鄭文娟，陳紅梅，葉 金，朱世華，丁沃娜

(寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波 315212)

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水稻短根突變體Osksr5的遺傳分析和基因定位

鄭文娟，陳紅梅，葉 金，朱世華，丁沃娜*

(寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波 315212)

水稻根系對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育及產(chǎn)量等起著至關(guān)重要的作用。該研究從甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)誘變的秈稻Kasalath突變體庫(kù)中篩選到1個(gè)根系變短的突變體，命名為Osksr5(Oryzasativakasalathshortroot5)，該突變體植株具體表現(xiàn)為主根、不定根和側(cè)根都明顯變短，不定根的數(shù)目相對(duì)減少，株高與野生型相比也明顯矮小。遺傳分析結(jié)果表明，該突變性狀由1對(duì)隱性核基因控制。利用圖位克隆技術(shù)將OsKSR5基因定位在第1染色體的STS(sequence tagged site)分子標(biāo)記33027k和33471k，物理距離約為444 kb。對(duì)OsKSR5基因的定位為進(jìn)一步克隆該基因和闡明水稻根系發(fā)育的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

水稻；短根；遺傳分析；基因定位

Genetic Analysis and Gene Mapping of a Short Root Mutant

水稻(OryzasativaL.)是中國(guó)最主要的糧食作物之一。根據(jù)中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2014年全國(guó)稻谷產(chǎn)量為20 642.7萬(wàn)t，占糧食總產(chǎn)量的34.00%；2015年全國(guó)稻谷產(chǎn)量為20 824.5萬(wàn)噸，占糧食總產(chǎn)量的33.51%。但中國(guó)糧食安全受到耕地面積持續(xù)縮減和自然災(zāi)害的危險(xiǎn)。因此，提高水稻的單產(chǎn)，對(duì)于中國(guó)糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展具有特別重要的意義。中國(guó)水稻產(chǎn)量經(jīng)歷過(guò)矮化育種和雜交水稻兩次飛躍后，還未再次實(shí)現(xiàn)大幅度的突破。秈稻與粳稻2個(gè)亞種的基因組序列測(cè)序的完成，為尋找農(nóng)藝性狀相關(guān)基因提供了基礎(chǔ)，也提高了通過(guò)基因改造培育高產(chǎn)水稻的可能性。

根系能從土壤中吸收水分、養(yǎng)分及合成和分泌生理活性物質(zhì)，為水稻提供生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)地上部生長(zhǎng)狀況。水稻根系為須根系，一般由胚根、不定根和側(cè)根組成。根型由長(zhǎng)度、數(shù)量和空間范圍等幾個(gè)參數(shù)決定，研究發(fā)現(xiàn)根長(zhǎng)決定了其他根系性狀的遺傳表現(xiàn)，是所有根系性狀中最重要性狀。水稻單株產(chǎn)量和品質(zhì)等7個(gè)地上部農(nóng)藝性狀與根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)[1-6]。2005年吳偉明等[7]提出了水稻根系育種的理論和概念，以達(dá)到水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和高效等目的。根系育種需要傳統(tǒng)育種和相應(yīng)的根系分子遺傳學(xué)機(jī)制相結(jié)合。至今已報(bào)道了40個(gè)左右水稻根系基因被鑒定并克隆，通過(guò)這些基因的功能鑒定，對(duì)水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理研究有了一定程度的認(rèn)識(shí)，但相對(duì)于水稻地上部位器官的研究程度而言，還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要挖掘更多的根系突變體，克隆更多的功能基因，為水稻的根系育種打下堅(jiān)實(shí)的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

本研究的短根突變體Osksr5是從EMS誘變的秈稻Kasalath突變體庫(kù)中篩選而來(lái)，該突變體苗期的植株表現(xiàn)為株高與野生型相比明顯矮小，主根、不定根和側(cè)根都明顯變短，不定根的數(shù)目也相對(duì)減少。本研究對(duì)Osksr5進(jìn)行了初步的表型鑒定、遺傳分析和基因定位，為進(jìn)一步克隆該基因和研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 水稻材料及培養(yǎng)條件

