翟蓓蓓，閆志宇，李術(shù)娜，劉 利，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

乙草胺降解菌株枯草芽孢桿菌L3產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化

翟蓓蓓，閆志宇，李術(shù)娜*，劉 利，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

為了對(duì)乙草胺降解菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) L3的產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)酵液中芽孢形成率與總生物量為檢測(cè)指標(biāo)，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株L3芽孢形成的影響，然后利用2個(gè)L16(43)正交試驗(yàn)分別得到菌株L3產(chǎn)芽孢的最佳培養(yǎng)基組合及最優(yōu)發(fā)酵條件。結(jié)果表明，菌株L3產(chǎn)芽孢的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：1%乳糖、3%玉米漿和0.1%NaH2PO4·2H2O；最優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基起始pH值7.5、種齡20 h、裝液量30 mL(250 mL容器)。優(yōu)化后，該菌株的芽孢形成率可達(dá)97.1%，總生物量達(dá)6.5×109cfu/mL。

乙草胺； 降解菌； 枯草芽孢桿菌； 芽孢形成率； 條件優(yōu)化； 土壤修復(fù)

乙草胺(acetochlor)屬于廣譜、高效的內(nèi)吸性酰胺類選擇性芽前土壤處理除草劑[1]，自1982 年在我國(guó)研制成功并投入使用，便成為我國(guó)生產(chǎn)量和用量最大的三大除草劑之一[2-3]。近年來(lái)，對(duì)乙草胺大量及不合理的使用，使土壤中的乙草胺含量已超出環(huán)境的自凈能力，造成乙草胺的逐年積累和殘留[4]；而乙草胺屬于生物難降解的有機(jī)物[5]，其遷移性很強(qiáng)[2]，具有潛在的致癌性，已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局定為 B-2 類致癌物[6]，土壤中的乙草胺殘留可能對(duì)地表水和地下水造成污染，進(jìn)而危害到生態(tài)環(huán)境和人體及其他生物的健康。因此，消除土壤環(huán)境中的乙草胺日漸成為人們廣泛關(guān)注并迫切需要解決的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。

Chesters等[7]研究表明，乙草胺、甲草胺和丁草胺等酰胺類除草劑在環(huán)境中的消失主要是由于微生物的降解所致，因此利用微生物降解土壤中殘留的乙草胺成為解除乙草胺潛在威脅并修復(fù)受損土壤的主要手段。但目前對(duì)乙草胺微生物降解的研究報(bào)道較少，主要集中在降解菌株的篩選和降解特性的研究上[5,8-13]，降解菌株的種類還比較單一，各自的降解率參差有別，對(duì)于降解效果明顯的菌株，關(guān)于其實(shí)際應(yīng)用的研究也鮮有報(bào)道。筆者認(rèn)為，污染土壤的微生物修復(fù)方法的實(shí)施，關(guān)鍵在于降解微生物菌劑的制備及其在土壤中降解功能的充分發(fā)揮，而菌劑的生產(chǎn)工藝、活性穩(wěn)定期及保存期、對(duì)土壤的適應(yīng)性等都會(huì)影響其實(shí)際應(yīng)用效果，也正因此，已篩選得到的降解菌未能發(fā)揮作用，而這些影響因素也更應(yīng)該被深入研究。

