滕 蔓，胡 博，馮麗麗，樊劍鳴，郅玉寶，李秀杰，鄧瑞廣，羅 俊*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州450002；3.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州450001)

豬乙腦病毒BHK-21細胞傳代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因組序列分析

滕 蔓1，胡 博1，馮麗麗2，樊劍鳴3，郅玉寶1，李秀杰1，鄧瑞廣1，羅 俊1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州450002；3.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州450001)

為研究豬源乙腦病毒分離株基因遺傳穩(wěn)定性，對豬源乙腦病毒分離株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21細胞上連續(xù)傳代60次后的病毒全基因組進行序列測定及分析。結(jié)果表明，BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因組全長均與各自的親本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致，均為10 977 nt，在2個病毒基因組的10 701 nt位點處均插入1個堿基G。與親本毒株相比，2個細胞傳代毒株的病毒基因組經(jīng)連續(xù)傳代后趨于穩(wěn)定，均有10個位點發(fā)生氨基酸突變，這些突變主要集中在E蛋白區(qū)域。核苷酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，與其他JEV參考毒株相比，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60與弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性較高，分別為99.6%和95.9%，其氨基酸序列與豬源野毒分離株SH0601和HW的氨基酸序列同源性較高，分別為98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。

豬； 乙腦病毒； BHK-21細胞； 細胞傳代； 病毒基因組； 序列分析

日本流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染人、豬、馬等多種動物引起的一種急性人畜共患傳染病[1]。JE簡稱乙腦，該病主要發(fā)生于學(xué)齡前兒童及老齡人群，患者或感染動物的臨床癥狀主要表現(xiàn)為神經(jīng)性腦炎，痊愈后往往留下嚴重的后遺癥。蚊蟲是JEV的自然宿主和重要傳播媒介，尤其是三帶喙庫蚊，病毒可隨蚊蟲冬眠而越冬存活。豬是JEV的重要貯存和擴增宿主，經(jīng)由蚊蟲叮咬后,JEV可在人群和豬群之間形成人—蚊—豬的循環(huán)傳播[2]。不同日齡豬均可感染JEV，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、新生仔豬腦炎或種公豬睪丸炎，導(dǎo)致豬群繁殖障礙及生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，同時也增加了人群公共衛(wèi)生安全的風(fēng)險。

JEV是一種單股正鏈RNA病毒，在分類上屬于黃病毒科(Flaviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，病毒基因組全長為11 kb，5′末端有一個I型帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppAmp)，3′末端多為CU-OH，無poly A尾巴[3]。JEV共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C-PrM/M-E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5)，各基因區(qū)段間無重疊。此前，筆者所在課題組從河南省某規(guī)模化種豬場睪丸腫大的發(fā)病公豬精液中分離到2個JEV流行毒株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3，基于prM和E基因的系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示，這2個毒株均屬于基因Ⅲ型[4-5]。將這2個豬源分離株在BHK-21細胞上進行連續(xù)傳代，對不同代次毒株E基因序列分析的結(jié)果表明，連續(xù)傳代60次后，病毒E基因已基本穩(wěn)定[6]。前期研究未對這2個豬源分離株的全基因遺傳穩(wěn)定性進行測定，為此，本研究對BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3的細胞傳代毒株BSF.ZZ-1-p60和BSE.ZZ-3-p60的全基因組分別進行了序列測定，以期探討細胞連續(xù)傳代后整個病毒基因組的變化情況，為后續(xù)疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞、毒株及試劑

BHK-21細胞系由本實驗室保存；JEV分離株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3毒株均為本實驗室分離保存[4-5]；新生牛血清(NCS)購自杭州四季青公司；TRIzol購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、pMD19-T 載體、DNA 回收試劑盒、ExTaq預(yù)混酶、RNA酶抑制劑、E.coliDH 5α 感受態(tài)細菌、dNTP均由TaKaRa公司提供。

1.2 病毒傳代

常規(guī)方法復(fù)蘇BHK-21細胞，按文獻[7]的方法制備細胞單層，然后將BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3毒株在BHK-21細胞上連續(xù)培養(yǎng)，傳代60次后收集子代病毒培養(yǎng)物，分別命名為BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank已報道的JEV參考毒株全基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計8對保守的JEV全基因組重疊引物(表1)，引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于JEV病毒全基因組RT-PCR擴增的引物

