臧學麗

（長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林長春 130031）

納豆激酶生產(chǎn)菌的亞硝基胍誘變

臧學麗

（長春醫(yī)學高等專科學校，吉林長春 130031）

文章研究了產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌的亞硝基胍誘變。采用亞硝基胍為誘變劑誘變枯草芽孢桿菌，誘變后酶活達到4 100U/g，提高了122.2%，為進一步的發(fā)酵研究提供依據(jù)。

納豆激酶 亞硝基胍 枯草芽孢桿菌

納豆激酶（Nattokinase，NK）是由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN）產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，它具有溶解血栓的作用[1]。納豆激酶具有安全、副作用少、成本低、易吸收[2]、在體內(nèi)作用時間長等優(yōu)點[3]，是一種具有開發(fā)潛力的溶栓藥物。文章對產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌進行了化學誘變[4]，使納豆激酶的活性得到顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN），長春醫(yī)學高等?？茖W校生工試驗室保藏。篩選培養(yǎng)基：纖維蛋白平板復篩培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線的測定

在37℃條件下以8%的接種量接種納豆枯草芽孢桿菌于液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h后于600 nm波長的紫外可見分光光度計下測其OD值，3組平行并繪制生長曲線。

1.2.2 納豆激酶活性測定

（1）纖維蛋白平板法：參照Astrup法[5]。

（2）納豆中納豆激酶活力測定。稱取黃豆500 g，洗凈加入2.5倍水，浸泡過夜，分裝到250 ml三角瓶中，121℃高壓滅菌0.5 h，自然冷卻至50℃時以8%的接種量接上種子液，在37℃條件培養(yǎng)25 h。稱取納豆50 g，加入100 ml生理鹽水，浸泡30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋一定的倍數(shù)，采用纖維蛋白平板法測定酶活。

1.2.3 枯草芽孢桿菌的誘變育種

培養(yǎng)納豆枯草芽孢桿菌至菌株的對數(shù)期，4℃冷凍高速離心機中5 000 r/min離心5 min。利用生理鹽水將菌泥均勻打散，并稀釋至菌體濃度為1×108。取上述菌懸液1 ml，加入pH4.5的醋酸鈉緩沖液2 ml，0.1 mol/L亞硝基胍溶液1 ml于37℃培養(yǎng)箱中分別黑暗孵育10、15、20、25 min后，向各樣品中加入0.07 mol/L的pH8.6的磷酸鹽緩沖液20 ml終止反應。取100μl的上述菌懸液涂布到篩選培養(yǎng)基中，37℃避光培養(yǎng)，并計算致死率。

致死率=（0 s時的菌落數(shù)-不同誘變時間的菌落數(shù)）/0 s時的菌落數(shù)×100%

計算在不同誘變劑量條件下的致死率，并制作致死率曲線，查找出致死率為80%～90%的致死劑量，并在最佳的致死劑量條件下進行誘變。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線

通過試驗可以得出，枯草芽孢桿菌的生長周期適中，8 h進入對數(shù)期，24 h后進入穩(wěn)定期，延滯期較短，適合應用工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。

2.2 對納豆枯草芽孢桿菌進行亞硝基胍誘變

致死劑量為80%～90%時，菌株的突變率最高，通過試驗可看出，枯草芽孢桿菌在亞硝基胍的誘變時間為20 min時菌株的致死率為85%，所以該研究中選擇的亞硝基胍誘變時間為20 min。對亞硝基胍誘變的菌種進行發(fā)酵，比較誘變前后的酶活，誘變后酶活達到4 100U/g，酶活提高了122.2%，誘變效果較好，經(jīng)過10代的傳代培養(yǎng)，誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌經(jīng)過亞硝基胍誘變，酶活提高了122.2%，酶活達到4 100U/g。

[1] 李淑英，趙仲麟，聶瑩，等．納豆激酶研究進展．中國農(nóng)業(yè)科技導報，2013，（4）：139～143

[2] He Ni，Peng-Cheng Guo，Wei-Ling Jiang，et al．Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body．Journal of Biotechnology，2016

[3] 逯京華，孫智杰．納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望．生物技術(shù)通報，2009，（8）：41～45

[4] 王樂．納豆激酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究．山東輕工業(yè)學院，2009

[5] Sumi．Experimentia，1987，43：1110～1111