魏情情，包曙光，門淑珍

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

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擬南芥砷誘導(dǎo)基因At4g13180的表達(dá)模式研究

魏情情，包曙光，門淑珍*

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)砷誘導(dǎo)基因At4g13180編碼蛋白是短鏈脫氫酶(Short-Chain Dehydrogenase/Reductase Superfamily，SDR)家族的成員之一，其過表達(dá)可以增強(qiáng)植物對過氧化氫的耐受性。該實(shí)驗(yàn)通過半定量RT-PCR，構(gòu)建ProAt4g13180:GUS、At4g13180-EGFP和At4g13180-OE表達(dá)載體，獲得At4g13180基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，并研究了At4g13180基因的表達(dá)模式及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，At4g13180基因在根尖、葉脈、萼片和花絲等組織都強(qiáng)烈表達(dá)，該基因編碼蛋白主要定位于胞質(zhì)和核中。該研究結(jié)果為深入探究擬南芥砷誘導(dǎo)基因At4g13180的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

擬南芥；砷；短鏈脫氫酶；表達(dá)模式；亞細(xì)胞定位；過表達(dá)

高砷(As)地下水是一個全球性的環(huán)境問題，世界范圍內(nèi)廣泛分布的高砷地下水給人們的健康造成了極大的威脅[1-2]。在中國，地下水引起的土壤污染中砷排第六位，灌溉引起的土壤污染中砷排第五位[3]。植物體受到重金屬污染時，其體內(nèi)的活性氧含量會升高，造成氧化脅迫。為了應(yīng)對這種脅迫，植物體會產(chǎn)生抗氧化物和抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和抗壞血酸氧化酶(APOX)等以清除過量的活性氧[4]。Catarecha等[5]鑒定出2個As誘導(dǎo)基因，命名為ASI3(At4g13180)和ASI4 (At4g33540)，分別編碼短鏈脫氫酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDRs)和乙二醛酶II。通過實(shí)驗(yàn)證明At4g13180基因不響應(yīng)鎳(Ni)和鎘(Cd)，只響應(yīng)As，說明At4g13180基因不是脅迫誘導(dǎo)基因，而是受砷特異誘導(dǎo)的基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)At4g13180基因表達(dá)量對于砷的響應(yīng)具有劑量效應(yīng)，隨As濃度的升高，At4g13180基因的表達(dá)增強(qiáng)。但是對于At4g13180基因在植物響應(yīng)砷脅迫中的功能尚不清楚。

At4g13180基因所編碼蛋白是短鏈脫氫酶SDRs家族的成員之一。SDRs超基因家族含有保守的“Rossmann”結(jié)構(gòu)域，通常催化NAD(P)依賴的氧化還原反應(yīng)[6-7]。Rossmann折疊廣泛存在于蛋白家族中，在以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)及黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的蛋白質(zhì)中都有此結(jié)構(gòu)域，尤其是參與糖代謝的各種酶[8]。

之前的研究表明，At4g13180基因過表達(dá)可以增強(qiáng)植物對過氧化氫的耐受性，可能參與H2O2清除過程[9]。目前，對于At4g13180基因時空表達(dá)模式及其所編碼蛋白的亞細(xì)胞定位尚未有研究報道。本實(shí)驗(yàn)通過半定量RT-PCR檢測了At4g13180基因在擬南芥中的組織表達(dá)水平，構(gòu)建了At4g13180-EGFP和ProAt4g13180:GUS融合載體，詳細(xì)分析了At4g13180基因的時空表達(dá)模式及其編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Col-0，克隆構(gòu)建所用的大腸桿菌DH5α，擬南芥轉(zhuǎn)化所用的根瘤農(nóng)桿菌C58C1，均由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院門淑珍教授實(shí)驗(yàn)室保存。T-DNA插入突變體(SALK_076072)種子購買自Arabidopsis Biological Resourse Center(美國哥倫布)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化 將PCR擴(kuò)增得到的At4g13180基因啟動子片段(-1 296～-1)連接到pGreenⅡ0229-GUS 載體的GUS報告基因前，獲得ProAt4g13180:GUS表達(dá)載體。將At4g13180基因的啟動子及基因序列的PCR產(chǎn)物(-1 296～+789)連接到pGreenⅡ0229-EGFP 載體中，獲得At4g13180-EGFP基因融合表達(dá)載體。將PCR擴(kuò)增得到的At4g13180基因開放閱讀框序列連接到過表達(dá)載體pBA002中，獲得At4g13180基因的過量表達(dá)載體(At4g13180-OE)。

