張家慶，高彬文，王獻(xiàn)偉，馬 強(qiáng)，高 原，任巧玲，白獻(xiàn)曉，邢寶松*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省畜牧總站 河南 鄭州 450008；3.新縣畜牧局,河南 新縣 465550)

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豬卵泡期中等卵泡發(fā)育和閉鎖的相關(guān)基因表達(dá)及激素水平分析

張家慶1，高彬文1，王獻(xiàn)偉2，馬 強(qiáng)1，高 原3，任巧玲1，白獻(xiàn)曉1，邢寶松1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省畜牧總站 河南 鄭州 450008；3.新縣畜牧局,河南 新縣 465550)

研究豬卵泡期內(nèi)有腔卵泡發(fā)育和閉鎖中顆粒細(xì)胞自噬與凋亡、卵泡內(nèi)調(diào)控因子、類固醇激素及相關(guān)酶類的變化，為提高排卵前卵泡發(fā)育數(shù)量提供理論依據(jù)。從豬卵泡期卵巢中分離3～5 mm有腔卵泡，根據(jù)發(fā)育變化分為健康卵泡、早期閉鎖和晚期閉鎖3類，應(yīng)用HE染色觀察內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用酶免法檢測卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的濃度變化，采用Real-time PCR方法檢測自噬相關(guān)基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5 、ATG7)、凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2 和Bax)、類固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受體和卵泡內(nèi)關(guān)鍵調(diào)控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同類型卵泡中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，健康卵泡中顆粒細(xì)胞層完整，有少量凋亡細(xì)胞,早期和晚期閉鎖卵泡中顆粒細(xì)胞層分散，且凋亡細(xì)胞明顯增多。早期和晚期閉鎖卵泡中P4/E2顯著高于健康卵泡，自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平在早期和晚期閉鎖的卵泡中顯著高于健康卵泡，類固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表達(dá)量在早期和晚期閉鎖卵泡中顯著高于健康卵泡，CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表達(dá)量在早期和晚期閉鎖卵泡中顯著低于健康卵泡，而CART的表達(dá)量則呈現(xiàn)相反的趨勢。由此可見，顆粒細(xì)胞自噬和凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，而類固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通過提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡閉鎖的進(jìn)程。

豬； 有腔卵泡； 卵泡發(fā)育； 卵泡閉鎖

能繁母豬是豬場生產(chǎn)的基礎(chǔ)，其繁殖力的高低對于豬場效益具有至關(guān)重要的作用。母豬的排卵數(shù)常被視為潛在的產(chǎn)仔數(shù)，而排卵數(shù)量多少取決于卵泡的初始征集數(shù)量和終末閉鎖數(shù)量。研究表明，小母豬在初生后10 d左右兩側(cè)卵巢上約有500萬個原始卵泡；而在其能繁時期，至多1 600個卵泡能發(fā)育至成熟排卵，其余卵泡均在發(fā)育過程中閉鎖退化消失[1]。從豬卵泡期開始，約有50個卵泡被征集啟動生長，而最后發(fā)育至成熟并排卵的數(shù)量只有12～20個[2-3]。卵泡閉鎖能夠發(fā)生在卵泡生長和發(fā)育的不同時段，但絕大多數(shù)卵泡在發(fā)育至直徑6 mm之前閉鎖退化消失[4-5]。卵泡的生長和發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種因素共同調(diào)控，包括類固醇激素、各種代謝酶類、局部生長因子等。前人研究表明，類固醇激素如雌激素(E2)和孕激素(P4)等，在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中具有重要的調(diào)控作用[6]。E2能促進(jìn)卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞增殖，抑制卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡和促進(jìn)卵泡成熟排卵；P4 能夠促進(jìn)卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡和加快卵泡閉鎖退化。細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，最近研究表明，凋亡和自噬共同存在于卵泡發(fā)育和閉鎖過程中，且兩者之間存在交互調(diào)控作用[7]。目前，在豬卵泡期有腔卵泡(3～5 mm)發(fā)育過程中，卵泡內(nèi)類固醇激素及合成酶類之間的變化與卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞自噬與凋亡及內(nèi)部調(diào)控因子之間的密切關(guān)系迄今鮮見報道?；诖?，本研究對不同類型的中等有腔卵泡(健康卵泡、早期閉鎖、晚期閉鎖)類固醇激素及合成酶變化與顆粒細(xì)胞自噬和凋亡及關(guān)鍵調(diào)控因子之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為提高動物繁殖效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗樣品采自新鄉(xiāng)市輝縣屠宰場,所用卵巢來自10頭體質(zhì)量為120～140 kg的商品母豬。母豬屠宰后立刻取下整個子宮，然后根據(jù)卵巢發(fā)育變化(卵泡直徑大小、黃體發(fā)育變化等)選擇處于卵泡期內(nèi)的發(fā)育良好的卵巢，放入已加入雙抗(含青霉素、鏈霉素各 500 IU/mL)的37 ℃生理鹽水中，保溫瓶存放，1～3 h內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵泡的分離與鑒定 在超凈工作臺內(nèi)，使用生理鹽水將卵巢清洗2～3次后，置于盛有適量生理鹽水的平皿中，用眼科剪刀將卵巢周圍多余組織進(jìn)行清除，然后使用小剪刀或手術(shù)刀片沿卵巢縱軸切開，再借助眼科剪刀或注射器針頭分離不同大小卵泡。卵泡分離以后，在帶有目測微尺的顯微鏡下挑選邊緣整齊且無破損的中等卵泡(3～5 mm)。將卵泡按照形態(tài)結(jié)構(gòu)分為以下3種類型：健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡[8-10]。

