劉 媛，李學(xué)伍，王 麗，谷 雨，王林建

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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雞4種主要RNA病毒病多重感染復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立

劉 媛1，李學(xué)伍2，王 麗2，谷 雨3，王林建3

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

依據(jù)GenBank中注冊(cè)的禽流感病毒(AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性法氏囊病毒(IBDV)基因組核苷酸序列，通過(guò)序列比對(duì)獲得AIV、IBV、NDV、IBDV的相對(duì)保守序列。根據(jù)每種病毒的保守序列利用生物學(xué)軟件分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，4種病毒共設(shè)計(jì)12對(duì)引物，并對(duì)12對(duì)引物進(jìn)行模擬篩選，獲得匹配最佳的4對(duì)引物。對(duì)獲得的最佳匹配引物進(jìn)行單項(xiàng)PCR驗(yàn)證，優(yōu)化復(fù)合PCR反應(yīng)條件，確定最佳的退火溫度、引物濃度和TaqDNA聚合酶使用量；經(jīng)特異性、敏感性及簡(jiǎn)化PCR試驗(yàn)，最終建立了簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的檢測(cè)方法可同時(shí)擴(kuò)增出4條大小與設(shè)計(jì)相符的特異性片段，即IBV(146 bp)、NDV(215 bp)、IBDV(345 bp)、AIV(435 bp)；建立的復(fù)合PCR方法具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，能檢測(cè)出100 pg AIV、IBV、IBDV的cDNA和100 fg NDV的cDNA；將三溫?zé)嵫h(huán)改進(jìn)為二溫?zé)嵫h(huán)，即將退火和延伸過(guò)程合為一步(62 ℃)，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間。

禽流感病毒； 雞傳染性支氣管炎病毒； 新城疫病毒； 傳染性法氏囊病毒； RNA病毒； 復(fù)合PCR

禽流感(avian influenza，AI)、雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)、新城疫(Newcastle di-sease，ND)和傳染性法氏囊病(infectious bursal di-sease，IBD)是雞常見(jiàn)的重要RNA病毒病。其中，禽流感病毒(AIV)為正黏病毒科甲型流感病毒屬，雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)為冠狀病毒科冠狀病毒屬的代表種，新城疫病毒(NDV)屬副黏病毒科腮腺炎病毒屬，傳染性法氏囊病病毒(IBDV)屬雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，這4種病毒均為RNA病毒[1-4]。AI、IB、ND和IBD具有流行廣泛、傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高、治愈率低、危害大等特點(diǎn)；且臨床上常發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的發(fā)展。這些疫病的發(fā)病特征、臨床癥狀和剖檢變化相似不易區(qū)分，傳統(tǒng)的病原分離鑒定和血清學(xué)方法無(wú)法進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒別診斷，嚴(yán)重影響對(duì)這些疫病的有效防制。因此，建立一種特異、敏感、快速的檢測(cè)方法，對(duì)于雞主要病毒性傳染病的診斷和防控十分迫切和必要。

近年來(lái)，利用普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、核酸探針、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、固相基因芯片、液相芯片等技術(shù)檢測(cè)病毒已有很多報(bào)道，其中PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種疫病的檢測(cè)診斷[5]，但都是對(duì)單一病毒進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法對(duì)多種病原混合感染進(jìn)行快速鑒別診斷。復(fù)合PCR技術(shù)不僅具有普通PCR特異性強(qiáng)、敏感性高、快捷簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，而且可在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多份DNA或RNA樣本的不同目的基因片段，由此可以檢測(cè)鑒別多種不同的病原體，特別適用于快速診斷多種混合感染的臨床樣本[6-8]。建立快速、準(zhǔn)確、一次性檢測(cè)4種病毒的檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)防和控制上述疫病具有重要意義，鑒于此，本研究建立針對(duì)上述4種RNA病毒的簡(jiǎn)易復(fù)合PCR檢測(cè)方法，以達(dá)到在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)病原體特異核酸片段的目的，為雞主要RNA病毒病病原的快速準(zhǔn)確檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株

