魏 麗

(山東英才學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104)

茶樹中奎尼酸/莽草酸-羥肉桂?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆及功能研究

魏 麗

(山東英才學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104)

從茶樹中分離到1個(gè)綠原酸生物合成相關(guān)基因，命名為CsHCT。該基因編碼1個(gè)430個(gè)氨基酸的多肽，推測分子質(zhì)量約為48.6 ku。蛋白質(zhì)序列比對(duì)表明，CsHCT含有?；D(zhuǎn)移酶的保守域HXXXD和DFGWG，與其他物種HCT的同源性在58%～82%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CsHCT與咖啡中的HCT同源性最高，連同其他植物HCT形成一個(gè)獨(dú)立的組群。通過大腸桿菌異源表達(dá)，純化獲得了CsHCT蛋白，并進(jìn)行了催化活性研究。結(jié)果表明，重組的CsHCT能有效催化奎尼酸和莽草酸與香豆酰輔酶A的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，分別生成香豆?？崴岷拖愣辊ＣР菟?。CsHCT不能催化奎尼酸和咖啡酰輔酶A生成綠原酸。

茶樹； 綠原酸； 奎尼酸/莽草酸-羥肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶

綠原酸是重要的抗氧化劑，廣泛存在于金銀花、蘋果、番茄、馬鈴薯、茄子中[1-4]。除了對(duì)人類健康有益外，綠原酸也是非常重要的植物代謝產(chǎn)物[5]。綠原酸是G型和S型木質(zhì)素的合成前體，并參與植物細(xì)胞對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[6]。由于綠原酸的重要作用，近些年對(duì)其生物合成的研究越來越多。該合成途徑的前3步已經(jīng)明確[7-9]。但接下來的幾個(gè)步驟有待證實(shí)。其中有2個(gè)?；D(zhuǎn)移酶可能與綠原酸的合成有關(guān)，一個(gè)為奎尼酸/莽草酸-羥肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶(HCT)，另一個(gè)為奎尼酸羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶(HQT)。HCT已從煙草中獲得，對(duì)其活性分析表明，該蛋白質(zhì)能夠催化莽草酸或奎尼酸與香豆酸和咖啡酸成酯，對(duì)莽草酸的親和力更高[10]。此外，還發(fā)現(xiàn)煙草HCT能催化綠原酸水解，形成咖啡酰輔酶A和奎寧酸。最近的功能分析表明，擬南芥中HCT基因沉默，導(dǎo)致木質(zhì)素合成受阻，植株矮化，表明HCT是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[11]。HQT基因已先后在煙草和番茄中被克隆[11]。研究發(fā)現(xiàn)，重組的煙草HQT能夠催化奎尼酸到綠原酸的可逆反應(yīng)。番茄中過表達(dá)HQT基因，葉片中綠原酸含量增加了85%，而HQT沉默引起葉片中的綠原酸含量減少了98%[11]。

茶樹是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其抗逆性是育種的重要目標(biāo)之一。研究表明，綠原酸對(duì)茶蚜及鱗翅目害蟲有一定的毒性，幼蟲取食后，食欲大減，發(fā)育遲緩，甚至停止生長，很少正常產(chǎn)卵。在受到螨類危害時(shí)，一些茶樹品種體內(nèi)的綠原酸含量迅速增加。所以，茶樹體內(nèi)綠原酸含量的多少可作為判斷茶樹抗蟲性強(qiáng)弱的重要依據(jù)之一。目前，關(guān)于茶樹中綠原酸生物合成的研究未見報(bào)道。為揭示茶樹中綠原酸的生物合成，本研究首次克隆了茶樹HCT基因(CsHCT)，并通過體外酶促反應(yīng)，分析其催化特性，以期為茶樹抗蟲機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試茶樹品種為竹山1號(hào)1年生盆栽茶苗，置于日光溫室，生長條件為溫度(25±2)℃、濕度70%±5%。盆栽的基質(zhì)成分和比例為蛭石∶珍珠巖∶泥碳=1∶1∶4。