引物編號引物名稱類型引物序列(5'—3')引物長度/bpPCR產(chǎn)物長度/bp1JEVpC/M-F115'CTGTGTGAACTTCTTGGCTTAG22967JEVpC/M-R9783'AACTGTAAGCCGGAGCGACCAA222JEVpE-F9585'TTGGTCGCTCCGGCTTACAG201574JEVpE-R25323'GCCACTTCCACACCTCATCT203JEVpNS1-F25265'AAGTGGCATCTTCGTGCACA201149JEVpNS1-R36753'CCCAAGCATCAGCACAAGTA204JEVpNS2-F36615'GTGCTGATGCTTGGGGGCAT201366JEVpNS2-R50273'AGAATGGGTGAGCCGGATGT205JEVpNS3-F50055'GGAACATCCGGCTCACCCAT201495JEVpNS3-R65003'CATGCGACCGAGCACCTCTA206JEVpNS4-F64875'GTGCTCGGTCGCATGCCTGA201313JEVpNS4-R78003'GCGTGCTTCAGTGCGGTCCA207JEVpNS5/1-F77805'AGGTGGACCGCACTGAAGCA201650JEVpNS5/1-R94303'CATGACCTTGACCACTTTGT208JEVpNS5/2-F94005'ACAGGCACAAAGTGGTCAAG201578JEVpNS5/2-R109783'AGATCCTGTGTTCTTCCTCA20

1.4 RT-PCR

各取300 μL BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60病毒液，采用TRIzol法提取總RNA。用表1中的3′引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，分別制備cDNA。 20 μL PCR體系包括：ExTaq預(yù)混酶10 μL、cDNA模板 1 μL、5′及3′引物各1 μL、 d3H2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.5 基因克隆及測序

采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并回收目的片段，連接pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化至DH 5α感受態(tài)細胞，涂氨芐青霉素抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。菌落PCR篩選陽性克隆，PCR反應(yīng)體系和條件同1.4，最后將陽性菌送樣至生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 全基因組序列分析

用DNAstar MegAlign軟件將測序獲得的8個基因片段分別與部分JEV參考毒株(表2)全基因組序列進行比對，分析其序列同源性，然后用SeqMan軟件將基因片段拼接成全基因組。最后分析BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60與6個參考毒株的全基因組核苷酸及氨基酸序列同源性，并結(jié)合15個強、弱參考毒株的基因組對關(guān)鍵氨基酸位點進行比對分析。

表2 JEV參考毒株的背景信息

編號毒株基因型登錄號年份國家與地區(qū)來源1P3ⅢU470321949北京人2SA14ⅢU141631954西安人3Beijing-1ⅢL489611949北京人4HWⅢAY8499391988湖北豬5HWeⅢEF1075231988湖北豬6SA14-12-1-7ⅢAF4164571960s中國蚊蟲7SH0601ⅢEF5438612006上海豬8JaGAr01ⅢAF0690761959日本蚊蟲9P20778ⅢAF0802511958印度人10SA14-14-2ⅢAF3151191960s中國蚊蟲11JEV-at222ⅢAB196924不詳日本人12JEV-at31ⅢAB196923不詳日本人13JaOH0566ⅢAY5088131966日本人14CH2195LAⅢAF2214991994臺灣蚊蟲15ML17ⅢAY5088121981日本疫苗16GP78ⅢAF0757231978印度人

2 結(jié)果與分析

2.1 JEV細胞傳代毒株基因組的RT-PCR擴增及測序結(jié)果

將豬源JEV分離株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21細胞上連續(xù)傳代60次，分別提取病毒培養(yǎng)物總RNA，然后用JEV特異性引物(表1)對2個傳代毒株的病毒全基因組進行RT-PCR，分別擴增JEV的C/M、E、NS1、NS2、NS3、NS4、NS5-1和NS5-2基因片段。電泳分析結(jié)果表明，所擴增的PCR產(chǎn)物條帶均與預(yù)期大小相符(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，結(jié)果顯示，2個毒株的8個基因組片段與SA14-14-2的核苷酸序列同源性均在98%以上。

(A)為BSF.ZZ-1-p60； (B)為BSF.ZZ-3-p60

2.2 JEV細胞傳代毒株全基因組的序列拼接及分析結(jié)果

對克隆獲得的8個病毒基因片段序列分別進行全基因組拼接，分析結(jié)果顯示，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的病毒基因組全長均為10 977 nt，在2個病毒基因組的10 701 nt位點處均有1個插入堿基G。BSF.ZZ-1-p60的A、G、T、C比例分別為27.67%、28.42%、21.01%、22.90%；BSF.ZZ-3-p60的A、G、T、C比例分別為27.75%、28.35%、20.99%、22.91%。2個毒株5′ 非編碼區(qū)均含有96個核苷酸，均有1個97位至10 392位的單一開放閱讀框，編碼3 432個氨基酸殘基。

