曹亞兵，翟曉巧，介大委，范國強*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 泡桐研究所，河南 鄭州450002; 2.河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州450008)

周年溫度變化對泡桐叢枝病植原體分布和消長的影響

曹亞兵1，翟曉巧2，介大委1，范國強1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 泡桐研究所，河南 鄭州450002; 2.河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州450008)

為探討溫度變化對泡桐樹體內(nèi)叢枝病植原體分布和消長的影響，利用巢式PCR和直接PCR研究了植原體在泡桐不同器官內(nèi)的分布及相對含量的周年變化。結(jié)果表明，不同發(fā)病程度泡桐中叢枝病植原體的分布不同，發(fā)病程度相同泡桐不同器官內(nèi)植原體含量也存在一定差異。在中等發(fā)病程度的泡桐中，叢枝病植原體全年存在于枝條內(nèi)，并且其含量隨溫度升高逐漸升高，8月份達到最高，此后開始下降；葉片內(nèi)植原體含量隨溫度升高明顯增加，7月份含量最高，隨后減少，10月份降到最低；根部植原體含量隨溫度升高也相應增加，在9月份達到最高，之后開始降低，全年含量變化較小，且含量最高值較葉片和枝條中低。表明泡桐叢枝病植原體在寄主體內(nèi)的消長與溫度的周年變化關系緊密。

泡桐叢枝病植原體； PCR； 溫度； 消長

叢枝病是泡桐生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害最嚴重的傳染性病害，可導致泡桐幼樹死亡、大樹生長緩慢，極大限制了泡桐的種植[1-2]。植原體作為一類植物病原物，由于不能夠體外培養(yǎng)，其生物學特性研究進展緩慢，防治手段有限。自20世紀40年代以來，雖然在泡桐叢枝病病原的檢測方面已積累了不少技術(shù)和方法[3-7]，但對患病植株體內(nèi)植原體的分布特點和周年消長規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)研究[8-10]。有報道稱低溫可以減輕叢枝病癥狀[11-13]，但低溫對植原體濃度的影響仍不清楚。聚合酶鏈式反應(PCR)是目前應用比較廣泛和成熟的植原體檢測方法[14-20]。本研究以毛泡桐患叢枝病植株為試材，采用PCR方法探討溫度的周年變化與泡桐植原體在寄主體中分布及數(shù)量的關系，為科學開展泡桐叢枝病的藥物防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年 4月至2015年3月進行，以河南農(nóng)業(yè)大學鄭州林業(yè)試驗站樹齡為12 a的毛泡桐(Paulowniatomentosa)為試驗材料，包括3株新發(fā)病樹、3株中度發(fā)病樹和3株重度發(fā)病樹，以河南農(nóng)業(yè)大學泡桐研究所培養(yǎng)的健康毛泡桐組培苗為對照。試驗期間，每月20日左右分別采集適量泡桐樹的根、枝條、葉片及距離地面1.5 m處樹干韌皮部，休眠季采樣部位為枝條和根部以及主干韌皮部。采樣時，枝條、葉片等樣品從樹體不同主枝上分別采??；根樣品為地下20 cm處不同方向的側(cè)根，保證樣品能夠全面代表樹體的病原攜帶情況。

1.2 方法

1.2.1 直接PCR檢測 直接PCR采用植原體16S rDNA通用引物，序列分別為Primer1：5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′; Primer2：5′-GCGGTGTGTACAAACCCCCG-3′(由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反應體系25 μL，其中模板DNA 0.3～400 ng，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L) 0.25 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各 0.5 μL, 然后用雙蒸水補足。PCR擴增在PTC-200基因擴增儀上進行，程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，52 ℃ 退火1.5 min，72 ℃ 延伸2 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物2.5 μL，在1%瓊脂糖凝膠(含0.5% EB)中以80 V電泳1 h，觀察電泳結(jié)果[18-20]。不同樣品間的植原體含量差異用直接PCR擴增的方法檢測。將需要檢測的模板DNA濃度進行2倍梯度稀釋，經(jīng)直接PCR擴增確定不同樣品檢測到植原體所需的最少模板用量。以不同樣品檢測到植原體的最少模板用量的倒數(shù)作為參數(shù)，比較不同樣品之間的植原體含量差異。每個樣品重復檢測2次[11，21]。

