黃瓊林，何 瑞，詹若挺

(1.廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524023; 2.廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心,廣東 廣州 510006;3.嶺南中藥資源教育部重點實驗室,廣東 廣州 510006)

青天葵PAL基因序列特征和表達分析

黃瓊林1，何 瑞2,3*，詹若挺2,3

(1.廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524023; 2.廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心,廣東 廣州 510006;3.嶺南中藥資源教育部重點實驗室,廣東 廣州 510006)

在前期完成的青天葵(Nerviliafordii)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用生物信息學方法對3個青天葵PAL基因家族成員(NfPAL1、NfPAL2 和NfPAL3)的cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行特征分析，并計算這些基因在青天葵葉片和球莖中的表達量。結(jié)果表明，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的3個青天葵PAL基因家族成員cDNA序列長度為1 743～2 091 bp，編碼581～697個氨基酸。這些PAL基因編碼包含苯丙氨酸解氨酶多功能域，并且不含跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽和轉(zhuǎn)運肽的親水性穩(wěn)定蛋白。3個青天葵PAL基因在青天葵中的表達呈組織特異性，其中，NfPAL1和NfPAL3在球莖中的表達量較高，而NfPAL2在葉片中具有較高的表達水平。

苯丙氨酸解氨酶； 青天葵； 序列特征； 表達； 生物信息學

黃酮類化合物是植物苯丙烷類代謝途徑中的次生代謝產(chǎn)物，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)催化該途徑的第一步反應(yīng)，將L-苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸，再生成香豆酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，隨后中間產(chǎn)物在不同酶的催化作用下經(jīng)不同分支衍生成黃酮、木質(zhì)素和酚類等次生代謝產(chǎn)物，而且PAL引導途徑中碳素的流向。因此，PAL被認為是苯丙烷類代謝途徑中的第1個限速關(guān)鍵酶[1]。研究表明，提高PAL活性可以促進黃酮類成分的積累[2-3]。目前，PAL基因已從甜蕎[4]、山藥[5]、龍眼[6]等多種植物中克隆出來。

青天葵為“十大廣藥”之一，來源于蘭科芋蘭屬多年生草本植物毛唇芋蘭[Nerviliafordii(Hance) Schltr.]的全草或葉片，具有清肺止咳、清熱解毒、散瘀消腫的功效，對治療肺部疾病和小兒呼吸道疾病有顯著療效[7]。由于人類的過度開采以及自身萌發(fā)條件的苛刻，青天葵野生資源已經(jīng)基本滅絕。目前，不少研究者致力于通過人工栽培[8]和組織培養(yǎng)[9]來提高青天葵的產(chǎn)量，但這2種途徑分別面臨著種苗稀缺和“煉苗下田”等瓶頸，根本不能生產(chǎn)足夠的青天葵來滿足臨床和市場需求。

植物化學和藥理研究表明，黃酮類化合物是青天葵發(fā)揮藥用功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。例如，青天葵山奈酚-7-甲醚能夠明顯地抑制白血病細胞株L1210和P388D1、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、黑色素瘤細胞株B16、神經(jīng)性腫瘤細胞株NG108-15和人肝癌細胞株Hele7404的生長，被認為是青天葵抗腫瘤的活性成分之一[10]。青天葵甲基鼠李素-3-O-β-吡喃葡萄糖基-4′-O-β-6?-乙?；咸烟擒漳茱@著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中NO、PEG2、IL-6、TNF-α的含量，抑制iNOS和COX-2蛋白的表達，表明該成分具有抗炎作用[11]。在化學成分比較明確的情況下，通過植物基因工程調(diào)控PAL等黃酮類生物合成功能酶基因的表達，從而提高青天葵的藥效成分含量及其藥用質(zhì)量，是緩解青天葵資源匱乏的可考慮途徑之一。

本研究在青天葵RNA-seq高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用生物信息學分析青天葵PAL基因家族成員的序列特征及其在青天葵不同組織中的表達差異，為后續(xù)青天葵PAL基因的功能研究以及利用其調(diào)控青天葵黃酮類成分的生物合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 青天葵等植物PAL基因序列的獲取

前期研究中，廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心課題組以生長旺盛期的青天葵葉片和球莖為材料，采用Illumina RNA-seq高通量測序平臺進行全轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得142 220個基因。本研究以“phenylalanine ammonia-lyase”為主題詞檢索轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中編碼青天葵苯丙氨酸解氨酶的unigene及其cDNA序列，并從National Center of Biotechnology Information(NCBI)的GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)等14種植物的PAL基因cDNA序列。

