羅曉錚，代麗萍，劉孟奇，陳隨清

(河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

菘藍(lán)葉和根的解剖及生物堿的組織化學(xué)定位研究

羅曉錚，代麗萍，劉孟奇*，陳隨清

(河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

為了揭示板藍(lán)根和大青葉外觀(guān)形狀和顯微特征與其內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)系，利用光學(xué)顯微鏡和組織化學(xué)方法對(duì)菘藍(lán)葉和根的顯微結(jié)構(gòu)特征以及生物堿類(lèi)物質(zhì)在葉和根中的分布情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:菘藍(lán)葉的上、下表皮上都無(wú)毛被; 葉的上、下表皮上都分布有無(wú)規(guī)則型氣孔，下表皮的氣孔指數(shù)明顯高于上表皮的。葉肉有柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織之分，柵欄組織有2層細(xì)胞。根的韌皮部和木質(zhì)部間有明顯的形成層,韌皮部的薄壁細(xì)胞中有大量的淀粉粒。生物堿類(lèi)化合物在葉中分布在包括柵欄組織和海綿組織在內(nèi)的一些葉肉細(xì)胞中,在根中生物堿類(lèi)化合物主要分布在韌皮部的一些薄壁細(xì)胞中。表明菘藍(lán)根的橫切面上韌皮部越寬的質(zhì)量越佳。

菘藍(lán); 解剖; 生物堿; 組織化學(xué)定位

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)是十字花科(Brassicaceae)菘藍(lán)屬1年生或2年生草本植物,在全國(guó)大多數(shù)地區(qū)都有栽培。菘藍(lán)的葉和根均可入藥，其干燥葉作大青葉入藥，干燥根作板藍(lán)根入藥[1]。大青葉和板藍(lán)根均味苦，性寒，具有清熱解毒、涼血之功效，都是傳統(tǒng)的抗病毒中藥材，而且板藍(lán)根是公認(rèn)的具有較好抗病毒效果的少數(shù)中藥之一[2]。大青葉和板藍(lán)根的重要活性成分主要屬于生物堿類(lèi)化合物(靛藍(lán)、靛玉紅和表告依春等)，靛玉紅和表告依春的含量分別是大青葉和板藍(lán)根藥材及其制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[1]。板藍(lán)根和大青葉抗病毒療效顯著，市場(chǎng)需求量較大，所以全國(guó)各地大量種植菘藍(lán)，然而由于各地區(qū)地理?xiàng)l件及栽培管理的不同,導(dǎo)致藥材質(zhì)量存在較大差異?！氨鏍钫撡|(zhì)”是中藥材鑒定的精髓，為了揭示板藍(lán)根和大青葉外觀(guān)形狀和顯微特征與其內(nèi)在質(zhì)量的關(guān)系，采用徒手切片、組織化學(xué)等方法，對(duì)菘藍(lán)葉和根的顯微結(jié)構(gòu)特征及生物堿的貯藏場(chǎng)所進(jìn)行研究，旨在為大青葉和板藍(lán)根的生藥鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供依據(jù)，并為菘藍(lán)的合理開(kāi)發(fā)和及時(shí)采收提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的葉和根于2014年9月采集于河南中醫(yī)學(xué)院中藥植物園(羅曉錚副教授鑒定),分別取成熟植株的主根和葉片。試劑均為分析純，顯微鏡為L(zhǎng)EICA-DM3000顯微鏡。

碘-碘化鉀(Wagner)試劑：碘1 g與碘化鉀10 g溶于50 mL水(微溫)，加2 mL乙酸，加水至100 mL。用于生物堿染色，顯棕褐色。

改良碘化鉍鉀試劑(Dragendoff試劑)：(1)堿式硝酸鉍0.85 g溶于10 mL冰醋酸與40 mL水中；(2)碘化鉀0.8 g溶于20 mL水中。試液(1)與試液(2)等量混合置棕色瓶?jī)?nèi)保存作貯備液。用前將1 mL貯備液、2 mL冰醋酸與10 mL水混合后，用于生物堿與某些含氮化合物顯色反應(yīng)，顯橙紅色。

1.2 方法

1.2.1 顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 葉表皮觀(guān)察：在葉片中部中脈附近取0.5 cm×1.0 cm的小塊，撕去上、下表皮，用水封片。葉和根的徒手切片觀(guān)察：取新鮮葉片和根，切成小塊(段)，用單面刀片對(duì)葉和莖進(jìn)行徒手橫切，用水封片。