水稻短根突變體Osksr5是由秈稻Kasalath經(jīng)EMS誘變后篩選得到。培養(yǎng)條件：光照12 h，濕度70%，白天30 ℃，夜晚22 ℃。水稻培養(yǎng)液的配方參照Yoshida 等[8]。

1.2 表型分析

培養(yǎng)7 d后，觀察突變體Osksr5和野生型Kasalath表型。用相機(jī)(Nikon D5000)進(jìn)行整個(gè)植株及根部的拍攝，用Leica MZ95對(duì)水稻根部進(jìn)行觀察。用標(biāo)尺分別測(cè)量株高、主根根長(zhǎng)和不定根長(zhǎng)以及統(tǒng)計(jì)不定根的數(shù)目，樣本統(tǒng)計(jì)數(shù)為20株。

土池栽培實(shí)驗(yàn)于寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院人工土池中進(jìn)行，野生型和突變體以同樣的密度栽培于同一地塊中，成熟期時(shí)分別統(tǒng)計(jì)野生型和突變體的抽穗期，測(cè)定株高、分蘗數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等指標(biāo)。樣本統(tǒng)計(jì)數(shù)為20株。

1.3 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

將突變體Osksr5與野生型Kasalath雜交獲得F1，觀察F1表型并判斷顯隱性。F1自交獲得F2，培養(yǎng)7 d后觀察并統(tǒng)計(jì)F2植株長(zhǎng)短根的分離比情況并進(jìn)行卡方檢測(cè)。突變體Osksr5與粳稻日本晴Nipponbare雜交，F(xiàn)1自交獲得的F2群體里分離出來(lái)的短根植株用于基因定位。

1.4 分子標(biāo)記分析

1.4.1 分子標(biāo)記的選擇和設(shè)計(jì) 用于基因定位的分子標(biāo)記來(lái)自已公布的SSR(simple sequence repeat)序列(http://www.gramene.org/)，每條染色體按照20 cM的遺傳距離較均勻合理地選擇約10個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行粗定位。通過(guò)比較已公布的‘日本晴’和9311的核酸序列，對(duì)差異部位設(shè)計(jì)STS標(biāo)記對(duì)OsKSR5進(jìn)行進(jìn)一步定位。SSR和STS標(biāo)記引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 采用簡(jiǎn)易TPS法[9]，從水稻葉片中提取親本、F1和F2群體分離的突變株DNA。10 L PCR擴(kuò)增體系：1 L 模板DNA、1 L 10×PCR buffer、1.2 L 25 mmol/L MgCl2、0.3 L 2.5 mmol/L dNTP、0.3 L 10 mol/L上下游引物、0.1 L 5U/LTaqDNA聚合酶、5.8 L超純水。PCR條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠190 V電泳2.5 h，銀染后顯色分析并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

選取培養(yǎng)了7 d的野生型Kasalath和純合突變體Osksr5進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)該突變體Osksr5地上部分的株高比野生型植株矮小，株高是野生型的58.87%；根部性狀比較發(fā)現(xiàn)，突變體主根和不定根根長(zhǎng)明顯變短，長(zhǎng)度分別只有野生型的44.44%和53.44%(表1)。體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該突變體的側(cè)根數(shù)目比野生型少，側(cè)根長(zhǎng)度與野生型比較也變短(圖1)。