1.2 青天葵PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ClustalX 1.86軟件對所有PAL基因序列進行多重比對，并將比對結(jié)果保存為.aln格式。把.aln多重比對文件導入MEGA 4.0軟件中，構(gòu)建基于Kimura 2-Parameter雙參數(shù)模型和Neighbor-Joining鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率)。

1.3 青天葵PAL蛋白的序列特征分析

通過OMIGA軟件將PAL基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列，以備后續(xù)分析。利用ExPASy Protparam和Protscale在線軟件計算和分析PAL蛋白的理化參數(shù)和親/疏水性等基本性質(zhì)；采用NCBI的Conserved Domains Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)完成保守功能域預測；運用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ ser-vices/ TMHMM-2.0/)預測跨膜結(jié)構(gòu)域；使用TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/) 分析信號肽、轉(zhuǎn)運肽信息；應(yīng)用SOPMA在線工具(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)分析編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 青天葵PAL基因的表達量分析

在對轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)的處理中，RPKM(Reads Per Kb per Million reads)法對測序長度和基因長度均作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達水平估計值具有可比性[12]。本研究采用RPKM法計算青天葵PAL基因家族成員在葉片和球莖中的表達量，計算公式為：RPKM(PAL)=(106C)/(NL/103)。設(shè)RPKM(PAL)為編碼青天葵PAL基因的unigene的表達量，則C為唯一比對到編碼青天葵PAL基因的unigene的讀數(shù)，N為唯一比對到所有unigene的總讀數(shù)，L為編碼青天葵PAL基因的unigene的堿基數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青天葵PAL基因cDNA及氨基酸序列特征分析

通過在青天葵轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中檢索和比對，共獲得3個編碼青天葵PAL的基因及其序列，分別將它們命名為NfPAL1、NfPAL2和NfPAL3(表1)。這些PAL基因cDNA序列長度在1 743 bp到2 091 bp之間，編碼581～697個氨基酸，等電點均稍大于6。青天葵3個PAL基因編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。這些PAL蛋白的多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，沒有包含明顯的疏水區(qū)域。

表1 青天葵PAL基因cDNA及氨基酸序列特征

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將3個青天葵PAL基因以及從GenBank下載的鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)等14種植物PAL基因序列分別導入ClustalX軟件進行多重比對，并采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，17條PAL基因序列主要聚成兩大分支，青天葵3個PAL基因之間的序列相似度在73%以上，并與鐵皮石斛等其他單子葉植物來源的PAL基因聚集在一起；而其他雙子葉植物來源的PAL基因則聚成另外一個分支。其中，青天葵PAL基因與鐵皮石斛的同源性最高，可達78%。青天葵PAL基因與其他植物來源的PAL基因的保守度較高，推測它們的功能具有高度的一致性。

Cucumis sativus黃瓜； Dendrobium candidum鐵皮石斛； Fagopyrum esculentum蕎麥； Gossypium hirsutum陸地棉； Jasminum sambac茉莉；Epimedium sagittatum箭葉淫羊藿； Musa acuminata小果野芭蕉； Pleioblastus maculosoides麗水苦竹； Phyllostachys prominens高節(jié)竹；Prunella vulgaris夏枯草； Prunus persica碧桃； Prunus salicina李； Scutellaria viscidula粘毛黃芩； Zea mays玉米圖1 不同植物PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 保守功能域分析

通過預測編碼蛋白的保守功能域，可以明確青天葵PAL基因的功能和分類。如圖2所示，NfPAL3編碼的蛋白質(zhì)有多個活性位點(active sites)和四聚物表面(tetramer interface)區(qū)域，包含1個PAL-HAL保守功能域，歸屬于裂解酶Ⅰ超級家族，具有苯丙氨酸解氨酶多功能位點，說明NfPAL3蛋白具有苯丙氨酸解氨酶的功能，NfPAL3為青天葵苯丙氨酸解氨酶的編碼基因。NfPAL1和NfPAL2蛋白的保守功能域分析也得到相同的結(jié)果，它們同樣歸屬于裂解酶Ⅰ超級家族，并且具有苯丙氨酸解氨酶多功能位點。以上結(jié)果表明，NfPAL1、NfPAL2和NfPAL3均為苯丙氨酸解氨酶家族成員。

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽和轉(zhuǎn)運肽分析

跨膜結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)與細胞膜的膜脂結(jié)構(gòu)結(jié)合的區(qū)域，可起到在細胞膜上“錨定”的功能[13]?？缒そY(jié)構(gòu)域的預測可以掌握青天葵PAL蛋白的亞細胞定位等信息。TMHMM軟件分析結(jié)果(圖3)顯示，NfPAL3蛋白的全部多肽鏈均位于細胞膜外，不包含任何跨膜結(jié)構(gòu)域。對NfPAL1和NfPAL2蛋白也進行了跨膜結(jié)構(gòu)域分析，它們同樣不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。上述結(jié)果表明青天葵PAL蛋白在細胞質(zhì)基質(zhì)中執(zhí)行功能。

