崔 新，劉志薇，吳致君，李 輝，王文麗，莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，南京 210095)

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茶樹谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及其表達(dá)分析

崔 新，劉志薇，吳致君，李 輝，王文麗，莊 靜*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，南京 210095)

該研究基于茶樹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR方法從茶樹‘黃金芽’cDNA中克隆獲得茶樹谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因(CsAlaAT)，利用熒光定量PCR方法，對(duì)CsAlaAT在茶樹材料‘迎霜’和‘黃金芽’不同組織、溫度脅迫與激素處理的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：CsAlaAT基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸，含有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族(Aspartate aminotransferase family)典型的AAT-like保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)顯示，該序列與多個(gè)相關(guān)物種的序列一致性達(dá)78.83%，與磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合的10個(gè)氨基酸殘基以及第358位賴氨酸催化位點(diǎn)在物種間高度保守。茶樹CsAlaAT蛋白屬親水性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為60 877.5 D，等電點(diǎn)為6.11，堿性、酸性、脂肪族和芳香族氨基酸比例分別為12%、11%、22%和8%，無序化特征不明顯，與大麥HvAlaAT具有相似的三維結(jié)構(gòu)。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，CsAlaAT在茶樹‘迎霜’和‘黃金芽’中的表達(dá)均具有組織特異性，且均在根部的表達(dá)量最高；CsAlaAT響應(yīng)高溫(38 ℃)和低溫(4 ℃)脅迫的表達(dá)上調(diào)；外源施用脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)能夠抑制茶樹中CsAlaAT基因的表達(dá)。

茶樹；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；多序列比對(duì)；溫度脅迫；激素；表達(dá)分析

茶是世界三大無酒精飲料之一，茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) O．Kuntze．〕為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.)多年生常綠木本植物[1-2]。作為一種重要的商業(yè)飲料作物，茶樹在中國(guó)、肯尼亞、斯里蘭卡、印度等地均有種植，栽培歷史悠久[3-4]。茶葉中含有許多對(duì)人體健康有益的次級(jí)代謝物質(zhì)，包括茶氨酸、茶多酚、咖啡因和芳香油等[5]。其中茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶樹特征性非蛋白質(zhì)氨基酸，由Sakato首次從綠茶葉片中提取出并命名為茶氨酸[6]。

茶氨酸具有焦糖的香味和類似于味精的鮮爽味，能中和茶湯中的苦澀感，是茶葉品質(zhì)的重要影響因素之一。茶樹氮素代謝途徑中，氮素大部分以茶氨酸的形式進(jìn)行儲(chǔ)存和代謝[7-8]。茶氨酸的合成與分解，與茶樹的呼吸代謝和某些物質(zhì)的代謝有關(guān)，并與茶樹碳氮代謝的調(diào)節(jié)和控制有關(guān)[9]。通過同位素標(biāo)記研究證實(shí)茶樹茶氨酸的代謝前體為谷氨酸和乙胺[7]，通過L-茶氨酸合成酶(TS)在ATP、mg2+、K+的催化下合成[10]。目前，與茶氨酸生物合成直接相關(guān)的酶已經(jīng)有很多研究報(bào)道，然而其中鮮有對(duì)參與茶氨酸代謝前體合成的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的報(bào)道。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，AlaAT)又稱為丙氨酸轉(zhuǎn)移酶，是一種依賴磷酸吡哆醛(PLP)作為輔酶的轉(zhuǎn)氨酶，廣泛分布于動(dòng)物、植物、真菌和一些細(xì)菌中[11]。在不同的物種中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶可分為2～6個(gè)亞型，通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其亞型可分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和過氧化酶體中[12]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶可逆地催化丙酮酸和谷氨酸生成丙氨酸和戊酮二酸[13]，在茶樹中這個(gè)可逆反應(yīng)是茶氨酸代謝前體丙氨酸合成的主要途徑，丙氨酸再通過丙氨酸脫羧酶(ADC)脫去羧基形成乙胺用于合成茶氨酸。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶在植物氮素同化、蛋白質(zhì)合成和碳代謝中發(fā)揮重要作用。有研究表明，過表達(dá)OsAlaAT基因的水稻可顯著提高產(chǎn)量[14]；Yang等[15]證實(shí)在低氧環(huán)境下，OsAlaAT基因參與調(diào)控水稻種子胚乳中淀粉的合成。谷丙轉(zhuǎn)氨酶也與植物抵御非生物脅迫有關(guān)，在擬南芥中缺氧環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)AtAlaAT的表達(dá)[16]；也有研究指出AlaAT的活性在植物經(jīng)受干旱脅迫后的復(fù)水階段輕微上升，協(xié)助植物恢復(fù)正常代謝[17]。