1.2.2 巢式PCR檢測 采用巢式PCR檢測植原體在不同發(fā)病程度泡桐植株體內(nèi)的分布特點。植原體16S rDNA采用Nest-PCR進行2輪擴增，第1輪擴增引物序列為R16mF1：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′，R16mR1：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′；第2輪擴增引物序列為R16F2：5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′，R16R2：5′-CGGGGTTTGTACACACCGC-3′(由上海生工生物工程有限公司合成)。第1輪反應體系和基本條件同直接PCR檢測；第2輪PCR反應的體系中，模板DNA(第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍)1 μL，引物R16F2、R16R2 (10 μmol/L) 各0.5 μL, 其他成分同第1輪PCR，反應程序同上。待PCR程序結(jié)束后，取第2輪擴增產(chǎn)物2.5 μL，在1%瓊脂糖凝膠(含0.5% EB)上以80 V電泳1 h，觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 24.0進行月平均氣溫與植原體相對含量關系的公式擬合及相關性分析。其中，月平均氣溫數(shù)據(jù)由河南省氣象局提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 植原體在不同發(fā)病程度泡桐植株體內(nèi)的分布特點

2.1.1 輕度發(fā)病 從圖1可以看出，輕度發(fā)病程度泡桐植株體內(nèi)，除了叢枝病枝條和葉片含大量植原體外，同一主枝上鄰近叢枝病發(fā)病部位的健康枝條和葉片也有少量植原體的分布，而其他營養(yǎng)器官檢測結(jié)果呈陰性，表明植原體在寄主體內(nèi)未發(fā)生大范圍擴散。推測植原體在寄主體內(nèi)的移動規(guī)律是由發(fā)病部位先向鄰近的營養(yǎng)器官進行擴散，而不是先向根部擴散。

M．DNA Marker；1．對照；2．健葉；3．健枝；4．主干韌皮部；5．根；6．叢枝病葉；7．叢枝病枝；8．附近葉；9．附近枝

2.1.2 中度發(fā)病 檢測結(jié)果表明(圖2)，在中度患病的泡桐植株體內(nèi)，植原體的分布具有對應性的特點。表現(xiàn)為患叢枝病相同方向的健康枝條、葉片、根和主干韌皮部中可以檢測到植原體的存在，含量較叢枝病葉片和枝條偏低；而與發(fā)病部位不同方向的營養(yǎng)器官中，則沒有檢測到植原體的存在。說明泡桐叢枝病植原體縱向運輸能力強，而橫向運輸能力相對較弱，也可能是泡桐自身的物質(zhì)運輸特點主要是縱向運輸，抑制了植原體的橫向擴散。對應性的分布特點說明，植原體在中度發(fā)病程度的樹木體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生了很大范圍的擴散，但是因為其含量較低，未達到致病濃度，所在部位沒有產(chǎn)生叢枝病癥狀。

M.DNA Marker；1．對照；2．異側(cè)健葉；3．異側(cè)健枝；4．異側(cè)主干韌皮部；5．異側(cè)根；6．叢枝病葉；7．叢枝病枝；8．同側(cè)健葉；9．同側(cè)健枝；10．同側(cè)主干韌皮部；11．同側(cè)根

2.1.3 重度發(fā)病 重度發(fā)病程度植株上，叢枝病枝條大且生長旺盛，在樹體上廣泛分布。巢式PCR檢測結(jié)果表明(圖3)，所有采集的營養(yǎng)器官都含有植原體，植原體在樹體內(nèi)的分布呈現(xiàn)出普遍性。植原體的這種分布特點，可能是由于植原體的擴散，到達了原來發(fā)病程度較輕或中度發(fā)病程度的病樹上不含植原體的營養(yǎng)器官，并增殖生長致使叢枝病發(fā)生；也可能是由于傳毒昆蟲的傳播作用，加劇了植株的病情惡化。

M．DNA Marker；1．對照；2．叢枝病葉；3．叢枝病枝；4．健葉；5．健枝；6．主干韌皮部；7．根

2.2 植原體在中度發(fā)病程度泡桐植株體內(nèi)的周年消長規(guī)律

2.2.1 葉片 直接PCR檢測結(jié)果表明(圖4)，葉片中植原體的周年消長規(guī)律為：4月份泡桐枝條萌發(fā)時，葉片中植原體含量處于一個非常低的水平；5、6、7三個月份寄主的癥狀表現(xiàn)日益嚴重，植原體的含量逐月上升，7月達到最大；此后植原體含量下降，8—9月下降幅度較小，9—10月劇烈下降，至10月即將落葉時達到較低的水平。葉片中植原體含量(Y)與月平均氣溫(X)呈極顯著正相關，其指數(shù)函數(shù)關系為：Y=0.000 1e0.340X，r=0.943 (圖5)。通過將葉片中植原體的含量變化與葉片的生長周期對比可以發(fā)現(xiàn)，叢枝病葉片的生長決定著植原體的含量，當葉片進入生長旺季，植原體含量急劇增加，當葉片的生長進入衰退期時，植原體的含量也隨之下降。