1.2.2 生物堿組織化學(xué)定位 對(duì)菘藍(lán)根和葉進(jìn)行徒手切片，并放置于載玻片上，滴加碘-碘化鉀溶液，使切片中生物堿顯色，用水封片。對(duì)菘藍(lán)的根進(jìn)行徒手切片后，放置于載玻片上，滴加碘化鉍鉀溶液，處理10 min，使切片中生物堿顯色，用水封片。

以上封片用LEICA-DM3000顯微鏡觀(guān)察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 菘藍(lán)葉和根的顯微特征

2.1.1 葉的顯微特征 葉的上、下表皮均無(wú)毛被，上表皮有大量的蠟質(zhì)顆粒(圖 1A)，上、下表皮上均有氣孔分布(圖 1B，C)，氣孔由2個(gè)腎形保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，周?chē)话阌?個(gè)表皮細(xì)胞，無(wú)真正的副衛(wèi)細(xì)胞，氣孔屬無(wú)規(guī)則型。上表皮氣孔大小為(28.5±2.3)μm×(17.6±2.1)μm(長(zhǎng)×寬)；下表皮氣孔大小為(29.3±2.3)μm×(17.5±2.0)μm，上、下表皮氣孔大小相近。下表皮氣孔指數(shù)為25～30，上表皮氣孔指數(shù)小，為15～23。上表皮細(xì)胞近乎等徑，形狀無(wú)規(guī)則，垂周壁呈淺波狀彎曲(圖 1B)。下表皮細(xì)胞較長(zhǎng)，形狀無(wú)規(guī)則，垂周壁為深波狀彎曲(圖 1C)。

A.葉片上表皮,顯示有大量的蠟質(zhì)顆粒；B.葉片上表皮；C.葉片下表皮；D.葉片的橫切；E.葉片柵欄組織處的平切；F.葉片海綿組織處的平切；

葉片為異面葉，由表皮、葉肉和葉脈組成。葉片上、下表皮都是單層細(xì)胞(圖 1D)。從橫切面上看，上、下表皮細(xì)胞都為方形或長(zhǎng)方形，細(xì)胞排列緊密，無(wú)細(xì)胞間隙；上表皮細(xì)胞厚度(26±4)μm，下表皮厚度為(22±3)μm，上表皮細(xì)胞角質(zhì)層比下表皮的要厚。葉肉組織厚度為(315±25)μm，有柵欄薄壁組織和海綿薄壁組織之分。柵欄薄壁組織有2層細(xì)胞，厚度約(120±20)μm。柵欄薄壁組織鄰接上表皮，細(xì)胞為短柱狀，外層細(xì)胞長(zhǎng)，內(nèi)層細(xì)胞短。柵欄組織薄壁細(xì)胞間有發(fā)育良好的細(xì)胞間隙(圖 1E)，細(xì)胞中有很多葉綠體緊貼細(xì)胞壁排列成一層。海綿薄壁組織鄰接下表皮，由一些等徑的薄壁細(xì)胞組成，排列疏松，細(xì)胞間隙大(圖 1F)。和柵欄組織相比，海綿組織厚度大，排列疏松。葉的主脈發(fā)達(dá)，維管束排列呈半圓形，木質(zhì)部位于向軸面，韌皮部位于背軸面,維管束鞘明顯(圖 1G)。在葉主脈維管束鞘的薄壁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有淀粉粒(圖 1H)。

2.1.2 根的顯微特征 從根的橫切片(圖 1I)觀(guān)察到韌皮部寬廣，射線(xiàn)明顯，形成層成環(huán)。從縱切片觀(guān)察到韌皮部薄壁細(xì)胞中聚集有大量的淀粉粒,木質(zhì)部薄壁細(xì)胞有少量的淀粉粒(圖 1J)。根橫切片顯示，韌皮部顏色為白色(圖 1K)。木質(zhì)部導(dǎo)管為類(lèi)圓形，輻射狀排列，導(dǎo)管直徑約80 μm，導(dǎo)管內(nèi)有黃色物質(zhì)(圖 1L)。