2.3 JEV細胞傳代毒株基因組與參考毒株的序列同源性比對分析結(jié)果

將BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60的病毒全基因組序列分別與表2中的強毒株SA14、弱毒疫苗株SA14-14-2、中間減毒株SA14-12-1-7以及3個豬源分離強毒株SH0601、HWe和HW進行同源性比對分析，結(jié)果表明，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因組核苷酸序列同源性與SA14、SA14-14-2、SA14-12-1-7疫苗株較高，其中與SA14-14-2同源性最高，分別為99.6%和95.9%,但與SH0601、HWe和HW的同源性較低(表3)。6個參考毒株的全基因組氨基酸序列與BSF.ZZ-1-p60的同源性均較高，而與BSF.ZZ-3-p60的氨基酸序列同源性均較低。BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60與SH0601和HW的氨基酸序列同源性較高，分別為98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。

表3 JEV細胞傳代毒株與6個參考毒株的基因組序列同源性分析 %

2.4 JEV細胞傳代毒株病毒全基因組關(guān)鍵氨基酸殘基位點差異分析

將BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60與表2中的10個強毒株、5個弱毒株及其親本毒株的全基因組氨基酸序列進行比對，分析關(guān)鍵氨基酸位點的差異(表4)。與SA14等強毒株和弱毒株相比，2個細胞傳代毒株及其親本毒株的氨基酸序列特征與疫苗毒株SA14-14-2和中間減毒株SA14-12-1-7更接近；與親本毒株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3相比，2個細胞傳代毒株各自均發(fā)生了10個位點的氨基酸突變，主要集中在E蛋白區(qū)域；2個細胞傳代毒株之間也有多個氨基酸位點差異，如E107、E138、E176、E279等。上述結(jié)果表明，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的病毒全基因組氨基酸序列與弱毒疫苗株SA14-14-2差異最小。

表4 BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60與15個參考毒株全基因組關(guān)鍵氨基酸位點差異分析

位點強毒株SA14Beijing-1P3HWHWeP20-778GP78JaG-Ar01JaOH0566JEV-at31弱毒株JEV-at222CH21-95LAML17SA14-12-1-7 SA14- 14-2親本毒株BSF.ZZ-1BSF.ZZ-3傳代毒株BSF.ZZ-1-p60 BSF.ZZ-3-p60C11N------------S-----C57T---------------A--C66L------------SSSSSSC74K------------R-----M2K-RRR--------------M5N--------------D---M24V--------------G---E42D------------------E76T-MMM-M------------E81H---------------R--E107L------------FFFFF-E138E-------K-K-KKKKKK-E176I----T----T--VVVVV-

續(xù)表4 BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60與15個參考毒株全基因組關(guān)鍵氨基酸位點差異分析

位點強毒株SA14Beijing-1P3HWHWeP20-778GP78JaG-Ar01JaOH0566JEV-at31弱毒株JEV-at222CH21-95LAML17SA14-12-1-7 SA14- 14-2親本毒株BSF.ZZ-1BSF.ZZ-3傳代毒株BSF.ZZ-1-p60 BSF.ZZ-3-p60E177T-------------AAA-AE244E------------GGGG--E264Q------------HHHHHHE271V------------------E279K-------------MMM-ME315A-------------VVVVVE439K------------RRRRRRE447G-------------DD---NS1-22V----I----------IHHNS1-235DG-GGGGGGGGGG------NS1-292SG-GGGGGGGGGGG-----NS1-339R-------------MMMMMNS1-351D-------------HHHHHNS1-354N------------KKKKKKNS1-392A-------------VVVVVNS2a-1A-----------S------NS2a-121HQ-QQQQQQQQQQ------NS2b-63E-------------DDDDDNS2b-65D-----E------GGGGGGNS3-31L-----F---------F--NS3-59M------------VVVVVVNS3-105A------------GGGGGGNS3-235A-------------VVVVVNS3-246S--------------T---NS3-474H------------------NS4a-64T---------------A--NS4a-230V--------------A---NS4a-255I------------VVVVVVNS5-231H---------------Y--NS5-268H-YYY--YYYY-Y-YYYGGNS5-557E------------------NS5-635Q------------------NS5-639Q-------------HHHHHNS5-671V-------------AAAAANS5-855L--------------F---