圖2 青天葵PAL蛋白保守功能域預測

圖3 青天葵PAL蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預測

信號肽、轉(zhuǎn)運肽位于蛋白質(zhì)的N端，前者指導分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，后者指引在細胞質(zhì)基質(zhì)游離核糖體上合成的前體蛋白轉(zhuǎn)運至葉綠體基質(zhì)中發(fā)揮作用[13]。因此，信號肽和轉(zhuǎn)運肽分析同樣對蛋白質(zhì)的亞細胞定位具有重要意義。通過TargetP 1.1軟件分析3個青天葵PAL基因編碼的蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)它們均不含有信號肽和轉(zhuǎn)運肽，表明它們在細胞質(zhì)中合成以及發(fā)揮催化功能，也不屬于分泌性蛋白質(zhì)。

2.5 二級結(jié)構(gòu)分析

如圖4所示，NfPAL3蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、隨意卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈等元件組成，各元件所占比例分別為51.08%、27.55%、8.46%和12.91%。從蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)來看，α-螺旋和隨意卷曲是NPAL3最大量的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則相對分散于整條多肽鏈中。NfPAL1和NfPAL2蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與NfPAL3蛋白類似，均以α-螺旋和隨意卷曲為主要組成元件。因此，NfPAL蛋白為混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

圖4 青天葵PAL蛋白二級結(jié)構(gòu)模擬

2.6 表達量分析

基于RPKM法計算的青天葵PAL基因表達量如圖5所示，NfPAL1和NfPAL3在球莖中的表達量遠遠高于在葉片中的表達量，而NfPAL2表達量較低，并且在葉片中的表達水平比在球莖中的表達水平略高，表明青天葵PAL的表達存在組織差異性。

圖5 青天葵PAL基因在葉片和球莖中的表達差異

3 結(jié)論與討論

PAL是連接初級代謝和次生代謝，催化苯丙烷類代謝途徑第1步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶，與類黃酮、木質(zhì)素和酚類等苯丙烷類代謝途徑終產(chǎn)物的積累有著密切的關(guān)系。關(guān)巍等[2]發(fā)現(xiàn)，在彩色馬鈴薯整個發(fā)育期間，在PAL活性較高的器官中花青苷含量也較高，兩者呈現(xiàn)線性正相關(guān)。郭肖等[3]通過檢測不同產(chǎn)地水芹中黃酮含量和PAL活性的變化趨勢，也得到水芹黃酮合成與PAL活性呈密切正相關(guān)的結(jié)論。由此可見，提高PAL基因的表達量，增加PAL活性，可以促進植物黃酮類成分的積累。

本研究從青天葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取3個青天葵PAL編碼基因，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些PAL基因與其他植物來源PAL基因同源性較高，具有苯丙氨酸解氨酶的功能，其他生物信息學分析也說明它們與前人所報道的PAL蛋白特性相符[4-6]。植物PAL基因家族通常包括2～5個成員，不同成員在植物黃酮類成分的生物合成中發(fā)揮的功能也有所不同，本研究獲得的青天葵PAL基因家族3個成員的功能仍需后續(xù)的試驗探討。

植物PAL基因家族各成員的表達通常具有物種、組織和時間的特異性。柳樹PAL1、PAL2和PAL3在根中都能大量表達，并遠高于在嫩葉、莖、成熟葉、木質(zhì)部、韌皮部等器官中的表達量；但PAL4在以上部位的表達量均很低[14]。甘蔗PAL基因在根中表達量是葉中表達量的66倍[15]。蝴蝶蘭PAL基因在組織培養(yǎng)過程中第1、8、12天表達量急劇增加，第12天表達量達到最大值，隨后總體表達量呈現(xiàn)降低趨勢[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，青天葵PAL基因家族3個成員的表達呈現(xiàn)組織特異性，NfPAL1和NfPAL3在地下部位球莖中的表達量遠高于在地上部位葉片中的表達量，而NfPAL2在2個部位的表達量均較低，并且在葉片中的表達量稍高于在球莖中的表達量，這可能與它們在青天葵中執(zhí)行不同的功能有關(guān)。

本研究從青天葵RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘到植物重要的次生代謝途徑之一——苯丙烷類代謝途徑第1步關(guān)鍵酶PAL的基因家族成員，通過系統(tǒng)發(fā)育、保守功能域和蛋白質(zhì)特征位點分析等明確了它們的序列特征和分子功能，并探討了這些基因在青天葵不同組織中的表達差異。本研究結(jié)論可為青天葵PAL基因家族的克隆和功能鑒定，進而通過植物基因工程提高青天葵黃酮類藥效成分含量奠定良好的基礎(chǔ)。

[1] Yu O,Jung W,Shi J,etal.Production of the isoflavones genistein and daidzein in non-legume dicot and monocot tissues[J].Plant Physiology,2000,124(2):781-794.