1.2.2 顆粒細(xì)胞與卵泡液的收集 為了獲得單個卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞和卵泡液，卵泡分離經(jīng)初步鑒定后，分別將單個卵泡置于細(xì)胞專用分離管中(分離管中上部具有網(wǎng)篩，可用于分離顆粒細(xì)胞和卵泡液，同時將卵泡內(nèi)外膜等組織滯留在網(wǎng)篩之上)，使用眼科鑷輕輕將卵泡壁撕破，然后低速離心(2 000～3 000 r/min)2 min即可，再將卵泡壁組織去除進(jìn)行高速離心分離顆粒細(xì)胞核卵泡液，分離之后分別將顆粒細(xì)胞和卵泡液置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 生殖激素的測定 采用武漢伊萊瑞特生物科技有限公司所生產(chǎn)的豬孕酮和雌激素ELISA檢測試劑盒，測定前對每個卵泡中分離的卵泡液使用生理鹽水進(jìn)行50倍稀釋，然后分別測定單個分離的卵泡液中E2和P4的質(zhì)量濃度。

1.2.4 RNA提取和Real-time PCR 為獲得單個卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞RNA樣品，利用凱杰生物技術(shù)有限公司的微量RNA提取試劑盒對單個卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞樣品進(jìn)行RNA的提取。采用寶生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量PCR操作，具體操作方法按照說明書進(jìn)行操作。本研究中所用引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物詳細(xì)信息見表1。

表1 Real-time PCR所用引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△Ct方法計算各目的基因的相對表達(dá)量，具體計算方法參照已發(fā)表文獻(xiàn)[11]，采用SPSS 17.0軟件one-way ANOVA方法對不同類型卵泡內(nèi)各基因的mRNA水平及卵泡內(nèi)激素質(zhì)量濃度的變化進(jìn)行差異顯著性檢驗，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型豬有腔卵泡形態(tài)學(xué)觀察及其E2和P4質(zhì)量濃度的變化

不同類型豬有腔卵泡的形態(tài)學(xué)觀察見圖1，健康卵泡中顆粒細(xì)胞層完整，顆粒細(xì)胞之間及與卵泡壁結(jié)合緊密，細(xì)胞核染色均勻且無脫落現(xiàn)象，存在極少凋亡細(xì)胞(圖1A)。在早期閉鎖卵泡中，顆粒細(xì)胞層之間松散，細(xì)胞之間及與細(xì)胞壁結(jié)合有輕微脫落現(xiàn)象，細(xì)胞核染色較深且有輕微脫落現(xiàn)象(圖1B)。晚期閉鎖卵泡中，部分顆粒細(xì)胞脫落到泡腔中，細(xì)胞核染色較深，核膜皺縮，凋亡現(xiàn)象明顯(圖1C)。健康卵泡液中E2的水平顯著高于早期閉鎖和晚期閉鎖卵泡(圖2A)；P4的水平則呈現(xiàn)出相反的趨勢(圖2B)，即健康卵泡液中的P4水平顯著低于早期和晚期閉鎖卵泡。當(dāng)卵泡出現(xiàn)早期閉鎖時，卵泡液中E2的水平開始下降，而P4的水平開始增加，P4/E2隨著有腔卵泡閉鎖程度的增加而升高 (圖2C)。

A：健康卵泡； B：早期閉鎖卵泡； C：晚期閉鎖卵泡(500 μm)圖1 不同類型豬有腔卵泡HE染色的形態(tài)學(xué)特征

不同字母表示同一指標(biāo)在不同類型有腔卵泡中差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同類型豬有腔卵泡中類固醇激素合成酶和激素受體基因的表達(dá)變化