注：“-”表示該位點的氨基酸殘基與SA14相應(yīng)位點的氨基酸殘基一致。

3 討論

JE最早發(fā)現(xiàn)于日本，之后在東南亞也相繼報道，調(diào)查顯示，JE最初可能發(fā)生于印度尼西亞或馬來西亞[8-9]。與其他病毒相比，JEV病毒基因組編碼的大多數(shù)基因較為保守，更多研究主要集中于prM或E基因。此前研究表明，基因Ⅰ型JEV毒株的流行分布日漸廣泛，有超過基因Ⅲ型的趨勢[10-11]。在長期疫苗免疫壓力及病毒自身進化過程中，JEV是否可能發(fā)生病毒變異或毒力增強，仍需要更加密切、廣泛的流行病學(xué)調(diào)查及疫情監(jiān)測。豬是JEV最重要的儲存和擴增宿主[2]，因此研發(fā)高效的豬用乙腦疫苗、做好豬群的免疫接種，對于有效控制人群乙腦的流行至關(guān)重要。在此前研究中[4-6]，筆者所在課題組已從臨床病例豬中分離了2個JEV流行毒株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3，并將其在BHK-21細胞上進行了連續(xù)60次的傳代培養(yǎng)，對傳代毒株E基因的序列分析發(fā)現(xiàn)病毒傳代已趨穩(wěn)定。因此在本研究中，對BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60這2個細胞傳代毒株的全基因組進行了序列測定和分析，結(jié)果表明，與親本毒株相比，連續(xù)傳代的子代病毒基因組有多個氨基酸殘基位點的穩(wěn)定突變，其中E蛋白突變較多。與強毒株SA14和弱毒株SA14-12-1-7、SA14-14-2[12-13]相比，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60與疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性最高。此前研究表明，影響JEV毒力的除了E基因起關(guān)鍵作用外，還包括C基因和一些非結(jié)構(gòu)基因。氨基酸殘基位點E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439、NS2b-63、NS3-105和NS4b-106等被認為是JEV減毒過程中的關(guān)鍵突變位點，與JEV毒力直接相關(guān)[14]。本研究顯示，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60基因組中這些位點大多與疫苗株SA14-14-2一致，與SA14不一致。從病毒全基因組氨基酸序列同源性來看，BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60與豬源分離株的同源性更高，這為今后進一步篩選豬用乙腦疫苗候選毒株奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Sequence Analysis of Full-length Genomes of Two Japanese Encephalitis Virus Strains BSF.ZZ-1-p60 and BSF.ZZ-3-p60 Passaged on BHK-21 Cells

TENG Man1,HU Bo1,FENG Lili2,FAN Jianming3,ZHI Yubao1,LI Xiujie1,DENG Ruiguang1,LUO Jun1*

(1.Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology/Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

In this study,the full-length genomes of two Japanese encephalitis virus (JEV) strains,BSF.ZZ-1-p60 and BSF.ZZ-3-p60 that were isolated from pigs and passaged on BHK-21 Cells,were sequenced and compared with reference strains.The results showed that same to the parental viruses,both of the genomes of BSF.ZZ-1-p60 and BSF.ZZ-3-p60 were 10 977 nt long,with an insert base of G at the 10 701 nt site.Compared to the parental strains,the viral genomes of BSF.ZZ-1-p60 and BSF.ZZ-3-p60 were stabilized after passaged on BHK-21 cells for 60 times,with a total of 10 amino acid mutations which we mainly occurred in E proteins in both strains.Compared to the reference JEV strains,both BSF.ZZ-1-p60 and BSF.ZZ-3-p60 showed highest nucleotide sequence homologies (99.6% and 95.9%) to vaccine strain SA14-14-2, while for the amino acid sequences,both strains showed highest homologies (98.2%，86.4% and 98.3%,86.5% ) to that of the pig-originated strains SH0601 and HW,respectively.

pig; JEV; BHK-21 cell; cell passage; viral genome; sequence analysis

2015-11-20

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203082-5)；河南省科技攻關(guān)計劃項目(152102110127)；河南省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣財政補助資金項目(YCN201519111)；河南省農(nóng)科院科研發(fā)展專項資金項目(20157817)

滕 蔓(1977-)，女，河南周口人，助理研究員，博士，主要從事動物疫病快速檢測技術(shù)研究及產(chǎn)品研發(fā)。 E-mail:tm135@aliyun.com

*通訊作者：羅 俊(1978-)，男，河南羅山人，研究員，博士，主要從事動物病毒流行病學(xué)、病原學(xué)、致病機制及快速檢測技術(shù)研究。E-mail：luojun593@aliyun.com

S855.3

A

1004-3268(2016)03-0135-06