本研究從茶樹品種‘黃金芽’(C.sinensisvar. Huangjinya)中克隆獲得茶樹谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因(CsAlaAT)，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)等分析。同時(shí)采用熒光定量PCR方法，對(duì)茶樹CsAlaAT基因在2個(gè)茶樹材料‘迎霜’(C.sinensisvar. Yingshuang)和‘黃金芽’不同組織、不同溫度脅迫及不同激素處理的表達(dá)分析，探討了谷丙轉(zhuǎn)氨酶的組織表達(dá)差異與溫度脅迫下的響應(yīng)，為后續(xù)茶樹中谷丙轉(zhuǎn)氨酶功能以及茶氨酸代謝的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試茶樹材料‘黃金芽’和‘迎霜’種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，為2年生扦插幼苗，于2016年春季選取正常生長(zhǎng)無病害茶樹植株的根、莖、嫩葉和成熟葉進(jìn)行總RNA提取及cDNA合成。對(duì)正常植株分別進(jìn)行溫度脅迫處理與外源激素處理， 4 ℃、38 ℃、0.1 mmol/L ABA、1 mmol/L GA分別處理2、8、和24 h，提取葉片組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以未處理植株作為對(duì)照。另外，以茶樹品種‘黃金芽’葉片的cDNA為模板進(jìn)行茶樹CsAlaAT基因克隆。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹CsAlaAT基因克隆 茶樹總RNA按照Quick RNA Isolation Kit(北京華越洋生物科技有限公司)試劑盒操作說明提取，提取RNA樣品濃度由微量紫外檢測(cè)儀NanoDrop測(cè)定，RNA質(zhì)量用12 g·L-1變性瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)。cDNA合成按照 Prime Script RT reagent Kit(大連TaKaRa公司) 試劑盒操作說明完成?；诒緦?shí)驗(yàn)室獲得的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]設(shè)計(jì)1對(duì)引物(5′-ATGTGGAAATTCGTAGCCGAC-3′和3′- ATCACGAAATTCATCCATGAA-5′)。以‘黃金芽’cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL體系：ddH2O 7 μL，ExTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目標(biāo)膠塊，參照DNA回收試劑盒說明書將其回收純化，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，挑取陽性克隆菌液送至南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.2 序列分析 利用NCBI網(wǎng)站相關(guān)程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)獲得的核苷酸和蛋白序列進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索和保守域預(yù)測(cè)。序列多重比對(duì)、組成成分和理化性質(zhì)用DNAMAN 6.0和EXPASY(http://web.expasy.org/protparam/)軟件完成；使用MEGA6[19]完成進(jìn)化樹測(cè)試和編輯并生成報(bào)告圖形；利用Foldindex[20]程序和SOPMA[21]程序完成蛋白質(zhì)無序化特性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。采用Swiss-model[22]軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三維分子結(jié)構(gòu)分析。熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistic 20和 Microsoft Excel2010軟件制作完成。

1.2.3 茶樹CsAlaAT基因的表達(dá)分析 熒光定量PCR按照SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)操作說明進(jìn)行。根據(jù)本克隆的‘黃金芽’CsAlaAT基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物(5′-CGAGTCCTACGAGTCTTATTATGC-3′和3′-GGAGGCGTTGACAATAGAATG-5′)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并分別用茶樹Actin基因和TBP基因作為內(nèi)參，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增[23]。在Bio-CFX96 Real-time PCR System 中完成熒光定量PCR。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，然后利用 Bio-cfx manager進(jìn)行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法[24]進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsALaAT基因克隆