圖4 泡桐叢枝病植原體相對含量的周年變化

圖5 泡桐葉片植原體相對含量與月平均氣溫的關系

2.2.2 枝條 從圖4可以看出，4、5月份隨溫度回升，泡桐枝條中植原體含量逐漸增加；7—8月植原體含量增加很快，8月份達到最高，此時癥狀也最嚴重；隨秋季來臨植原體含量下降，8—9月是植原體含量下降最快的階段，之后植原體含量一直呈下降趨勢，直到次年1—3月病枝中植原體含量降到一年中的最低值。枝條中植原體含量(Y)與月平均氣溫(X)也呈極顯著正相關，其指數(shù)函數(shù)關系為:Y=0.01e0.141X，r=0.930 (圖6)。

2.2.3 根 從圖4可以看出，12月份到次年的2月份，泡桐根中植原體相對含量處于全年最低水平，到了3月份以后，植原體含量開始緩慢增加，9月份達到全年最高值，隨后含量明顯下降，10月份以后趨于平穩(wěn)。根中植原體含量(Y)與月平均氣溫(X)的函數(shù)關系為：Y=0.014e0.091X，r=0.839，同樣二者存在顯著的相關性(圖7)。根據(jù)r大小可知，根中植原體含量與月平均氣溫的相關性小于枝條和葉片，表明植原體在泡桐根部對溫度的敏感性較在莖葉中低。植原體沒有在冬季產(chǎn)生由枝條大批轉(zhuǎn)移到根部躲避低溫的現(xiàn)象。

圖6 泡桐枝條植原體相對含量與月平均氣溫的關系

圖7 泡桐根部植原體相對含量與月平均氣溫的關系

3 結(jié)論與討論

泡桐叢枝病植原體在病株體內(nèi)含量的周年變化存在一定的規(guī)律性，并與泡桐叢枝病外部癥狀表現(xiàn)的周期變化相吻合。在春季的生長初期，植原體在寄主各部位含量都很低；隨著寄主的生長，植原體含量越來越高，叢枝病癥狀也逐漸明顯；至7—8月病狀最嚴重時，植原體在寄主葉和枝條中的含量也達到最高。此外，寒冷季節(jié)僅在泡桐病株的發(fā)病枝條和根中檢測到植原體，而其他部位則檢測不到植原體的存在，這可能與低溫抑制了寄主的生理生化活動，進而影響植原體的增殖和生存有關。

從泡桐植原體周年含量變化來看，植原體可以在叢枝病枝條中成功越冬。這與桑樹植原體不能在枝條中越冬的結(jié)果不同[11-12]。泡桐植原體與桑樹植原體屬同一組的不同亞組，與棗樹植原體則不屬于同一組[9-10]，說明3種植原體存在一定的遺傳差異。至于越冬能力的差異是否與植原體種類不同、地域差別、不同樹種對植原體的抗性不同有關，有待進一步研究證明。

泡桐植原體的周年消長規(guī)律可直接為叢枝病治療時期的確定提供理論依據(jù)。根據(jù)植原體在患病植株中的分布情況，可以選擇合適的時間對其進行物理和藥物治療，使每一項防治工作都能做到有針對性，對植原體分布較為集中的營養(yǎng)器官及位置進行有效地治療和處理，避免人力、物力不必要的浪費。

[1] 蔣建平.泡桐栽培學[M].北京:中國林業(yè)出版社,1990.

[2] 卓瑪措.泡桐叢枝病的發(fā)病規(guī)律及防治措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(11):156.

[3] 金開璇,田國忠,汪躍.組織化學技術(shù)快速檢測泡桐叢枝病研究[J].植物病理學報,1989(19):185-188.

[4] 劉仲健,羅煥亮,張景寧.植原體病理學[M].北京:中國林業(yè)出版社,1999.

[5] 王秀伶,劉孟軍,劉麗娟.熒光顯微技術(shù)在棗瘋病病原鑒定中的應用[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,1999,22(4):46-49.

[6] 朱澄,徐麗云,金開璇.用DAPI熒光顯微技術(shù)檢測泡桐叢枝病[J].植物學報,1991,33(7):495-499.

