吳 雙，馬麗麗，朱善元，陸 輝*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

鴨瘟病毒UL6基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

吳 雙1，馬麗麗2，朱善元1，陸 輝1*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

為制備鼠抗鴨瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗體，采用PCR方法擴(kuò)增出UL6基因，連接原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-UL6，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，于37 ℃經(jīng)1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，將目的蛋白免疫Balb/c 小鼠，利用ELISA方法檢測(cè)特異性抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能正確表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白能與DPV陽(yáng)性血清反應(yīng)，制備的多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶16 000。表明，制備的多克隆抗體具有良好的免疫原性，可以用于UL6基因的表達(dá)檢測(cè)。

鴨瘟病毒；UL6基因； 原核表達(dá)； 多克隆抗體

鴨瘟(duck plague，DP)是由鴨瘟病毒(duck plague virus，DPV)引起的養(yǎng)鴨業(yè)一種傳染性極強(qiáng)、敗血性、高度致死性傳染病。任何品種、年齡和性別的鴨均可被感染，并且部分病愈康復(fù)鴨仍可帶毒并周期性向外排毒，所以導(dǎo)致該病在鴨群中廣泛傳播，從而嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。此外，DPV還可感染鵝、天鵝和其他多種雁行目成員，成為世界范圍內(nèi)水禽養(yǎng)殖業(yè)危害較為嚴(yán)重的疫病之一[1]。

DPV是α-皰疹病毒亞科成員之一，其基因組為雙股DNA，大小約為150 kb?；蚪M分為特定長(zhǎng)區(qū)(UL)和特定短區(qū)(US)，UL和US連接處有內(nèi)部重復(fù)序列(IR)，基因組兩端含有末端重復(fù)序列(TR)[2]。DPV中UL6基因高度保守，其編碼的UL6蛋白在DNA的切割和包裝、形成核酸進(jìn)出衣殼的通道、衣殼的成熟、對(duì)入侵病毒產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用[3]。目前，關(guān)于DPV UL6蛋白的研究較少。為此，本研究對(duì)UL6基因進(jìn)行原核表達(dá)，并制備了多克隆抗體，以期為DPV致病機(jī)制的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體、菌種和試驗(yàn)動(dòng)物 DPV標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Balb /c 小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；pGEM T-easy 載體、pET-32a(+)載體購(gòu)自Promega 公司；大腸桿菌Trans5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒、X-Gal、IPTG、T4 DNA ligase購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker和預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas 公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、2×LAmp Master Mix、SDS-PAGE電泳試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、HRP-羊抗鼠IgG、ELISA顯色試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中登錄的鴨瘟病毒(DPV)UL6基因組序列運(yùn)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物(表1)，并在引物上、下游分別添加了BamH Ι、SalΙ酶切位點(diǎn)，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取 參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DPV標(biāo)準(zhǔn)毒株的DNA，取2 μL樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度及濃度，少量分裝，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的片段擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-UL6的構(gòu)建 以提取的DPV DNA為模板擴(kuò)增UL6基因。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并回收純化目的片段，最后與pGEM T-easy 載體連接，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含100 μg/mL的氨芐青霉素LB平板上，挑取37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)單菌落，將菌落PCR鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，然后將酶切鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ、SalⅠ酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的pET-32a(+)連接，轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，最后將酶切鑒定正確的菌液送至上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-UL6。

1.2.3 UL6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-UL6接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，將過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接種，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解的菌體進(jìn)行12%分離膠的SDS-PAGE電泳以檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。并對(duì)IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 UL6重組蛋白Western blot檢測(cè) 將收集的誘導(dǎo)后重組菌和非重組菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維薄膜(NC膜)上，以DPV陽(yáng)性血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.5 UL6重組蛋白多克隆抗體的制備 將上述SDS-PAGE電泳產(chǎn)物用0.5 mol /L KCl 染色，切下乳白色目的條帶回收，使用凝膠成像系統(tǒng)的定量軟件對(duì)其進(jìn)行定量分析，放入有少量PBS的研缽中研磨勻漿化，以每只小鼠100 μg的劑量頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫Balb/c小鼠，每隔10 d免疫1次，4免后3 d加強(qiáng)免疫1次，3 d后眼眶靜脈采血，分離血清，ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-UL6的構(gòu)建與鑒定

擴(kuò)增UL6基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的片段，約310 bp(圖1)。產(chǎn)物回收后與pGEM T-easy 載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒與經(jīng)同樣酶切的pET-32a(+)連接，獲得重組質(zhì)粒pET-UL6，酶切鑒定出現(xiàn)5 900 bp和310 bp 2個(gè)條帶(圖2)，測(cè)序結(jié)果表明，UL6基因克隆正確且無(wú)突變。

2.2 UL6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

同時(shí)將pET-32a(+)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的受體菌作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，IPTG濃度為1.0 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)4 h時(shí)，UL6重組蛋白以較高水平表達(dá)，并存在于上清中。UL6重組蛋白的分子質(zhì)量約為22 ku(圖3)，與理論值相符。