以‘黃金芽’葉片的cDNA為模板，擴(kuò)增得到長(zhǎng)約1 700 bp片段。序列分析結(jié)果表明，該片段含有1個(gè)長(zhǎng)度為1 662 bp開放閱讀框(ORF)，共編碼553個(gè)氨基酸(圖1)。

2.2 茶樹CsAlaAT序列比對(duì)和進(jìn)化分析

對(duì)茶樹CsAlaAT基因推導(dǎo)氨基酸的保守域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3，A)顯示，第154～528位序列含有1個(gè)典型AAT-like保守結(jié)構(gòu)域，該序列還包含磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合位點(diǎn)[25]和一個(gè)參與形成席夫堿(Schiffbase)或醛亞胺配體(aldimine intermediate)的催化殘基第358位賴氨酸(Lys)[26]，以及形成二聚體多肽結(jié)合位點(diǎn)的8個(gè)氨基酸殘基，以上特征表明CsAlaAT屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族。

此外，將茶樹CsAlaAT同大麥(Hordeumvulgare)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicanapus)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)的AlaAT氨基酸序列進(jìn)行多重對(duì)比，結(jié)果顯示一致性為78.83%。其中上述物種的AlaAT均含有AAT-like結(jié)構(gòu)域，其中構(gòu)成磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合位點(diǎn)的10個(gè)氨基酸殘基，包括一個(gè)與PLP形成醛亞胺鍵的關(guān)鍵賴氨酸殘基，在上述物種間一致，具有高度的保守性(圖3，B)。

為了進(jìn)一步分析茶樹CsAlaAT的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行Blast同源檢索與比對(duì)，得到不同物種間與其相似程度較高的AlaAT蛋白氨基酸序列，選取毛果楊(Populustrichocarpa)、可可(Theobromacacao)、甜椒(Capsicumannuum)、煙草(N.tabacum)、蕪菁(Brassicarapa)、咖啡(Coffeacanephora)、番茄(Solanumlycopersicum)、罌粟(Papaversomniferum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甜瓜(Cucumismelo)、馬鈴薯(S.tuberosum)、大豆(Glycinemax)、擬南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa)、大麥(H.vulgare)、油菜(B.napus)、玉米(Z.mays)的AlaAT氨基酸序列構(gòu)建同源進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，茶樹CsAlaAT氨基酸序列與咖啡、甜瓜等的進(jìn)化關(guān)系較近，與水稻、玉米等的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

2.3 茶樹CsAlaAT氨基酸組成及理化性質(zhì)分析

根據(jù)茶樹CsAlaAT氨基酸序列在BLAST同源檢索與比對(duì)，獲得不同植物中相似度較高的AlaAT氨基酸序列，利用ExPASy-ProtParam對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列組成及理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示(表1)，在這些植物中AlaAT蛋白殘基數(shù)為481～575。相對(duì)分子質(zhì)量為(5.2～6.3)×104；堿性氨基酸比重略多于酸性氨基酸，等電點(diǎn)范圍為5.3～7.5之間。脂肪族氨基酸占比22%左右，芳香族占比8%；總平均疏水性(GRAVY)均為負(fù)值，表明這些蛋白均屬于親水性蛋白。

圖1 茶樹CsALaAT核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of CsAlaAT from tea plant

2.4 茶樹CsAlaAT氨基酸序列的無序化分析

利用FoldIndex程序?qū)sAlaAT氨基酸序列進(jìn)行了折疊的無序化分析。結(jié)果顯示(圖4)：序列中無序化區(qū)域共有2個(gè)，最大無序化區(qū)域含28個(gè)氨基酸，總的無序化氨基酸數(shù)目為42，無序化比例為7.59%；總體而言CsAlaAT氨基酸序列無序化不明顯。

2.5 茶樹CsAlaAT的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從茶樹CsAlaAT全序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