成熟期的突變體相比野生型植株整體矮小，根系也欠發(fā)達(dá)(圖2)，株高是野生型的59.90%(圖2)，抽穗期比野生型晚1星期左右，分蘗數(shù)僅為野生型的25.17%，千粒重和結(jié)實(shí)率分別是野生型的92.58% 和88.82%(表2)。

a. 野生型WT(左)和突變體Osksr5 (右)的全株表型(標(biāo)尺=2 cm)；b. 野生型(左)和突變體(右)的根部表型(標(biāo)尺=2 cm)；c和d：野生型和突變體主根的體視鏡照(標(biāo)尺=2 mm)圖1 水稻野生型Kasalath和突變體Osksr5培養(yǎng)7 d的表型a. Seedlings of the wild type (left) and Osksr5 mutant (right), bar=2 cm; b. The root of WT (left) and Osksr5 mutant (right), bars=2 cm; c，d. The primary root of the wild type (c) and Osksr5 mutant (d) under stereoscope, bar=2 mmFig.1 Phenotypic characterization of 7-day old seedlings of the wild type and Osksr5 mutant

性狀Trait野生型WT突變體Osksr5主根長(zhǎng)Primaryrootlength/cm12．61±0．045．60±0．61不定根長(zhǎng)Adventitiousrootlengtha/cm3．63±0．461．94±0．31不定根數(shù)Adventitiousrootnumber4．6±0．593．1±0．22株高Height/cm14．12±0．558．33±0．86

注：a最長(zhǎng)3根不定根長(zhǎng)度的平均值

Note：aAverage of three longest adventitious roots on each plant

表2 野生型和突變體Osksr5的農(nóng)藝性狀參數(shù)

圖2 野生型Kasalath(左)和突變體Osksr5(右)成熟期全株表型(標(biāo)尺=10 cm)Fig.2 Mature phenotypes of the wild type(left) and Osksr5 mutant (right)

2.2 遺傳分析

2.3 OsKSR5基因定位

選用純合突變體Osksr5和日本晴Nipponbare作為親本雜交，獲得F2群體中表現(xiàn)為短根的群體作為定位群體。在F2分離群體中隨機(jī)選取30株短根表型，將這30株進(jìn)行單株提取DNA，然后取等量DNA混合均勻構(gòu)建一個(gè)突變池。將突變池作為模板，Kasalath、Nipponbare和F1作為對(duì)照，從均勻分布在水稻12條染色體的SSR標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)OsKSR5與第1號(hào)染色體上的RM3240引物連鎖(圖3)。根據(jù)Nipponbare和9311的基因組序列存在的差異性，在RM3240附近的位置處，設(shè)計(jì)發(fā)展出新的8對(duì)STS標(biāo)記(表3)，在799株F2代分離的短根植株182株為模板，PCR擴(kuò)增RM3240和新設(shè)計(jì)的STS引物，最終把OsKSR5基因定位在33027k和33471k之間，物理距離大約為444 kb(圖4和圖5)。

表3 具有多態(tài)性的SSR及STS標(biāo)記序列

1. Kasalath；2.Nipponbare；3.F1(Osksr5×Nipponbare)；4～21. F2短根單株圖3 與OsKSR5基因連鎖的SSR標(biāo)記RM3240的擴(kuò)增結(jié)果1. Kasalath；2.Nipponbare；3.F1(Osksr5×Nipponbare)；4～21. Short root individuals in F2 populationFig.3 Electrophoresis of the SSR marker RM3240 linked with the OsKSR5 gene

1. Kasalath；2.Nipponbare；3. F1(Osksr5×Nipponbare)；4-26. F2短根單株；*. 交換單株圖4 標(biāo)記 33027k 和 33471k 在日本晴/Osksr5 F2 群體中分離的部分?jǐn)U增結(jié)果1. Kasalath；2.Nipponbare; 3. F1(Osksr5×Nipponbare); 4-26. Short root individuals in F2 population; *. Exchange plantFig.4 Marker 33027k and 33471k in the partial F2 population of Nipponbare/Osksr5

圖5 OsKSR5基因在水稻第1號(hào)染色體上的分子定位Fig.5 The gene mapping of OsKSR5 on rice chromosome 1

3 討 論

根系是水稻的三大器官之一，是水稻與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流的紐帶，將吸收的水分、養(yǎng)分等供給地上部分生長(zhǎng)和發(fā)育，因此良好的根系是水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)。