IBV(LDT3-A株)、NDV(LaSota株)、IBDV(B87株)為哈爾濱獸醫(yī)研究所維科生物有限公司生產(chǎn)的活疫苗，AIV尿囊液(H9N2株)由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DEPC處理水、PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中下載AIV、IBV、NDV、IBDV基因組核苷酸序列，即AIV的HA基因(GI：6537263，序列長(zhǎng)度為1 064 bp)、IBV的N基因(GI：806017795，序列長(zhǎng)度為1 230 bp)、NDV的L基因(GI：41323390，序列長(zhǎng)度為6 615 bp)、IBDV的B基因(GI：114864536，序列長(zhǎng)度為2 827 bp)，通過(guò)序列比對(duì)獲得AIV、IBV、NDV、IBDV 4種病毒基因的相對(duì)保守序列[9-10]；按照復(fù)合PCR對(duì)引物序列和退火溫度等因素的要求，根據(jù)病毒的保守序列應(yīng)用Primer Premier 6.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，4種病毒共設(shè)計(jì)12對(duì)引物，利用生物學(xué)軟件模擬篩選出匹配最佳的引物，即能同時(shí)擴(kuò)增上述4種病原特定核酸片段的特異性引物[11]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取

將IBV、NDV、IBDV凍干疫苗用DEPC處理水制成懸液，根據(jù)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書對(duì)AIV、IBV、NDV、IBDV總RNA進(jìn)行提取；隨即對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA于-20 ℃或-70 ℃保存?zhèn)溆肹12]；測(cè)定4種cDNA的濃度及OD260/OD280值，并稀釋cDNA至工作濃度。

1.5 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增

分別將提取的IBV、NDV、IBDV、AIV的cDNA與對(duì)應(yīng)的匹配最佳的引物混合，建立50 μL常規(guī)PCR反應(yīng)體系：PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye) 25 μL，病毒特異性上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，高壓雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，在不同退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.6 復(fù)合PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

在單項(xiàng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上，將RNA病毒AIV、NDV、IBV和IBDV的cDNA(各1 μL)以及各種反應(yīng)試劑混合在一起進(jìn)行復(fù)合PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。條件的優(yōu)化主要包括退火溫度的優(yōu)化、引物濃度的選擇、TaqDNA聚合酶使用量的優(yōu)化[13]。經(jīng)復(fù)合PCR擴(kuò)增篩選出最佳的反應(yīng)條件。

1.7 復(fù)合PCR敏感性試驗(yàn)

將提取的AIV、NDV、IBV和IBDV的cDNA進(jìn)行核酸定量，測(cè)定各病原核酸的濃度，用DEPC水10倍梯度倍比稀釋，模板稀釋倍數(shù)依次為101、102、103、104、105、106、107。取各稀釋度的cDNA為模板，采用最佳復(fù)合PCR反應(yīng)優(yōu)化條件進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)最低檢出量來(lái)確定其敏感性。

1.8 復(fù)合PCR特異性試驗(yàn)

將AIV、IBV、NDV、IBDV、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、禽痘病毒(FPV)、 馬立克氏病毒(MDV)7種

病毒的cDNA依次加入和同時(shí)一起加入到優(yōu)化好條件的復(fù)合PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測(cè)其是否具有特異性[14]。

1.9 復(fù)合PCR簡(jiǎn)化試驗(yàn)

在經(jīng)典PCR技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，依據(jù)酶學(xué)原理對(duì)常規(guī)PCR三溫循環(huán)進(jìn)行改進(jìn)。將上述4種病毒的退火及延伸的溫度設(shè)置在同一溫度，確保在酶活性不是最高的條件下，與模板退火結(jié)合的引物也可以短時(shí)間內(nèi)充分延伸形成產(chǎn)物片段，減少升降溫過(guò)程，從而縮短反應(yīng)時(shí)間，提高反應(yīng)速度[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

利用生物學(xué)軟件對(duì)12對(duì)引物進(jìn)行模擬篩選，獲得并合成匹配最佳的4對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 IBV、NDV、IBDV、AIV復(fù)合PCR擴(kuò)增匹配引物

2.2 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，各病毒均擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的特異性條帶，分別是：IBV 146 bp、NDV 215 bp、IBDV 345 bp、AIV 435 bp。可見(jiàn)，設(shè)計(jì)引物在單項(xiàng)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中均可獲得特異擴(kuò)增片段，實(shí)現(xiàn)了單獨(dú)檢出其對(duì)應(yīng)病毒的目的，且效果良好。

M：DNA Marker； 1—4：分別為AIV、IBV、IBDV、NDV

2.3 復(fù)合PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

在單項(xiàng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)復(fù)合PCR反應(yīng)條件中退火溫度、引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度的優(yōu)化，確定復(fù)合PCR的最佳反應(yīng)條件。