筆者在前期工作中篩得1株乙草胺降解菌株L3，經(jīng)送檢鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，初步測(cè)定其48 h內(nèi)對(duì)乙草胺的降解率可達(dá)52%。乙草胺降解菌株對(duì)土壤乙草胺的降解效果與其在土壤中的定殖與適應(yīng)能力息息相關(guān)，而芽孢桿菌所產(chǎn)生的芽孢抗逆性強(qiáng)、易保藏、復(fù)活率高[14-15]，是其抵抗高溫高壓和酸堿等不良環(huán)境的主要形式，芽孢因而也成為制備微生物制劑的理想存在形式[15]，所以在乙草胺降解菌株的實(shí)際應(yīng)用中，芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)顯而易見。目前僅有周建嬌等[12]獲得幾株乙草胺的芽孢桿菌屬降解菌，且其72 h內(nèi)的降解率僅為11.16%～34.25%，由此可見枯草芽孢桿菌L3具有很大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。鑒于此，對(duì)乙草胺降解菌株L3的產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高其芽孢產(chǎn)量，為其進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 乙草胺降解菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)L3菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[16]。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 1%、蛋白胨 1%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%，pH 值7.2～7.4。121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 2%、蛋白胨 2%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、CaCl2·2H2O 0.02%、MgSO4·7H2O 0.05%，pH值7.2～7.4。121 ℃滅菌20 min。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌株種子培養(yǎng) 在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水從活化的菌種斜面上刮下菌苔，接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.2 發(fā)酵單因素試驗(yàn) 配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，單因素改變碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，以確定最佳培養(yǎng)基組分。在超凈臺(tái)中，將菌株種子液以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)酵正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，按正交試驗(yàn)表L16(43)設(shè)計(jì)3因素4水平試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基組分的用量進(jìn)行優(yōu)化；并對(duì)菌株L3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。其中培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中，碳源和氮源用量均設(shè)計(jì)為0.5%、1%、2%、3%，無(wú)機(jī)鹽用量設(shè)計(jì)為0.01%、0.05%、0.1%、0.3%；發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)中，培養(yǎng)基起始pH值設(shè)計(jì)為6.5、7.0、7.5、8.0，種齡設(shè)計(jì)為14、18、20、24 h，裝液量設(shè)為30、50、100、125 mL。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 確定菌株L3培養(yǎng)基組分的最適用量和最佳發(fā)酵條件后，對(duì)菌株L3優(yōu)化后的總生物量和芽孢形成率進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 測(cè)定方法 總生物量即活菌總數(shù)的測(cè)定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[17]；芽孢計(jì)數(shù)是將菌液80 ℃水浴10 min后稀釋平板計(jì)數(shù)[18]，芽孢形成率=芽孢數(shù)量/活菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)L3芽孢形成率的影響 分別以2%的蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖、葡萄糖、甘露醇作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，其他成分不變，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，在48、60、72 h分別取樣觀察芽孢生成情況，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，以乳糖和甘露醇為碳源時(shí)芽孢形成率較高，在72 h時(shí)分別可達(dá)到86.9%和89.4%，以甘露醇為最優(yōu)，但考慮到經(jīng)濟(jì)成本問(wèn)題，選用價(jià)格較低的乳糖作為最佳碳源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 不同碳源對(duì)L3芽孢形成率的影響

2.1.2 不同氮源對(duì)L3芽孢形成率的影響 分別以2%的胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、酪蛋白、玉米漿、黃豆餅粉、蛋白胨作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基氮源，其他成分不變，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，分別在48、60、72 h取樣觀察芽孢生成情況，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，以胰蛋白胨和玉米漿為氮源時(shí)芽孢形成率較高，培養(yǎng)72 h時(shí)，分別達(dá)到94.9%和87.8%，以胰蛋白胨為最優(yōu)，同樣考慮到經(jīng)濟(jì)成本問(wèn)題，選用價(jià)格較低的玉米漿作為最佳氮源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 不同氮源對(duì)L3芽孢形成率的影響

2.1.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)L3芽孢形成率的影響 分別以0.05% ZnCl2、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4·2H2O作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)60 h，在36、48、60 h分別取樣觀察芽孢生成情況，結(jié)果記錄如圖3。從圖3可以看出，以CaCl2·2H2O和NaH2PO4·2H2O為無(wú)機(jī)鹽時(shí)芽孢形成率較高，培養(yǎng)60 h時(shí)，分別可達(dá)到87.2%和87.8%，以NaH2PO4·2H2O為最優(yōu)，故選用其作為最佳無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)L3芽孢形成率的影響

2.2 發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加不同量的最佳碳源(A)、氮源(B)和無(wú)機(jī)鹽(C)配制培養(yǎng)基，接種菌株L3后，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取樣觀察不同培養(yǎng)基組成對(duì)L3芽孢生成的影響，結(jié)果見表1。對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，各因素極差的大小為RA>RB>RC，即培養(yǎng)基中影響芽孢形成率的各因素主次為：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，其中以碳源最為顯著，氮源和無(wú)機(jī)鹽相差不多，影響較小。正交試驗(yàn)分析最優(yōu)組合是A3B1C3，即第9組，但是在正交試驗(yàn)表中此組合芽孢形成率并不高，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。選最優(yōu)組合與正交設(shè)計(jì)表中的較優(yōu)組合即第1組、第8組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，第1組芽孢形成率為86.3%，最優(yōu)組合芽孢形成率為89.2%，而第8組芽孢形成率為93.3%，因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：1%乳糖、3%玉米漿和0.1% NaH2PO4·2H2O。