目前已報(bào)道的被鑒定并克隆水稻根系相關(guān)基因，主要涉及主根，不定根，側(cè)根以及根毛的起始和發(fā)育，而這些基因大多是與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸等幾大主要激素的信號(hào)傳遞通道相關(guān)，另外，還與細(xì)胞壁多糖和纖維素合成、蔗糖代謝，金屬離子等相關(guān)[10-11]。各個(gè)相關(guān)基因所控制的表型包括根的長(zhǎng)度、數(shù)量和角度等。本研究鑒定的突變體Osksr5植株表現(xiàn)為主根、側(cè)根和不定根都明顯變短，不定根的數(shù)目相對(duì)減少，與已報(bào)道的水稻根系發(fā)育相關(guān)基因所控制表型類似的有：OsWOX11(第7號(hào)染色體)[12]、GLR3.1(第4號(hào)染色體)[13]、OsGNA1(第9號(hào)染色體)[14]、Oscyt-inv1(第2號(hào)染色體)[15]、OsGLU3(第4號(hào)染色體)[16]、OsDGL1(第7號(hào)染色體)[17]和OsSPR1(第1號(hào)染色體)[18]等。

OsWOX11基因可能是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的整合器，并通過(guò)細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因RR2調(diào)節(jié)不定根發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖，該基因發(fā)生突變后表現(xiàn)主根變短，不定根稀少甚至缺失[12]。為進(jìn)一步解析OsWOX11在調(diào)控水稻不定根發(fā)育中的作用機(jī)理，2015年該研究組分離并鑒定了1個(gè)與WOX11相互作用的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子ERF3。研究表明ERF3和WOX11調(diào)控著一個(gè)共同基因RR2。在不定根起始發(fā)育時(shí)期，ERF3通過(guò)促進(jìn)RR2的表達(dá)控制不定根的起始，而在不定根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，ERF3與WOX11相互作用，促進(jìn)WOX11對(duì)RR2的抑制來(lái)促進(jìn)不定根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。揭示了水稻不定根從起始到伸長(zhǎng)過(guò)程中存在著一套對(duì)細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑的精細(xì)調(diào)控模式[19]。GLR3.1編碼一個(gè)類谷氨酸受體蛋白，對(duì)水稻幼苗早期根尖分生組織維持細(xì)胞分裂和單個(gè)細(xì)胞存活是不可或缺的。該基因突變體的主根、不定根和側(cè)根都變短，組織學(xué)和DNA合成分析表明突變體根的分生組織活性喪失，伴隨著細(xì)胞程序性死亡提高[13]。OsGNA1基因編碼葡糖胺-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，是維持水稻根細(xì)胞形狀所必需的。gna1突變體表現(xiàn)出在根伸長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)溫度敏感的缺陷：主根、不定根和根毛都變短，在32 ℃為野生型的70%；而23 ℃時(shí)根長(zhǎng)變得很短，根中微管破裂，根伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞皺縮[14]。Oscyt-inv1基因與擬南芥AtCyt-inv1同源，編碼一個(gè)堿性/中性轉(zhuǎn)化酶，Oscyt-inv1突變體中蔗糖含量增加而己糖含量降低，突變體植株表現(xiàn)為主根、不定根和側(cè)根變短成短根表型。切片分析發(fā)現(xiàn)突變體沿縱軸方向細(xì)胞的長(zhǎng)度減小，根的伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞皺縮。外施葡萄糖能夠恢復(fù)Oscyt-inv1突變體的根生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明OsCyt-inv1對(duì)水稻根系細(xì)胞發(fā)育和生殖發(fā)育有著重要的作用[15]。OsGLU3基因編碼水解纖維素β-1,4-糖苷鍵的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶，參與根細(xì)胞壁纖維素合成，通過(guò)影響根細(xì)胞的分裂及細(xì)胞的伸長(zhǎng)來(lái)調(diào)控根系的發(fā)育，突變體Osglu3的主根和不定根長(zhǎng)度變短[16]。OsDGL1編碼多萜長(zhǎng)醇二磷酸寡糖蛋白環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶亞基。OsDGL1是形成寡糖轉(zhuǎn)移酶(OST)復(fù)合體所必需的，參與水稻N-糖基化和根的發(fā)育。該突變體中，根中N糖基化過(guò)程受損，根中細(xì)胞壁的多糖基質(zhì)發(fā)生變化，根細(xì)胞長(zhǎng)度變短，根分生組織變小，根細(xì)胞發(fā)生死亡[17]。OsSPR1編碼一種參與根的伸長(zhǎng)和金屬離子的動(dòng)態(tài)平衡的新的線粒體蛋白，具有Armadillo-like重復(fù)域。與野生型相比，突變體幼苗中對(duì)鐵、錳和鋅的吸收受到抑制，植株表現(xiàn)為主根、不定根和側(cè)根的伸長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，呈短根系表型[18]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)圖位克隆技術(shù)最終將OsKSR5定位在第1號(hào)染色體的分子標(biāo)記33027k和33471k之間，物理距離大約為444 kb，目前在第1號(hào)染色體上已克隆的與根系發(fā)育相關(guān)的基因只有OsSPR1[18]，OsRAA1[20]和OsSRH3[21]。OsSPR1雖然其突變體植株表型與本研究相似，但和OsKSR5不在同一區(qū)間。OsRAA1過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系中，主根生長(zhǎng)被抑制，不定根數(shù)目增加，主根螺旋卷曲，幼苗中根對(duì)重力的響應(yīng)延遲，其物理位置位于8 586 049 bp和8 586 941 bp之間[20]；ossrh3突變體根毛伸長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，主根和不定根略變短，側(cè)根變長(zhǎng)，該基因的位置位于為38 978 883 bp 和39 016 640 bp[21]，OsRAA1和OsSRH3基因所調(diào)控的表型和區(qū)間都和OsKSR5不一樣，同時(shí)生物信息學(xué)分析表明，在定位的444 kb區(qū)間內(nèi)沒(méi)有已知的與根長(zhǎng)相關(guān)的基因，因此OsKSR5是一個(gè)新的根系發(fā)育相關(guān)基因，對(duì)OsKSR5基因的定位為進(jìn)一步該基因克隆，功能研究和闡明水稻根系發(fā)育的分子遺傳機(jī)理奠定一個(gè)基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Osksr5 in Rice (OryzasativaL.)