2.3.1 退火溫度 在單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，利用4對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增4種病毒的混合模板，建立復(fù)合PCR方法。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的Tm值，確定復(fù)合PCR體系的退火溫度范圍，設(shè)置溫度梯度進(jìn)行體系退火溫度的優(yōu)化，試驗(yàn)溫度分別為55、56、58、60、62 ℃。結(jié)果顯示，退火溫度在55、56 ℃時(shí)均呈現(xiàn)良好擴(kuò)增結(jié)果(圖2)。為確保PCR反應(yīng)的特異性，選擇56 ℃為最佳退火溫度。

M：DNA Marker； 1—5：退火溫度分別為55、56、58、60、62 ℃

2.3.2 引物濃度 選擇不同的引物濃度進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，同時(shí)提高IBDV的引物濃度；則復(fù)合PCR反應(yīng)體系為：PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)25 μL，cDNA各1 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL； AIV、IBV、NDV上下游引物濃度分別均設(shè)為25、50、100、150、200 μmol/L，IBDV上下游引物濃度分別為50、75、125、175、225 μmol/L。結(jié)果顯示，AIV、IBV、NDV引物濃度在100 μmol/L，IBDV引物濃度在125 μmol/L時(shí)的條帶最亮(圖3)。因此，選用AIV、IBV、NDV引物濃度100 μmol/L，IBDV引物濃度125 μmol/L為最佳引物濃度。

M：DNA Marker； 1—5：IBV、NDV、AIV引物濃度

2.3.3TaqDNA聚合酶使用量 以優(yōu)化完成的退火溫度、引物濃度為基礎(chǔ),在建立的復(fù)合PCR 50 μL反應(yīng)體系中，將PremixTaq(0.05 U/μL)使用量分別設(shè)定為15、20、25、30、35 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，PremixTaq使用量為25 μL時(shí)效果最佳(圖4)。

M：DNA Marker； 1—5：Premix Taq(0.05 U/μL)

2.4 復(fù)合PCR的敏感性檢測(cè)

將10倍遞進(jìn)稀釋后的AIV、IBV、NDV、IBDV的cDNA作為模板，模板質(zhì)量濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 pg/μL。采用最佳的退火溫度、引物濃度和PremixTaq使用量等復(fù)合PCR反應(yīng)條件，進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示：該復(fù)合PCR至少能同時(shí)擴(kuò)增到100 pg AIV、IBV、IBDV和100 fg NDV的cDNA(圖5)。

M：DNA Marker； 1—7：模板質(zhì)量濃度分別為：10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg

2.5 復(fù)合PCR的特異性檢測(cè)

以AIV、IBV、NDV、IBDV、ILTV、FPV、MDV的核酸為模板，應(yīng)用建立的復(fù)合PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)該復(fù)合PCR的特異性。結(jié)果顯示，單獨(dú)擴(kuò)增IBV、NDV、IBDV和AIV的核酸全部出現(xiàn)與預(yù)期相符的目的片段，而單獨(dú)擴(kuò)增ILTV、FPV、MDV的核酸均沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，與此同時(shí)混合7種病毒核酸的復(fù)合PCR體系只擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)相符的AIV、IBV、NDV、IBDV核酸的特異性擴(kuò)增條帶(圖6)。

M：DNA Marker； 1—4：分別為AIV、IBDV、NDV、IBV；5：IBV+NDV+AIV+IBDV+MDV+FPV+ILTV；6—8：分別為MDV、FPV、ILTV

2.6 復(fù)合PCR的簡(jiǎn)化結(jié)果

對(duì)建立的復(fù)合PCR進(jìn)行簡(jiǎn)化改進(jìn)，即將退火—延伸合并為一個(gè)溫度，探索退火—延伸的最佳溫度，試驗(yàn)溫度分別設(shè)為56、58、60、62、64、66、68、70 ℃。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火—延伸(56、58、60、62、64、66、68、70 ℃)40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果顯示，退火—延伸溫度在62 ℃時(shí)最佳(圖7)。