從圖3可以看出，與健康卵泡相比，隨著卵泡閉鎖程度的加深，F(xiàn)SHR和ERα的表達(dá)水平在早期閉鎖和晚期閉鎖卵泡中顯著降低；CYP11A1和3βHSD的表達(dá)水平在健康卵泡中較低，但隨著卵泡閉鎖程度的加深，兩者的表達(dá)水平在早期和晚期閉鎖卵泡中均顯著升高；CYP17A1和CYP19A3的表達(dá)水平在健康卵泡中較高，但隨著卵泡閉鎖程度的加深，兩者的表達(dá)水平在早期和晚期閉鎖卵泡中均顯著下降。

圖3 不同類型豬有腔卵泡中類固醇合成酶和

2.3 不同類型豬有腔卵泡中自噬和凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化

由圖4可知，自噬相關(guān)基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5和ATG7)mRNA的表達(dá)水平在健康卵泡中相對較低，但隨著卵泡閉鎖程度的加深，自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著升高，其中自噬標(biāo)志性分子LC3B的表達(dá)水平在早期和晚期閉鎖卵泡中的表達(dá)水平高于其他自噬標(biāo)志分子。從圖5可以看出，凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Bim)mRNA的表達(dá)水平在健康卵泡中相對較低，而在早期和晚期閉鎖卵泡中顯著升高；而Bcl-2與Bax相對表達(dá)量的比值則呈現(xiàn)出相反的趨勢。

圖4 不同類型豬有腔卵泡中自噬相關(guān)基因表達(dá)水平

圖5 不同類型豬有腔卵泡中凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

2.4 不同類型豬有腔卵泡中SMAD4和CART表達(dá)變化

如圖6所示，SMAD4 mRNA的表達(dá)水平在健康卵泡中較高，而在早期和晚期閉鎖的卵泡中表達(dá)量顯著下降；CARTmRNA的表達(dá)水平在健康卵泡中較低，而在早期和晚期閉鎖的卵泡中其表達(dá)水平顯著升高。

3 結(jié)論與討論

卵泡液中E2和P4的質(zhì)量濃度水平變化能夠表明卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的生理狀態(tài)，P4/E2與細(xì)胞內(nèi)核酶的活性呈現(xiàn)正相關(guān)[12-13]。眾多研究表明，利用兩者之間的比值能夠更加客觀地評價卵泡閉鎖的程度[14-15]。本研究結(jié)果表明，兩者之間的比值與自噬及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出相同的趨勢，利用兩者的比值可在一定程度上評判中等有腔卵泡的閉鎖程度。膽固醇是體內(nèi)各種類固醇激素合成的重要原料,它在體內(nèi)經(jīng)膽固醇側(cè)裂酶代謝后可轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮,而由膽固醇合成的孕烯醇酮是合成其類固醇激素如雌激素、孕激素等的前體物質(zhì)。研究表明,類固醇激素在有腔卵泡的生長和閉鎖過程中起著核心調(diào)控作用[6]。本研究中CYP11A1和3βHSD在健康卵泡中的表達(dá)量相對較低，而在早期和晚期閉鎖卵泡中呈現(xiàn)顯著升高趨勢，這與Sanne等[16]的研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)CYP11A1和3βHSD是孕酮合成的主要關(guān)鍵酶類。CYP17A1和CYP19A3在健康卵泡中表達(dá)較高，而在早期和晚期閉鎖卵泡中呈現(xiàn)下降趨勢，這與前人研究結(jié)果相吻合。先前研究表明，CYP17A1是合成雄激素的主要酶類，而CYP19A3可利用雄烯二酮或睪酮合成雌激素[17]。此外，F(xiàn)SHR和ERα的表達(dá)水平在健康卵泡中較高，而在早期和晚期閉鎖卵泡中呈現(xiàn)下降趨勢，這也說明了閉鎖卵泡中相關(guān)激素受體的表達(dá)水平與相關(guān)酶類的合成水平相一致，共同促使卵泡發(fā)生閉鎖。

SMAD4是哺乳動物中唯一的一種共介導(dǎo)型Smads蛋白,它在TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起非常關(guān)鍵的作用，其缺失會使該信號通路中斷，使細(xì)胞外界信號信息無法傳遞[18]。Guéripel等[19]研究表明，促性腺激素主要促使SMAD4表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)TGF-β/BMP通路的調(diào)控作用。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，干擾內(nèi)源性SMAD4可降低FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖和類固醇激素的生成。CART是一種神經(jīng)肽物質(zhì)，研究已證實，在一定濃度范圍內(nèi)其能阻止牛卵泡的正常發(fā)育，導(dǎo)致卵泡發(fā)育遲緩，是誘發(fā)卵泡閉鎖的一個重要因子[21]。Jones等[22]研究表明，CART能有效抑制牛卵泡顆粒細(xì)胞雌激素的分泌。本研究中，SMAD4在健康卵泡中的表達(dá)量顯著高于早期和晚期閉鎖卵泡，而CART在健康卵泡中的表達(dá)量則顯著低于早期和晚期閉鎖卵泡，這些差異說明SMAD4對卵泡的發(fā)育有促進(jìn)作用，而CART對豬有腔卵泡的發(fā)育有抑制作用，推測很可能是SMAD4促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的增殖和雌激素的分泌，而CART起到相反的作用。