可知(圖5)，CsAlaAT蛋白由41.41%的α螺旋，16.09%的β-折疊，12.84%的β-轉(zhuǎn)角和26.66%的隨機(jī)卷曲組成。結(jié)果表明，α-螺旋是CsAlaAT的主要組成部分，而β轉(zhuǎn)角和β-折疊則散布于CsAlaAT蛋白序列中。

圖2 茶樹CsAlaAT與其他物種氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of amino acid sequences of the CsAlaAT

以大麥HvAlaAT(PDB ID:3TCM)為模型，對(duì)CsAlaAT進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析，結(jié)果顯示HvAlaAT與CsAlaAT的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似(圖6)，一致性為78.38%。茶樹CsAlaAT在細(xì)胞內(nèi)以二聚體的形式存在，其結(jié)構(gòu)域與HVAlaAT相比均包括蛋白質(zhì)N端(3～63)、一個(gè)較小的αβ-結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基64～107，396～517)和一個(gè)較大的αβα-結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基107～395)，活化位點(diǎn)以及PLP加合物(PLP adduct)處于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中間。

上劃線部分為AAT-like結(jié)構(gòu)域，下標(biāo)三角形的為PLP結(jié)合位點(diǎn)，下標(biāo)矩形的為催化位點(diǎn)圖3 茶樹CsAalAT保守域(A)及與其他物種氨基酸序列的多重對(duì)比(B)Upper score represents the AAT-like conserved domain; triangles represent the PLP binding sites; rectangle represents the catalytic residue respectivelyFig.3 The conserved domain (A) of CsAalAT and alignment of amino acid sequences from tea plant and other different plants (B)

序列圖中下劃線代表無序狀態(tài)的氨基酸，無下劃線代表有序狀態(tài)的氨基酸，坐標(biāo)圖中正負(fù)數(shù)值分別表示蛋白的有序和無序狀態(tài)圖4 CsAlaAT折疊狀態(tài)的分析Amino acids represented ordered and non-ordered regions are shown in non-underline and underline, respectively; Positive and negative numbers represent ordered and disordered protein, respectivelyFig.4 Prediction of the folding state of CsAlaAT

植物Plant名稱Name登錄號(hào)GenBankNo．總氨基酸數(shù)目Totalaminoacid/aa相對(duì)分子質(zhì)量Molecularweight/D理論等電點(diǎn)pI各氨基酸比例Compositionofaminoacid/%堿性Basic酸性Acid脂肪族Aliphatic芳香族Aromatics總平均疏水性Grandaverageofhydropathicity茶樹C．sinensisCsAlaAT55360877．56．111211228-0．209擬南芥A．thalianaAtAlaAT2NP＿565040．254059510．65．951312218-0．269咖啡C．canephoraCaAlaATCDO97792．148753518．95．441212228-0．213甜瓜C．meloCmAlaAT2XP＿008460348．151356307．16．251211228-0．176大豆G．maxGmAlaAT1ABW17196．148653320．65．311112218-0．213甜椒C．a(chǎn)nnuumCaAlaATAAR05449．148152793．25．291112238-0．147煙草N．tabacumNtAlaAT2XP＿016473669．154760127．46．011211218-0．233番茄S．lycopersicumSlAlaAT2XP＿004235527．157563179．27．541311228-0．184馬鈴薯S．tuberosumStAlaAT2XP＿006342897．154559613．75．891211218-0．219水稻O．sativaOsAlaATAAK52114．148452692．36．221111238-0．110油菜B．napusBnAlaATXP＿013744571．154059573．06．251312218-0．241玉米Z．maysZmAlaATAAC62456．148252997．76．291211229-0．165大麥H．vulgareHvAlaAT39575927350055135．76．061412228-0．214

藍(lán)色. α-螺旋；紅色. β-折疊；綠色. β-轉(zhuǎn)角；粉色. 隨機(jī)卷曲圖5 茶樹CsAlaAT的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Blue. Alpha helix, Red. Extended strand, Green. Beta turn, Pink. Random coilFig.5 The secondary structure of the deduced CsAlaAT polypeptide