1.2CsHCT基因的分離

使用Autolabtech 植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)從茶樹葉片中提取總RNA。之后使用ImProm-IITM反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega WI，美國) 以及反轉(zhuǎn)錄特異引物RRP：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAG-CTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。簡并引物的設(shè)計(jì)參照“保守-簡并雜合寡核苷酸引物”(CODEHOP)策略，設(shè)計(jì)引物CODF 5′-GTYGGHAACCTCTACGAC-3′和 CODR 5′-RTCWCKVGCNACHGCCCA-3′，其中R代表A或G，Y代表C或T，H代表A或C或T。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CsHCT基因cDNA的核心片段，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 90 s ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。全長cDNA序列通過cDNA末端快速克隆技術(shù)(RACE)獲得。進(jìn)行3′-RACE的2個(gè)特異引物根據(jù)已經(jīng)獲得的核心片段序列設(shè)計(jì)如下，HCT3-1：5′-AAATAGATCTTGAAAGCACGAG-3′ ;HCT3-2：5′-GATAAAGCAGGAAGGACACACC-3′。第1輪PCR擴(kuò)增使用HCT3-1和RRP引物組合，第2輪PCR擴(kuò)增使用HCT3-2和RRP引物組合。具體的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。cDNA 5′末端的擴(kuò)增使用5′-RACE試劑盒 (Invitrogen, CA, 美國)，2個(gè)用于5′-RACE擴(kuò)增的特異引物依照已經(jīng)獲得的核心片斷進(jìn)行設(shè)計(jì)：5′-GTTCGCGATATTCCTCTG-3′ (HCT5-1)和5′-TTGTTGATGCTACGACCG-3′ (HCT5-2)。PCR擴(kuò)增條件與3′-RACE相同。

1.3 異源表達(dá)和蛋白質(zhì)純化

CsHCTcDNA的ORF使用含有特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的N-末端和C-末端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正義引物為：5′-TATAGAATTCATGGCATTCGCTC-TCCTC-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；反義引物為：5′-TATACTCGAGCTAGTAATCCACTGGGACACG-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片段經(jīng)過EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后，連接到經(jīng)過相同酶切的原核表達(dá)載體pET-30a(+) (Novagen, Darmstadt, 德國)上，組氨酸六聚體標(biāo)簽構(gòu)筑在重組蛋白的C-末端上。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3) (天根生化科技有限公司，北京), 挑取單克隆于37 ℃、200 mL LB培養(yǎng)基(含卡那霉素50 mg/L、氯霉素34 mg/L)中振蕩培養(yǎng)。待OD600為0.6～0.8時(shí)加入1 mmol/L IPTG，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，用3 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液 (pH值7.5)重懸，冰上超聲破碎10 min。冰上破碎的菌體勻漿于4 ℃ 10 000×g下離心10 min。上清通過Ni2+-瓊脂糖柱(Novagen)，用含有0.5 mol/L NaCl和40 mmol/L咪唑的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液洗滌Ni2+-瓊脂糖柱3次后，用含有400 mmol/L 咪唑的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液洗脫重組目標(biāo)蛋白。為了長期保持重組蛋白活性，洗脫緩沖液通過PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,瑞典)，用含10%(V/V)甘油的0.1 mol/L Tris-HCl (pH值7.5)置換緩沖液重新洗脫，洗脫的重組蛋白保存于-80 ℃。重組蛋白的純化效率用SDS-PAGE檢測。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 體外酶促反應(yīng)及產(chǎn)物分析

20 μL體外酶促反應(yīng)體系中含有100 mmol/L 磷酸buffer (pH值7.5)、1 mmol/L二硫蘇糖醇、1 μg 重組HCT蛋白、0.1～5 mmol/L的不同底物(香豆酰輔酶A、咖啡酰輔酶A、奎尼酸和莽草酸) 。反應(yīng)自加入酶蛋白開始計(jì)時(shí)，30 ℃ 條件下反應(yīng)30 min，加入20 μL 乙腈/HCl (99∶1)終止反應(yīng)。

HPLC檢測條件：C18 柱 (LiChroCART 125-4, Merck), 流動(dòng)相A:90% H2O、9.9% CH3CN、0.1% HCOOH；B：80% CH3CN、19.9% H2O、0.1% CH3COOH。流速為0.6 mL/min，使用梯度條件為30% B 3 min、30%～70% B 27 min、70%～80% B 2 min、80%～95% B 3 min、95% B 5 min，檢測波長320 nm。用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)各種化合物進(jìn)行定量。