M：DNA Marker； 1—8：退火—延伸溫度分別為56、58、60、62、64、66、68、70 ℃

3 結(jié)論與討論

一種高效復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立，涉及多種因素，如特異性引物、退火溫度、引物濃度和TaqDNA聚合酶使用量等。最關(guān)鍵的因素是引物設(shè)計(jì)，與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)相比，其對(duì)引物的要求更高[17]，引物不僅要具有特異性、敏感性、無(wú)二聚體，而且要確保引物對(duì)之間有相近的退火溫度；同時(shí)兼顧復(fù)合PCR擴(kuò)增片段的大小，確保各病毒模板的擴(kuò)增片段在電泳圖譜上能夠更直觀方便地區(qū)分。引物濃度和TaqDNA聚合酶使用量同樣有至關(guān)重要的作用，對(duì)復(fù)合PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，可使建立的復(fù)合PCR體系對(duì)所檢測(cè)的病毒更具敏感性。特異性和敏感性是復(fù)合PCR方法成功建立的標(biāo)志，由于復(fù)合PCR反應(yīng)體系中多對(duì)引物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合擴(kuò)增，存在引物之間產(chǎn)生干擾的可能性，引物對(duì)越多，干擾的可能性就越大，引物設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)才可避免或降低這種干擾。本研究從設(shè)計(jì)的12對(duì)引物中篩選出匹配最佳的4對(duì)特異性引物，其Tm值范圍相近，目的片段大小存在明顯差異(146、215、345、435 bp),為復(fù)合PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)；建立的復(fù)合PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高，AIV、IBV、IBDV檢出限為100 pg，NDV為100 fg。

常規(guī)PCR的擴(kuò)增，包括模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火、引物的延伸。其中TaqDNA聚合酶活性最適溫度為70～75 ℃，在此溫度下延伸速度為150～300 bp/s，60～70 ℃時(shí)為60～120 bp/s。若試驗(yàn)擴(kuò)增的目的片段較短(100～500 bp)，反應(yīng)混合物在變性溫度(94 ℃)和退火溫度(50 ℃)之間過(guò)渡時(shí)，已達(dá)到了TaqDNA聚合酶的最適溫度，可以在短時(shí)間內(nèi)充分延伸形成所需產(chǎn)物片段[18]。因此，本試驗(yàn)根據(jù)常規(guī)PCR技術(shù)原理，對(duì)已完成的復(fù)合PCR(三步法熱循環(huán)步驟)進(jìn)行改進(jìn)，將退火和延伸合并為一步，縮短了PCR的反應(yīng)時(shí)間，且試驗(yàn)探索的退火—延伸最佳溫度為62 ℃，比三溫復(fù)合PCR的退火溫度(56 ℃)高，所得產(chǎn)物的特異性高，各引物與模板的結(jié)合更為準(zhǔn)確和穩(wěn)定，擴(kuò)增條帶更清晰。不僅提高了對(duì)AIV、IBV、NDV和IBDV的診斷速度，為有效控制疫病爭(zhēng)取了寶貴的時(shí)間，而且為雞主要RNA病毒性疫病病原的快速準(zhǔn)確檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of Multiplex PCR Detection Method for Four Kinds of Avian Main RNA Viral Diseases

LIU Yuan1,LI Xuewu2,WANG Li2,GU Yu3,WANG Linjian3

(1.College of Animal Science and Technology,Henan Science and Technology University,Luoyang 471023,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Specific primers were designed upon gene conservative sequence in GenBank as well as the gene of avian influenza virus(AIV),avian infectious bronchitis virus(IBV),newcastle disease virus(NDV) and infectious bursal disease virus(IBDV) genomic nucleotide.Biological software were uesd to design 3 pairs of specific primers in the conserved sequence of each kind of virus,12 pairs of primers were designed for 4 viruses,12 pairs of primers was simulated screened,and 4 pairs of primers were appropriate.Optimal annealing temperature,concentration of primers andTaqDNA polymerase concentration were determined to optimizated multiplex PCR reaction conditions.The specificity test,sensitivity test and simplified PCR test were used to establish the simple multiplex PCR detection method.The results showed that specific bands at lengths of IBV(146 bp),NDV(215 bp),IBDV(345 bp) and AIV(435 bp) respectively were amplified by the developed quadruple PCR,which were consistent with those expected.It indicated that high specificity and sensitivity of the developed method,which could detect 100 pg AIV,IBV,NDV IBDV cDNA and 100 fg NDV cDNA.According to the classical principle of PCR technology,the composite PCR(three step thermal cycle step)was improved,which annealing and extension step were merged into one step,and the optimum temperature of annealing-extension was 62 ℃,which could reduce the reaction time.

AIV; IBV; NDV; IBDV; RNA virus; multiplex PCR

2016-05-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303033)

劉 媛(1991-)，女，河南漯河人，在讀碩士研究生，研究方向：分子病原學(xué)和免疫學(xué)。E-mail：862424624@qq.com

S855.3

A

1004-3268(2016)11-0105-05