圖6 茶樹CsAlaAT的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The three-dimension structures of CsAlaAT from tea plant

2.6 茶樹CsAlaAT基因在茶樹不同部位的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CsAlaAT基因在茶樹‘迎霜’和‘黃金芽’不同部位的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，茶樹CsAlaAT基因在‘迎霜’和‘黃金芽’中的表達(dá)模式較為相似，均在根部表達(dá)量最高(圖7)?！汀S金芽’CsAlaAT基因表達(dá)量由高到低均為根、莖、成熟葉、幼葉；根的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)部位，幼葉和成熟葉表達(dá)量較為接近。此外，CsAlaAT基因在‘黃金芽’根部的表達(dá)量顯著高于在‘迎霜’根部的表達(dá)量，為‘迎霜’根部的26.3倍。

2.7 CsAlaAT基因不同溫度和激素處理下的表達(dá)情況

茶樹‘迎霜’在4 ℃低溫、ABA處理和GA處理下，CsAlaAT表達(dá)量較對(duì)照均表現(xiàn)出一定程度下調(diào)，基本趨勢(shì)為處理初的2 h左右表達(dá)量最低，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量有一定回升，但仍顯著低于對(duì)照(圖8，A)?！S金芽’與‘迎霜’的CsAlaAT基因在38 ℃高溫處理下，表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照均有上調(diào)，在處理2、8、24 h后的表達(dá)量分別為對(duì)照的1.7、1.1、

2.4倍和4.2、2.5、2.1倍(圖8，B)。茶樹品種‘黃金芽’，在4 ℃低溫處理下，表達(dá)量相較對(duì)照有一定上調(diào)，在處理2、8、24 h后分別為對(duì)照的1.2、1.7和1.6倍(圖8，C)。在ABA處理下，‘黃金芽’的CsAlaAT基因表達(dá)與‘迎霜’的表達(dá)模式相似，即處理最初下調(diào)最顯著，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)開始有一定回升。在GA處理下，‘黃金芽’的CsAlaAT在處理2 與8 h情況下，下調(diào)量并未達(dá)到顯著水平，在持續(xù)處理24 h后，下調(diào)量達(dá)到顯著水平(圖8,D)。

不同小寫字母表示同一品種不同組織的差異顯著(P<0.05)圖7 CsAlaAT基因在茶樹不同組織的表達(dá)Different letters represent significant difference among tissues of two cultivarsFig.7 Expression analysis of AlaAT in different tissues

不同小寫字母表示同一品種不同處理的差異顯著(P<0.05)圖8 CsAlaAT基因在不同處理下的表達(dá)Different letters represent significant difference among different treatments of two cultivars (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of CsAlaAT under different stress treatments

3 討 論

谷丙轉(zhuǎn)氨酶是一類依賴磷酸吡哆醛作為輔酶的轉(zhuǎn)氨酶類，其催化的可逆反應(yīng)中可利用的底物有碳代謝中關(guān)鍵的戊酮二酸、丙酮酸，以及參與氮素同化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的谷氨酸。谷丙轉(zhuǎn)氨酶在植物的碳氮代謝有著不可或缺的作用，研究也證實(shí)其可協(xié)助植物抵御脅迫[27-28]。本實(shí)驗(yàn)從茶樹品種‘黃金芽’中克隆出長(zhǎng)約1 700 bp片段，該片段含有1個(gè)典型的AAT-like保守結(jié)構(gòu)域，屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族。與多種親緣關(guān)系相近的植物AlaAT氨基酸序列具有較高的相似性和相近的理化性質(zhì)。推導(dǎo)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與大麥HvAlaAT三級(jí)結(jié)構(gòu)一致性較高，以二聚體的形式進(jìn)行催化，參與形成希夫堿的活化位點(diǎn)第358位賴氨酸(Lys)殘基在2個(gè)物種間保持一致。