1.5 動(dòng)力學(xué)分析

本研究重組蛋白動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定是在一個(gè)底物濃度飽和的情況下，用另一個(gè)底物介于其Km的0.2～6.0的5個(gè)濃度值進(jìn)行計(jì)算獲得的。試驗(yàn)使用上述標(biāo)準(zhǔn)的250 μL 0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。各參數(shù)的測定在其主產(chǎn)物的最適反應(yīng)溫度和最適pH值條件下完成。Km和Kcat值由Lineweaver-Burke曲線結(jié)果得出。

2 結(jié)果與分析

2.1CsHCTcDNA的分離

利用簡并引物，以茶樹葉片cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得了1個(gè) 750 bp的中間序列(圖1)。通過RACE方法，克隆了該基因的全長cDNA序列，命名為CsHCT。該cDNA全長1 417 bp，其中編碼區(qū)為1 293 bp，推測其編碼1個(gè)430個(gè)氨基酸的多肽，分子質(zhì)量約為48.6 ku。蛋白質(zhì)序列比對(duì)表明，CsHCT與其他物種HCT的同源性在58%—82%，含有?；D(zhuǎn)移酶的保守域HXXXD(氨基酸153—157)和DFGWG(氨基酸377—381)(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3)表明，CsHCT與咖啡(Cof.canephoraL.)中的HCT (ABO77957)聚合為1個(gè)分支，連同其他植物HCT形成1個(gè)獨(dú)立的組群；另1個(gè)組群則由典型的HQT構(gòu)成；來自于朝鮮薊(CynaracardunculusL.)的HQT(ACF37072)形成1個(gè)獨(dú)立的分支。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.PCR產(chǎn)物

圖2 茶樹CsHCT與其他植物HCT的氨基酸序列比對(duì)分析

圖3 茶樹CsHCT的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 CsHCT的功能鑒定

為研究CsHCT的酶學(xué)特性，構(gòu)建了CsHCT的pET-30a原核表達(dá)載體(圖4A)，經(jīng)PCR(圖4B)及酶切驗(yàn)證(圖4C)后，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，C-末端添加組氨酸標(biāo)簽的重組CsHCT在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化的重組蛋白在50 ku的位置上形成1個(gè)單一條帶 (圖4D)。

A.原核表達(dá)載體構(gòu)建；B.表達(dá)載體PCR檢測；C.表達(dá)載體酶切驗(yàn)證；D.CsHCT蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化，

取純化的重組茶樹CsHCT蛋白，加入到體外催化反應(yīng)體系中。酶促產(chǎn)物的定性及定量分析結(jié)果顯示，重組的CsHCT能有效催化奎尼酸和莽草酸與香豆酰輔酶A的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，分別生成香豆?？崴岷拖愣辊ＣР菟?圖5)，而對(duì)照(反應(yīng)體系中不含CsHCT)沒有反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)。CsHCT不能催化奎尼酸和咖啡酰輔酶A生成綠原酸。

2.3 CsHCT酶學(xué)特性分析

分別以咖啡酰輔酶A和香豆酰輔酶A為?；w，以奎尼酸和莽草酸為?；荏w，進(jìn)行了CsHCT的酶動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明，CsHCT對(duì)莽草酸的親和力更高(表1)。在香豆酰輔酶A飽和時(shí)，CsHCT對(duì)莽草酸的親和力[Km=(83±37)μmol/L]約是奎尼酸[Km=(239±41)μmol/L]的3倍。

A.以奎尼酸和香豆酰輔酶A為底物；B.以莽草酸和香豆酰輔酶A為底物

表1 CsHCT的酶動(dòng)力學(xué)分析

注：NA表示反應(yīng)不能發(fā)生。

3 結(jié)論與討論

本研究從茶樹葉片中分離到1個(gè)?；D(zhuǎn)移酶基因CsHCT，其編碼1個(gè)430個(gè)氨基酸的多肽，推測的分子質(zhì)量約為48.6 ku。該蛋白含有?；D(zhuǎn)移酶家族的2個(gè)保守域HXXXD(氨基酸153—157)和DFGWG(氨基酸377—381)，與咖啡中的1個(gè)HCT蛋白同源性最高，相似度82%。體外酶促反應(yīng)表明，CsHCT能有效催化奎尼酸和莽草酸與香豆酰輔酶A的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，分別生成香豆?？崴岷拖愣辊ＣР菟?，但不能催化奎尼酸和咖啡酰輔酶A生成綠原酸。