細(xì)胞的死亡方式包括凋亡、自噬和壞死3種類型，其中Ⅰ型細(xì)胞程序性死亡為凋亡，自噬為Ⅱ型程序性死亡。自噬和凋亡共同參與調(diào)控有腔卵泡的發(fā)育和閉鎖，并且在卵泡中顆粒細(xì)胞是發(fā)生凋亡和自噬的主要細(xì)胞[23]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，與健康卵泡相比，自噬相關(guān)基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)在早期和晚期閉鎖卵泡中的表達(dá)量均顯著上升，與此同時凋亡相關(guān)基因(Caspase-3和Bim)的表達(dá)量在閉鎖卵泡中同樣呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢，并且Bcl-2/Bax在閉鎖卵泡中呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢，自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量與P4/E2呈現(xiàn)出相同的表達(dá)趨勢，這些結(jié)果表明，在卵泡閉鎖過程中生殖激素和自噬及凋亡相關(guān)基因共同參與調(diào)控早期和晚期卵泡的閉鎖。

綜上所述，卵泡的閉鎖是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到動物機(jī)體內(nèi)分泌和卵泡內(nèi)相關(guān)因子的多種調(diào)控機(jī)制干預(yù)。本研究通過分析不同類型卵泡中生殖激素的質(zhì)量濃度變化、相關(guān)激素合成酶的表達(dá)水平、自噬與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量以及卵泡內(nèi)重要調(diào)控基因的表達(dá)變化，為提高多胎動物排卵前卵泡發(fā)育數(shù)量和產(chǎn)仔數(shù)量提供了理論依據(jù)。

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Analysis of Gene Expression and Hormone Levels Related with Medium Follicular Development and Atresia during Pig Follicular Phase

ZHANG Jiaqing1,GAO Binwen1,WANG Xianwei2,MA Qiang1,GAO Yuan3, REN Qiaoling1,BAI Xianxiao1,XING Baosong1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002,China; 2.Henan Provincial Animal Husbandry General Station,Zhengzhou 450008,China; 3.Xinxian Animal Husbandry Bureau,Xinxian 465550,China)

The aim of this study was to analyze the changes of autophagy and apoptosis,intraovarian regulatory factors,steroid hormones and steroidogenic enzymes in antral follicle development and atresia during porcine follicular phase,so as to provide theoretical basis for increasing the preovulatory follicle numbers.Antral follicles about 3—5 mm in diameter were isolated from porcine ovaries in follicular phase and classified as three groups: healthy follicles,early atretic follicles and progressed atretic follicles.HE staining was used to observe the follicular morphological structure,and enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA)method was applied to examine the changes of estradiol(E2)and progesterone(P4)concentrations in follicular fluid.The relative expression levels of autophagy related genes (Becline，LC3B，ATG3，ATG5 andATG7),apoptosis related genes(Caspase-3，Bim，Bcl-2 andBax),steroidogenic enzyme genes(CYP11A1，3βHSD，CYP17A1 andCYP19A3),hormone receptor and intraovarian regulatory genes(FSHR，ERα，CARTandSMAD4)in different types of follicles were detected by real-time PCR method.The results showed that there were very few apoptotic cells and intact granulosa cell layer in healthy follicles,and the percentage of the apoptotic cells were remarkably increased in atretic follicles,especially in progressed atretic follicles.The ratio of P4 to E2 was significantly decreased in healthy follicles as compared to early atretic follicles and progressed atretic follicles.The relative expression levels of autophagy and apoptosis related genes were increased in early atretic follicles and progressed atretic follicles compared to healthy follicles.The mRNA levels ofCYP11A1 and 3βHSDwere enhanced in early atretic follicles and progressed atretic follicles compared with healthy follicles.The relative expression levels ofFSHRandERαin early atretic follicles and progressed atretic follicles were significantly lower than that of healthy follicles.The mRNA levels ofSMAD4 in healthy follicles were significantly higher than that of early atretic follicles and progressed atretic follicles,and the relative expression levels ofCARTshowed the reverse change trend.Apoptosis and autophagy were the main cause of follicular at resia,whereas steroidogenesis enzyme genes(CYP11A1 and 3βHSD) accelerated atretic progression by increasing progesterone levels.

swine; antral follicles； follicular development； follicular atresia

2016-05-20

河南省科技攻關(guān)項目(162102110036)

張家慶(1982-)，男，河北滄州人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究工作。 E-mail:zjq8650612@163.com

*通訊作者：邢寶松(1969-)，男，河南新密人,副研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究工作。E-mail：baosong@126.com

S814

A

1004-3268(2016)11-0110-06