9279.2016.06.000

急性呼吸道癥候群；人冠狀病毒，人鼻病毒；熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)；流行病學(xué)

傳染病防治科技重大專項（2013ZX10004601，2014ZX10004001，2012ZX10004?208）；國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500301）

）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the prevalence and molecular epidemiological characteristics of human coronavirus（HCoV）and human rhinovirus（HRV）among patients with acute respiratory syndrome in Qinghai area.MethodsIn total 445 of nasopharyngeal swabs were collected from acute respiratory syndrome group cases in Qinghai during May of 2010 and 2015，six subtypes（?OC43，?HKU1，?229E，?NL63，SARS and MERS）of HCoVs and HRV were detected by quantitative real?time reverse transcription polymerase chain reaction（qRT?PCR）method and related data analyzed.Results34 cases of HCoV were detected in 445 cases（7.64%），of which HCoV?OC43 was 19（4.26%），HCoV?HKU1 15（3.37%），and the other subtypes were not detected.HRV was detected in 16 cases（3.59%）in 445 cases.The HCoV?OC43 positive rate existed statistically significant differences（Fisher’s exact probability P＝0.0011）among different age groups，with a high rate of 9.48%among patients aged 20?60 years.The detection rate of HRV（2.45%，6.72%）in inpatient cases was lower than that of in outpatient and emergency cases（Fisher’s exact probability P＝0.0432）.There were significant differences in detection frequencies of HCoV among seasons（χ2＝25.08，P＜0.0001），with HCoV–OC43 predominant in summer（7.20%）and HCoV?HKU1 dominating in summer（9.60%）.The detection rate of HRV was also significant differences among seasons（Fisher’s exact probability P＝0.0449），with mainly detected in spring（10.17%）.The median of Ct value of sample with HCoV infection and HRV infection was 36.81（35.54?37.49），31.83（27.16?33.65），respectively.There was no significant differences of Ct value between inpatient cases and outpatient and emergency cases（）of HCoV infection and HRV infection.ConclusionsThe seasonal distribution characteristic of HCoV and HRV infections can be found，which HCoV peak in summer and HRV dominate in spring.HCoV?OC43／HKU1 were main epidemic subtypes of HCoV.The Ct value reveals the divergence of viral load of HCoV and HRV in different case type to some extent.