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花苞浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-0植株，利用Basta篩選抗性植株，并進(jìn)行PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.2.2 RNA提取及半定量RT-PCR 用Trizol法提取Col-0野生型擬南芥不同組織(7日齡的幼苗、根、莖、蓮座葉、莖生葉、花序、果莢)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，用于At4g13180基因表達(dá)模式的分析。提取At4g13180基因突變體SALK_076072、At4g13180-OE植株7日齡幼苗的總RNA，用于鑒定At4g13180基因在突變體和過量表達(dá)植株中的表達(dá)水平。ACTIN2基因作為內(nèi)參。

1.2.3 GUS染色 將ProAt4g13180:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織材料放入GUS染色液中，于37℃下染色11 h，經(jīng)70%乙醇脫色，固定劑(乙醇∶乙酸= 3∶1)固定脫色3 h后，進(jìn)行透明劑(水合氯醛∶蒸餾水∶甘油=8∶3∶1)處理后拍照分析。

1.2.4At4g13180基因所編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析 選取At4g13180-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥的T2代幼苗，在共聚焦顯微鏡下對根部細(xì)胞進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 At4g13180基因組織特異性表達(dá)分析

為了探究擬南芥中At4g13180基因的組織特異性表達(dá)水平，利用半定量RT-PCR檢測了Col-0野生型擬南芥的7日齡整株幼苗，以及根、莖、蓮座葉、莖生葉、花序和果莢等不同組織中At4g13180基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示At4g13180基因在7日齡整株幼苗、根、莖生葉及果莢中表達(dá)量較高，在莖、蓮座葉、花序中表達(dá)則很弱(圖1)。

為了更精確地對該基因的組織特異性進(jìn)行分析研究，分別觀察了ProAt4g13180:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的5日齡幼苗、2周齡植株、3周齡植株的蓮座葉以及花序的GUS顯色反應(yīng)，以檢測At4g13180基因表達(dá)的組織特異性。從圖2可以看出，ProAt4g13180:GUS在各個組織部位都有較強(qiáng)的表達(dá)。其中，在5日齡幼苗的根、子葉、下胚軸、根毛、中柱都有較強(qiáng)的表達(dá)，尤其以子葉葉脈、根尖、下胚軸表達(dá)更為強(qiáng)烈(圖2，A～D)。在2周齡植株中，At4g13180基因在葉脈、葉尖和根中表達(dá)較強(qiáng)(圖2，E)。另外，在3周齡植株蓮座葉的葉脈中仍有穩(wěn)定的較強(qiáng)表達(dá)(圖2，F(xiàn))。At4g13180基因啟動子在花的萼片和花柱、果莢頂端及角果底部與果柄連接處表達(dá)較強(qiáng)，在其他部位表達(dá)較弱(圖2，G～H)。表明At4g13180基因在擬南芥的生活周期中存在持續(xù)較強(qiáng)的表達(dá)。

SE.幼苗；R.根；ST.莖；RL.蓮座葉；CL.莖生葉；F.花序；SI.果莢圖1 At4g13180基因在擬南芥不同組織中的表達(dá)情況SE. Seedling；R. Root；ST. Stem；RL. Rosette leaf；CL. Cauline leaf；F. Flower；SI. SiliqueFig.1 Expression levels of At4g13180 gene in various Arabidopsis thaliana tissues

A.5日齡幼苗根尖；B.根冠細(xì)胞圖3 At4g13180-EGFP的亞細(xì)胞定位A. Root tip of 5-day-old seedling；B. Lateral root cap cellsFig.3 Subcellular location of At4g13180-EGFP