‘黃金芽’和‘迎霜’不同組織和不同逆境處理下表達(dá)分析顯示，茶樹CsAlaAT基因表達(dá)具有組織特異性，均在根部表達(dá)量最高。其中‘黃金芽’根部表達(dá)量顯著地高于‘迎霜’根部表達(dá)量。Rocha等[29]測(cè)量了谷丙轉(zhuǎn)氨酶在大豆(Glycinemax)中的組織特異性表達(dá)，GmAlaAT在接種了根瘤菌的大豆植株的根部表達(dá)量最高，高于沒接種根瘤菌的根部表達(dá)量，也高于在葉和豆莢中的表達(dá)量。這個(gè)結(jié)果同CSAlaAT在‘黃金芽’中的表達(dá)模式相似。接種根瘤菌可提高大豆的氮素同化率[30]，‘黃金芽’屬白化茶樹品種，具有氨基酸含量高，茶多酚和咖啡因量適中的特點(diǎn)[31]，推測(cè)其根部大量的茶氨酸合成和旺盛的氮素同化是CsAlaAT在根部表達(dá)量高的可能原因。

目前，對(duì)茶氨酸代謝相關(guān)的研究較多，然而對(duì)茶樹谷丙轉(zhuǎn)氨酶研究報(bào)道較少，對(duì)其在茶樹碳氮代謝以及抵御脅迫中的作用和機(jī)理有待深入研究。對(duì)茶樹谷丙轉(zhuǎn)氨酶及其家族成員的研究，可作為一個(gè)新的角度來理解茶樹茶氨酸代謝與碳氮代謝之間的聯(lián)系以及其響應(yīng)茶樹非生物脅迫的分子機(jī)理。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of the Gene Encoding Alanine Aminotransferase inCamelliasinensis

CUI Xin, LIU Zhiwei, WU Zhijun, LI Hui, WANG Wenli, ZHUANG Jing*

(College of Horticulture, Tea Science Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Alanine aminotransferase (AlaAT) is a pyridoxal-5′-phosphate-dependent (PLP) enzyme which plays a critical role in linking carbon and nitrogen metabolism. AlaAT is also involved in plant responses to abiotic stress. In this study, based on the transcriptome data of tea plant, we clonedCsAlaATgene encoding alanine aminotransferase from cDNA of ‘Huangjinya’ by RT-PCR method. In addition, the expression profiles of theCsAlaATgene in different tissues and under extreme temperatures and hormone treatments in two tea plant varieties (‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’) were analyzed by quantitative real time PCR. Results showed that the length of open reading frame (ORF) ofCsAlaATgene was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. CsAlaAT contains typical conserved AAT-like domain which belongs to Aspartate aminotransferase family. Multiple alignments of CsAlaAT with related plant species showed that the identity of them was 78.83%. The PLP binding sites and the catalytic residue of 358 Lys were highly conserved. The CsAlaAT is hydrophilic protein. Its theoretical relative molecular weight is 60 877.5 D. Theoretical isoelectric point is 6.11. Percentages of basic, acidic, aliphatic and aromatic amino acids were 12%, 11%, 22% and 8%, respectively. A three-dimension crystal structure of CsAlaAT was established on the basis of the HvAlaAT which share identity of 78.38% with CsAlaAT. Quantitative real-time PCR analysis of the expression profiles showed that theCsAlaATgene was tissue-specific expressed in two tea plant varieties ‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’. The highest expression level was found in the root. TheCsAlaATgene could respond to high temperature (38 ℃) and low temperature (4 ℃) treatments. Exogenous application of abscisic acid (ABA) and gibberellins (GA) could down-regulated theCsAlaAT.

Camelliasinensis; alanine aminotransferase; multiple alignment; temperature stress; hormone; expression profiles

1000-4025(2016)12-2361-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2361

2016-10-18;修改稿收到日期:2016-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31570691)

崔 新(1992-)，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。E-mail: 2015104091@njau.edu.cn

*通信作者:莊 靜，教授，博士生導(dǎo)師,主要從事茶樹遺傳育種與茶樹分子生物學(xué)研究。E-mail: zhuangjing@njau.edu.cn

Q785;Q786

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