ZHENG Wenjuan, CHEN Hongmei, YE Jin, ZHU Shihua, DING Wona*

(College of Science and Technology Ningbo University，Ningbo，Zhejiang 315212，China)

The root system plays vital roles in plant growth, development and yield. In this study, a rice mutant with significantly short roots was isolated from an EMS (ethyl methane sulfonate) generated rice mutant library in theKasalathbackground, designated asOsksr5(Oryzasativakasalathshortroot5).Osksr5 showed a dwarf phenotype, the elongation of primary roots, adventitious roots and lateral roots in the mutant was severely impaired, and the number of adventitious roots was reduced. Genetic analysis indicated that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene. Map-based cloning analysis locatedOsKSR5 to a 444 kb region between STS(sequence tagged site)markers 33027k and 33471k on chromosome 1. This result will be helpful for the cloning ofOsKSR5 and further characterization of molecular genetic mechanisms underlying root architecture in rice.

rice; short root; genetic analysis; gene mapping

1000-4025(2016)12-2405-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2405

2016-08-23;修改稿收到日期:2016-10-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371595, 31300246)；浙江省自然科學(xué)基金(LQ16C020001)

鄭文娟(1982-)，女，碩士，主要從事水稻分子生物學(xué)研究。E-mail：zhengwenjuan@nbu.edu.cn

*通信作者:丁沃娜，博士，副教授，主要從事水稻分子生物學(xué)研究。E-mail：dwn@zju.edu.cn

Q343.1+7

A