A.5日齡幼苗；B.幼苗子葉的放大圖；C.幼苗下胚軸及根部連接處；D.幼苗根部的放大圖；E.2周齡植株；F.3周齡植株的蓮座葉；G.花序；H.花圖2 ProAt4g13180:GUS轉(zhuǎn)基因植株的 GUS 染色分析A. Five-day-old seedling；B. Magnified figure of seedling cotyledon；C. The junction of seedling hypocotyl and root；D. Magnified figure of seedling root； E. 2-week-old plant；F. 3-week-old rosette leaf；G. Inflorescence；H. FlowerFig.2 GUS staining of ProAt4g13180:GUS transgenic plants were analyzed

A. At4g13180基因結(jié)構(gòu)圖及SALK_076072突變體T-DNA插入位點(diǎn)，其中淺灰色框代表5′和3′非翻譯區(qū)，黑色框代表基因編碼區(qū)；B. PCR篩選到SALK_076072純合突變體；C.RT-PCR顯示SALK_076072純合體是At4g13180基因的表達(dá)下調(diào)突變體； ACTIN2作為內(nèi)參圖4 At4g13180基因突變體SALK_076072的鑒定A. Schematic of the At4g13180 gene structure and T-DNA insertion site in SALK_076072, gray boxes indicate 5′ and 3′ untranslated regions, black box indicate coding region；B. PCR results of SALK_076072 genotyping；C. RT-PCR analysis of expression level of At4g13180 gene in wild-type and SALK_076072；ACTIN2 gene was used as reference geneFig.4 Identification of SALK_076072，the T-DNA insertion mutant of At4g13180 gene

2.2 At4g13180-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根中的EGFP熒光檢測

對At4g13180-EGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行熒光觀察，發(fā)現(xiàn)At4g13180-EGFP的表達(dá)情況與GUS染色結(jié)果一致，在根中表達(dá)較強(qiáng)，并且在根的分生區(qū)、伸長區(qū)都有表達(dá)。另外觀察到At4g13180-EGFP在側(cè)根冠細(xì)胞表達(dá)較表皮細(xì)胞強(qiáng)，這暗示該基因可能參與植物對土壤逆境的響應(yīng)。利用共聚焦熒光顯微鏡觀察At4g13180-EGFP的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，At4g13180-EGFP融合蛋白定位于核與胞質(zhì)中(圖3，A～B)。

2.3 At4g13180基因突變體的獲得及分子鑒定

A.過表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖；B. At34g13180-OE 轉(zhuǎn)基因植株中 At4g13180 基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，ACTIN2作為內(nèi)參基因圖5 At4g13180基因過表達(dá)載體構(gòu)建示意圖及過表達(dá)植株中At4g13180基因的轉(zhuǎn)錄水平A. Schematic diagram of overexpression vector；B. RT-PCR analysis of expression levels of At4g13180 gene in wild-type and positive transgenic plants；ACTIN2 gene was used as reference geneFig.5 Schematic diagram of vector construction for over expression of the At4g13180 gene and transcription levels of At4g13180 gene in At4g13180-OE plants

從擬南芥種質(zhì)資源庫(Arabidopsis Biological Resourse Center，大學(xué)俄亥俄，美國)訂購到At4g13180基因的T-DNA插入突變體SALK_076072，T-DNA插入位點(diǎn)位于At4g13180基因的啟動子區(qū)域，起始密碼子上游284個堿基處(圖4，A)。通過PCR篩選到該基因的純合突變體(圖4，B)。通過半定量RT-PCR確定這個突變體中At4g13180基因仍有微弱表達(dá)，但是其表達(dá)量與野生型相比顯著下降，因此它是一個基因表達(dá)下調(diào)突變體(圖4，C)。在正常生長條件下，SALK_076072突變體未表現(xiàn)出明顯的生長發(fā)育缺陷的表型。