[7] 蔡紅,李小林,孔寶華,等.黃槐叢枝病植原體的檢測及鑒定[J].植物病理學報,2005,35(1):19-23.

[8] 趙艷琴,武海龍,張麗娟,等.冬季桃黃花植原體在樹體內(nèi)分布消長動態(tài)的研究[J].內(nèi)蒙古民族大學學報(自然科學版),2012,27(3):293-296.

[9] 趙錦,劉孟軍,周俊義,等.棗瘋植原體的分布特點及周年消長規(guī)律[J]．林業(yè)科學,2006,42(8):144-147.

[10] 趙錦.棗瘋病病原分布消長規(guī)律及其病害生理研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2003:26-28.

[11] 戴群,劉秉勝,何放亭,等.溫度周年變化與桑樹植原體消長的關系[J].林業(yè)科學,1998,34(5):74-78.

[12] 劉秉勝,戴群.桑樹植原體含量的周年變化及其對寄主激素水平的影響[J].山東大學學報(自然科學版),1999,34(1):98-102.

[13] 張錫津,田國忠,黃欽才.溫度處理和莖尖培養(yǎng)結(jié)合脫除泡桐叢枝病類菌原體(MLO)[J].林業(yè)科學,1994,30(1):34-38.

[14] 安鳳秋,吳云鋒,顧沛雯.巢式PCR(Nested-PCR)在植原體檢測中的應用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學,2008,54(3):50-52.

[15] 鄧兆群,胡勤學,林木蘭,等.用PCR和RFLP方法分析支原體與植原體的同源性[J].生物多樣性,2000,8(1):103-105.

[16] Lee I M,Hammond R W,Davis R E,etal.Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasma like organisms[J].Phytopathology,1993,83:834-842.

[17] 李婷婷,史夢蝶,張寧,等.許昌泡桐叢枝病植原體的分子鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2013,42(2):78-82.

[18] 邱并生，李橫虹，史春霖，等.從我國20種感病植物中擴增植原體16S rDNA片段及其RFLP分析[J].林業(yè)科學,1998,34(6):67-74.

[19] 單衛(wèi)星,李振層.PCR技術(shù)在植物病原物和植物抗病研究中的應用[J].植物生理學通訊,1995,31(2):137-143.

[20] 宋卡魏,王星云,張榮意.PCR相關技術(shù)在植物病原細菌檢測和鑒定中的應用[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè), 2006(4):45-47.[21] Zhang C L，Lin M L，Hu Q X，etal.Year round distribution of paulownia witches’ broom phytoplasma monitored by DNA hybridization analysis[C].The Fifth International Workshop on Phytoplasms,1996,28:25-28.

Impact of Annual Temperature Variation on Distribution and Year-round Concentration Variation of Paulownia Witches’ Broom Phytoplasma

CAO Yabing1,ZHAI Xiaoqiao2,JIE Dawei1,FAN Guoqiang1*

(1.Institute of Paulownia,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Henan Academy of Forestry,Zhengzhou 450008,China)

To explore the effect of temperature variation on the distribution of witches’ broom phytoplasma and its annual changes of relative content in paulownia,direct-RCR and nest-PCR were used to research the seasonal variation of the phytoplasma content and distribution.Our result showed that the distribution of phytoplasma in varying degree of diseased paulownia was different,meanwhile the concentration in different organs of the same plant was not the same.In the moderately diseased plant,phytoplasma survived all the year round in branches and increased gradually with the rising of temperature.The highest concentration of phytoplasma appeared in August,and subsequently,the concentration of phytoplasma gradually decreased.The similar situation appeared in leaves,except that the concentration of phytoplasma reached the maximum in July and the minimum in October.In root,the phytoplasma concentration was lower and changed less than in leaves and branches,which reached the maximum in September,and then reduced.In all,the relationship between the variation of phytoplasma concentration in paulownia and annual changes of temperature was very close.

paulownia witches’ broom phytoplasma； PCR； temperature; variation

2016-04-20

國家自然科學基金項目(30271082,30571496); 高等學校博士學科點專項科研基金項目(20050466003)

曹亞兵(1989-)，女，河南禹州人，在讀碩士研究生，研究方向：林木抗性機制。E-mail:cyb201406@163.com

*通訊作者：范國強(1964-)，男，河南禹州人，教授，主要從事林木抗性機制研究。E-mail:zlxx64@163.com

S763.1

A

1004-3268(2016)10-0085-05