關(guān)于綠原酸的生物合成途徑，目前認(rèn)為可能有3種：(1)以咖啡酰-葡萄糖苷作為活性中間體合成綠原酸；(2)首先由?；D(zhuǎn)移酶(HQT或HCT)催化奎尼酸與香豆酰輔酶A合成香豆?？崴?，進(jìn)而在香豆酸-3′-羥化酶作用下生成綠原酸；(3)?；D(zhuǎn)移酶HCT催化莽草酸與香豆酰輔酶A合成香豆酰莽草酸，進(jìn)而在香豆酸-3′-羥化酶作用下生成咖啡酰莽草酸，然后經(jīng)酰基轉(zhuǎn)移酶HCT催化獲得咖啡酰輔酶A，最后與奎尼酸合成綠原酸。第1條途徑僅在馬鈴薯中獲得證實(shí)。Villegas等[12]從馬鈴薯中純化到1個(gè)羥基肉桂酰D-葡萄糖奎尼酸?；D(zhuǎn)移酶，該酶能夠催化咖啡酰D-葡萄糖與奎尼酸生成綠原酸。途徑2和途徑3廣泛存在于高等植物中，

是研究最多的合成途徑，其主要區(qū)別在于香豆酰輔酶A發(fā)生羥化的方式不同。

植物中酰基轉(zhuǎn)移酶HQT和HCT的不同催化特性，決定了該植物中綠原酸的合成方式。番茄中HCT對(duì)莽草酸的親和力遠(yuǎn)高于奎尼酸，通過在番茄中抑制HQT基因表達(dá)，使綠原酸含量降低了98%，說明番茄中綠原酸的生物合成依賴于HQT。擬南芥中已報(bào)道的HCT不能催化奎尼酸為受體的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，因此在擬南芥中并沒有檢測到綠原酸。擬南芥的hct突變體表現(xiàn)出木質(zhì)素合成障礙，說明HCT主要參與木質(zhì)素合成途徑。而Hoffmann等[10]在煙草中分離到的1個(gè)HCT蛋白，能分別催化奎尼酸和莽草酸與香豆酰輔酶A或咖啡酰輔酶A的反應(yīng)，推測其可能參與了2條不同的綠原酸合成途徑。Comino等[13]在大葉菜薊中也發(fā)現(xiàn)了類似的HCT蛋白。以上研究表明，不同物種的HCT對(duì)底物的專一性差異較大。

本研究中，CsHCT不能以咖啡酰輔酶A為底物，只能催化香豆酰酯的生成。推測CsHCT可能參與了綠原酸的生物合成，其較高的催化活性促進(jìn)了茶樹中綠原酸的積累。為進(jìn)一步研究CsHCT在茶樹綠原酸合成中的作用，今后將分別構(gòu)建其過表達(dá)和RNAi載體，轉(zhuǎn)化茶樹，探討基因表達(dá)與綠原酸積累的關(guān)系。

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Cloning and Function Analysis of Hydroxycinnamoyl-CoA Quinate/Shikimate Hydroxycinnamoyl Transferase Gene inCamelliasinensis

WEI Li

(Shandong Yingcai University,Ji’nan 250104,China)

A hydroxycinnamoyl-CoA quinate/shikimate hydroxycinnamoyl transferase cDNA(CsHCT) was cloned fromCamelliasinensis.CsHCTencoded a protein of 430 amino acids,which molecular weight was speculated 48.6 ku.Sequencing results showed CsHCT contained two conserved acyltransferase domain HXXXD and DFGWG,and the homology between CsHCT and other plants HCTs ranged from 58%—82%.Phylogenetic analysis showed that the homology between CsHCT and HCT from coffee was the highest,composing a group with other plants HCTs.CsHCT protein was purified after heterologous expression inE.coli.Catalytic activity analysis showed that the recombinant CsHCT was capable of catalyzing quinic acid and shikimic acid to generate coumaroyl quinic and coumaroy shikimate;but CsHCT could not catalyze quinic acid and caffeoyl-CoA to generate CGA.

Camelliasinensis； chlorogenic acid； hydroxycinnamoyl-CoA quinate/shikimate hydroxycinnamoyl transferase

2016-04-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200226)

魏 麗(1980-)，女，山東菏澤人，副教授，碩士，主要從事抗性生理研究。E-mail:05300532@163.com

S722.3+6

A

1004-3268(2016)10-0035-06