2.4 At4g13180基因過表達(dá)植株的獲得及分子鑒定

通過構(gòu)建At4g13180基因過表達(dá)載體At4g13180-OE(圖5，A)，采用半定量RT-PCR鑒定過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中At4g13180基因相對轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，At4g13180-OE轉(zhuǎn)基因植株中At4g13180基因的表達(dá)量明顯高于野生型(圖5，B)。說明獲得的At4g13180-OE植株是純合的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對擬南芥砷特異性誘導(dǎo)基因At4g13180表達(dá)模式和編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)At4g13180基因是組成型強(qiáng)表達(dá)的基因，其在維管等組織中有較強(qiáng)的表達(dá)。At4g13180編碼蛋白定位于胞質(zhì)和核中?；虻臅r空表達(dá)及編碼蛋白的定位與其功能密切相關(guān)，因此At4g13180基因的強(qiáng)表達(dá)及其在核質(zhì)中的定位暗示其在植物的生長發(fā)育中有比較重要的功能。

已有研究報道證明At4g13180基因的表達(dá)受砷處理的誘導(dǎo)[5]。過量的重金屬會誘導(dǎo)植物體內(nèi)的活性氧水平升高，形成氧脅迫，從而不利于植物的生長和結(jié)實(shí)[10-12]。之前的研究表明，鎘誘導(dǎo)植物細(xì)胞生成活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，激發(fā)生長素氧化酶活性，促進(jìn)生長素降解[13-14]。砷是一種高毒性類金屬元素，過量的砷危害作物的生長發(fā)育，表現(xiàn)在抑制種子萌發(fā)和根系生長，嚴(yán)重時不能開花結(jié)果，甚至死亡[15-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下At4g13180基因的純合突變體和過表達(dá)植株均無明顯的表型。下一步，可以利用已獲得的ProAt4g13180:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥對其在砷等逆境處理?xiàng)l件下，GUS報告基因的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，并利用At4g13180基因突變體和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，比較研究其在砷處理?xiàng)l件下的生長和發(fā)育情況，從而揭示At4g13180基因在植物響應(yīng)砷毒害中的功能。

在不同植物或同一種植物的不同組織器官中，砷的毒性和積累存在很大的差異，而且砷酸(As5+)和磷酸(PO43-)的化學(xué)性質(zhì)十分相似，兩者在吸收上存在拮抗效應(yīng)[18]。因此還可以通過觀察分析At4g13180基因突變體和過表達(dá)植株在缺磷條件下的生長情況，從而檢測At4g13180基因?qū)α椎捻憫?yīng)。也可以從磷酸鹽緩解砷毒害的角度出發(fā)，探究磷酸鹽對于砷脅迫下At4g13180基因突變體表型的影響等，對At4g13180基因的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Expression Pattern Analysis ofArabidopsisthalianaArsenic Induced GeneAt4g13180

WEI Qingqing, BAO Shuguang, MEN Shuzhen*

(College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

InArabidopsisthaliana, the arsenic induced geneAt4g13180 encoding protein is one of the members of the SDR superfamily (Short-Chain Dehydrogenase/Reductase). Its overexpression can enhance the resistance of plants to hydrogen peroxide. Here we studied theAt4g13180 gene expression pattern and the encoded protein subcellular localization by semi-quantitative RT-PCR, with transgenic plants expressing ProAt4g13180:GUS,At4g13180-EGFP andAt4g13180-OE. Our results show that theAt4g13180 gene has a very strong expression in tissues such as root, leaf, sepal, and stamen filamentas.At4g13180-EGFP is located in the nucleus and cytoplasm. Our study lays a basis of further research on the role of the arsenic induced geneAt4g13180 inA.thaliana.

Arabidopsisthaliana； arsenic； SDRs； expression pattern； subcellular localization； overexpression

1000-4025(2016)12-2349-05

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2349

2016-08-20;修改稿收到日期:2016-10-31

國家自然科學(xué)基金(31570247, 91417308, 31460453)；天津市自然科學(xué)基金(14JCYBJC41200)

魏情情(1993-)，女，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：Weiqq93@163.com

*通信作者:門淑珍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物固醇的研究。E-mail：shuzhenmen@nankai.edu.cn

Q786

A