M.DNA Marker; 1.UL6基因

M.DNA Marker; 1.pET-UL6雙酶切

圖2 pET-UL6的BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定結(jié)果

M.預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 1.未誘導(dǎo)的載體菌上清; 2.未誘導(dǎo)的載體菌沉淀; 3.經(jīng)誘導(dǎo)的載體菌上清; 4.經(jīng)誘導(dǎo)的載體菌沉淀; 5.未誘導(dǎo)的重組菌上清; 6.未誘導(dǎo)的重組菌沉淀; 7.經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌上清; 8.經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌沉淀圖3 重組蛋白UL6的SDS-PAGE分析

2.3 UL6重組蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果

從圖4可以看出，重組蛋白可與DPV陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，在約22 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，且大小與目的蛋白相一致，而對(duì)照菌則無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，證明表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 UL6重組蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

將免疫小鼠后采集的血液離心分離血清作為一抗，以誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為抗原，1∶5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG為二抗，ELISA方法測(cè)得其抗體效價(jià)為1∶16 000。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1.BL21( pET-UL6)蛋白；2.pET-32a(+)全菌蛋白對(duì)照?qǐng)D4 目的蛋白Western bolt分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

目前，鴨瘟已成為危害我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展最嚴(yán)重的疫病之一[4-7]。因此，研究該病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白及其體外表達(dá)，對(duì)深入研究病毒感染的分子作用機(jī)制，有效防控病毒性傳染病的發(fā)生與流行，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展具有非常重要的意義。

針對(duì)外源基因的表達(dá)，常用的表達(dá)系統(tǒng)有原核細(xì)胞系統(tǒng)和真核細(xì)胞系統(tǒng)[8]。本試驗(yàn)所選擇的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有宿主菌生長(zhǎng)迅速、周期短、成本低，與宿主菌相適應(yīng)的表達(dá)載體具有l(wèi)acUV5啟動(dòng)子，可獲得高效表達(dá)，并且目的蛋白大多以融合蛋白形式存在等諸多優(yōu)點(diǎn)[9-10]，成為外源基因表達(dá)的首選系統(tǒng)。但該系統(tǒng)也存在一定的不足：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的凝聚速率高于重組蛋白正確折疊速率時(shí)，重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物不易形成正確的空間構(gòu)象，常以包涵體的形式存在，或者重組蛋白在表達(dá)過(guò)程中缺少必要的酶或輔助因子，但這也基于重組蛋白的高效表達(dá)[11]。

鴨瘟病毒囊膜蛋白暴露在病毒顆粒的表面，是其主要的保護(hù)性抗原，且UL6基因在不同毒株中具有高度的保守性[12]。因此，可以利用UL6基因編碼的無(wú)毒外源蛋白研制一種亞單位疫苗。本試驗(yàn)采用切膠免疫的方法，將蛋白質(zhì)膠研磨勻漿后注射Balb/c小鼠。其依據(jù)是凝膠也具有佐劑的緩釋作用，可以作為一種特殊的佐劑。并且與過(guò)柱純化相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)是純度高、雜帶少[13]。但該方法的缺點(diǎn)是回收量比較少，切膠研磨后損失較大，需多次電泳切膠才能達(dá)到免疫劑量。

本試驗(yàn)將UL6基因先克隆入pGEM T-easy載體，再與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，有效提高了PCR產(chǎn)物的克隆效率。然后經(jīng)終濃度為1.0 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h后，UL6重組蛋白獲得了高效表達(dá)。將重組蛋白電泳后切膠回收，免疫Balb/c小鼠，制備了多克隆抗體。ELISA結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體能夠特異性識(shí)別UL6重組蛋白，且效價(jià)達(dá)到1∶16 000，說(shuō)明本試驗(yàn)制備的多克隆抗體具有良好的免疫原性，為進(jìn)一步研制鴨瘟病毒診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Duck Plague VirusUL6 Gene

WU Shuang1,MA Lili2,ZHU Shanyuan1,LU Hui1*

(1.Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College,Taizhou 225300,China; 2.College of Veterinary Medicine,Agricultural University of Gansu,Lanzhou 730070,China)

To prepare mouse anti-duckUL6 of duck plague virus polyclonal antibodies,a pair of specific primers were designed,UL6 gene was amplified by PCR,the fragment of theUL6 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+),the resultant recombinant plasmid pET-UL6 was constructed and transformed intoE.coliBL21(DE3).Optimally expressed under the induction of 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 hours.SDS-PAGE analysis showed that the UL6 protein was successfully expressed, and it could be recognized by DPV positive serum. After Westernblot identification,the antiserum against UL6 protein was produced by immunizing Balb/c mouse with recombinant protein.ELISA results showed that the antibodies titer was 1∶16 000.In this research,UL6 gene was successfully expressd inE.coli，the immunogenicity of the polyclonal antibodies was good,and the antiserum could be used for detection ofUL6 gene expression.

duck plague virus;UL6 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-09-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31440083) ;江蘇省科技支撐計(jì)劃——農(nóng)業(yè)部分項(xiàng)目(BE2012366)

吳 雙(1983-),女,江蘇徐州人,副教授,博士,主要從事動(dòng)物傳染病防控和流行病學(xué)研究。 E-mail:jswushuang@sina.cn

*通訊作者：陸 輝 (1975-),男,江蘇海門人，副教授,碩士,主要從事生物工程技術(shù)研究。E-mail:smluhui@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)03-0141-04