表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)分析

續(xù)表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)分析

注：k代表平均值，下同。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 以發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組成結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，考察起始pH值、種齡、裝液量對(duì)L3芽孢形成率的影響，搖床30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，取樣觀察芽孢生成情況，結(jié)果見表2。由表2可知，pH值和種齡對(duì)L3的芽孢形成率影響均很大，而裝液量對(duì)其影響較??；A3B3C1也即第11組為最優(yōu)組合，芽孢形成率可達(dá)97.1%。因此，最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基起始pH值7.5、種齡20 h、裝液量30 mL(250 mL容器)。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)最優(yōu)條件下的芽孢形成率和總生物量進(jìn)行測(cè)定，最終芽孢形成率達(dá)97.1%，總生物量達(dá)6.5×109cfu/mL。通過(guò)比較可知，發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后L3的芽孢形成率得到了進(jìn)一步的提高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)確定了枯草芽孢桿菌L3的最優(yōu)培養(yǎng)基組成：碳源為1%乳糖，氮源為3%玉米漿，無(wú)機(jī)鹽為0.1% NaH2PO4·2H2O；最優(yōu)發(fā)酵條件：培養(yǎng)基起始pH值為7.5，種齡為20 h，裝液量為30 mL(250 mL容器)。此條件下芽孢形成率可達(dá)97.1%，芽孢產(chǎn)量可達(dá)6.5×109cfu/mL。研究結(jié)果為乙草胺降解菌劑的制備奠定了科學(xué)基礎(chǔ)，推進(jìn)了L3菌株在乙草胺污染土壤中的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)程。

影響芽孢形成的因素有很多，本試驗(yàn)僅對(duì)前人考察最多的影響因素及操作時(shí)較易控制的影響因素進(jìn)行了研究。除此之外，突然降溫、靜置、添加固體介質(zhì)等，都有可能大大提高菌株的芽孢形成率[19]，接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等也可作為繼續(xù)考察提高L3芽孢形成率的參數(shù)。

實(shí)驗(yàn)室常用的芽孢計(jì)數(shù)方法有血球計(jì)數(shù)板法和活菌稀釋涂布法。血球計(jì)數(shù)板法使用較廣泛，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于芽孢和菌體大小差別不大，染色后，視野中二者容易混淆，使計(jì)數(shù)產(chǎn)生困難；活菌稀釋涂布法相較前者，結(jié)果更為直觀精確，操作也較方便。

目前將枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生物肥料或微生態(tài)制劑的制備已很常見[20]，學(xué)者們對(duì)菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化的研究也相繼報(bào)道[21-22]，本研究中，枯草芽孢桿菌L3產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化后，最終的芽孢形成率可達(dá)97.1%，總生物量可達(dá)6.5×109cfu/mL，已基本達(dá)到預(yù)期目的。

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Optimization of Spore Production Conditions of Acetochlor-degrading StrainBacillussubtilisL3

ZHAI Beibei,YAN Zhiyu,LI Shu’na*,LIU Li,ZHU Baocheng

(College of Life Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

L3,belonging toBacillussubtilis,is an acetochlor-degrading strain.In order to improve the formation rate and quantity of its spores,the optimization of spore produced conditions of L3 was conducted.Spore formation rate and total biomass in the fermentation liquor were used as detection indexes in this test. Firstly,the factors influencing the production of spores of L3,such as carbon sources,nitrogen sources and inorganic salts,were investigated by single factor tests.And then two orthogonal tests at L16(43) were used respectively to obtain the optimized medium combination and the fermentation conditions which were best for the spore formation of L3.The results showed that the optimum medium composition was as follows: 1% lactose,3% corn flour,0.1% NaH2PO4·2H2O.The optimum culture conditions were as follows: initial pH of 7.5,inoculated time of 20 h,filling capacity of 30 mL in 250 mL bottle.After optimization,BacillussubtilisL3 had a spore production rate of 97.1%,and the total biomass reached 6.5×109cfu/mL.

acetochlor; degrading bacterium;Bacillussubtilis; spore formation rate; condition optimization; soil remediation

2016-04-15

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新重點(diǎn)扶持計(jì)劃項(xiàng)目(2013002)

翟蓓蓓(1993-)，女，河北邢臺(tái)人，在讀碩士研究生，研究方向：土壤乙草胺的微生物降解。 E-mail：1031374288@qq.com

*通訊作者：李術(shù)娜(1972-)，女，河北保定人，教授，博士，主要從事污染環(huán)境修復(fù)研究。E-mail：bdlishuna@126.com

S482.4+6；TQ920.6

A

1004-3268(2016)10-0098-05