[2] 關(guān)巍,石瑛,王鳳義.彩色馬鈴薯PAL活性與花色苷積累的相關(guān)性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)科學,2014,39(1):74-79.

[3] 郭肖,孔德章,曹玉洪,等.不同產(chǎn)地水芹黃酮含量及PAL酶活性的差異研究[J].長江蔬菜,2014(2):32-34.

[4] 李成磊,蒙華,張曉偉,等.甜蕎苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析[J].食品科學,2011,32(7):255-257.

[5] 周生茂,王玲平,向珣,等.山藥PAL基因全長cDNA序列的克隆、表達與分析[J].核農(nóng)學報,2008,22(6):781-788.

[6] 鄭潔紅,邱棟梁.龍眼葉片PAL基因的克隆與表達研究[J].熱帶作物學報,2012,33(1):79-83.

[7] 陳蔚文.嶺南本草(二)[M].廣州:廣東科技出版社,2010:326-351.

[8] 杜勤,徐鴻華,王振華.人工種植青天葵生長狀況的初步調(diào)查[J].中藥材,2005,28(10):869-870.

[9] 張曉麗,梁凌玲,詹若挺,等.嶺南道地藥材青天葵的組織培養(yǎng)與植株再生[J].北方園藝,2012(19):140-142.

[10] 甄漢深,周燕園,袁葉飛,等.青天葵中黃酮類化合物的體外抗腫瘤實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(3):36-38.

[11] 焦揚,邱莉,謝集照,等.青天葵黃酮F的抗炎作用[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2014,45(2):143-146.

[12] 王曦,汪小我,王立坤,等.新一代高通量RNA測序數(shù)據(jù)的處理與分析[J].生物化學與生物物理進展,2010,37(8):834-836.

[13] 黃瓊林,蔡春.不同植物黃酮醇合成酶FLS的生物信息學分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2014,41(13):140-143,151.

[14] de Jong F,Hanley S J,Beale M H,etal.Characterisation of the willow phenylalanine ammonia-lyase(PAL) gene family reveals expression differences compared with poplar[J].Phytochemistry,2015,117:90-97.

[15] 宋修鵬,黃杏,莫鳳連,等.甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表達分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(14):2856-2868.

[16] 趙和文,崔金騰,周田田.基于實時熒光定量PCR技術(shù)的蝴蝶蘭PPO和PAL基因表達分析[J].中國農(nóng)學通報,2015,31(7):125-130.

Sequence and Expression Analysis ofPALGenes fromNerviliafordii

HUANG Qionglin1,HE Rui2,3*,ZHAN Ruoting2,3

(1.Guangdong Medical University,Zhanjiang 524023,China; 2.Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;
3.Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan,Ministry of Education,Guangzhou 510006,China)

In this study,the sequence features and expression levels in corm and leaf of threePALgenes annotated fromNerviliafordiitranscriptome data were analyzed using bioinformatics methods.The results revealed that the cDNA sequence length of threeNfPALgenes ranged from 1 743 bp to 2 091 bp,and encoded 581 to 697 amino acids.The NfPAL proteins were stable and hydrophilic,which also contained a phenylalanine ammonialyase functional domain,and no transmembrane region,signal peptide and transport peptide.Additionally,the expression of threeNfPALgenes was tissue-specific,NfPAL1 andNfPAL3 showed higher expression levels in corm,whileNfPAL2 expressed higher in leaf.

phenylalanine ammonia-lyase;Nerviliafordii(Hance) Schltr.; sequence features; expression; bioinformatics

2015-08-20

國家自然科學基金項目(30701090)；廣東省自然科學基金博士啟動項目(2015A030310519)

黃瓊林(1986-)，男，廣東湛江人，講師，主要從事醫(yī)學生物化學研究。E-mail:perfecthql@163.com

*通訊作者：何 瑞(1972-)，女，廣東廣州人，研究員，博士，主要從事中藥資源可持續(xù)利用研究。E-mail:ruihe@gzucm.edu.cn

S567.23

A

1004-3268(2016)02-0104-05