2.2 菘藍(lán)葉和根的組織化學(xué)特征

2.2.1 葉的組織化學(xué)特征 碘-碘化鉀試劑染色時(shí)間不同，可以分別顯示生物堿和淀粉粒的存在。在染色時(shí)間比較短的時(shí)候，顯示生物堿。葉橫切后或葉片切成小塊撕去上、下表皮后，用碘-碘化鉀處理后觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)在包括葉肉組織(包括柵欄組織和海綿組織)的一些薄壁細(xì)胞中有黑色沉淀(圖 2A，B)，在對(duì)葉片橫切的觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)主脈的薄壁細(xì)胞中也有黑色沉淀(圖 2C)，這些黑色沉淀顆粒都比淀粉粒要大得多，顯示為生物堿類(lèi)化合物的分布。如果用碘-碘化鉀處理時(shí)間稍長(zhǎng)，在葉主脈維管束鞘的薄壁細(xì)胞中的淀粉粒變成黑色(圖 2D)。在葉肉組織細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)淀粉粒。

A,B.顯示碘-碘化鉀處理后葉肉組織中出現(xiàn)黑色沉淀,A為葉橫切，B為撕去上下表皮后；C.葉主脈橫切片，碘-碘化鉀處理后黑色沉淀表

2.2.2 根的組織化學(xué)特征 根的橫切片用碘-碘化鉀處理時(shí)間比較短時(shí)，發(fā)現(xiàn)在韌皮部的一些薄壁細(xì)胞有大小不同的黑色顆粒，然而這些顆粒都比淀粉粒要大得多(圖 2E，F(xiàn))，這顯示生物堿類(lèi)化合物的分布；而木質(zhì)部含有的黑色顆粒較少，因此黑色顆粒主要都集中于韌皮部，由此認(rèn)為根中生物堿類(lèi)物質(zhì)主要分布在韌皮部。為了顯示淀粉粒的分布，對(duì)根徒手縱切后，用碘-碘化鉀溶液染色稍長(zhǎng)時(shí)間后，水裝片觀(guān)察，可以看到韌皮部的薄壁細(xì)胞都含有大量的黑色顆粒，而木質(zhì)部含有的黑色顆粒較少(圖 2G)，對(duì)照染色前的淀粉粒分布，發(fā)現(xiàn)淀粉粒主要集中在韌皮部中。

由于碘-碘化鉀能同時(shí)對(duì)淀粉粒和生物堿染色，而碘化鉍鉀試劑只對(duì)生物堿染色，為了更好顯示生物堿的分布，對(duì)根橫切后，經(jīng)過(guò)碘化鉍鉀試劑染色，做水封片觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)韌皮部中分布較多橙紅色的斑點(diǎn)(圖 2H)，而在木質(zhì)部中只是零星散布(圖 2I)，表明生物堿主要分布在韌皮部中。

3 結(jié)論與討論

菘藍(lán)葉上、下表皮均無(wú)毛被，上表皮表面有許多小的蠟質(zhì)顆粒，這種結(jié)構(gòu)可使菘藍(lán)葉表面不易沾水，保持干燥，不容易有真菌繁殖。蠟質(zhì)層能反射強(qiáng)光，保護(hù)植物，這也與上表皮顏色淺有關(guān)。菘藍(lán)葉上表皮細(xì)胞的外壁有較厚的角質(zhì)層，可以防止高溫下葉片內(nèi)水分的過(guò)度散失；同時(shí)可以防止強(qiáng)光對(duì)內(nèi)部細(xì)胞的灼傷,保證光合作用的正常進(jìn)行。菘藍(lán)葉的上、下表皮都分布有無(wú)規(guī)則型氣孔，下表皮的氣孔指數(shù)顯著高于上表皮的，由于葉片下表面的溫度要比上表面的低，從而有利于減少水分從氣孔的蒸發(fā)[3-4]。菘藍(lán)葉表皮的這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都是對(duì)旱生環(huán)境的適應(yīng)，也說(shuō)明菘藍(lán)是一種陽(yáng)性植物。

碘-碘化鉀組織化學(xué)染色表明,菘藍(lán)葉中的生物堿廣泛分布在葉肉細(xì)胞中，并且主脈的薄壁細(xì)胞中也分布有生物堿。對(duì)根的組織化學(xué)染色表明生物堿類(lèi)主要分布在韌皮部。對(duì)比葉和根的碘-碘化鉀染色發(fā)現(xiàn)，葉中顯色顆粒數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于在根中的，表明葉中生物堿的含量遠(yuǎn)高于根中。

板藍(lán)根藥材斷面特征是“金井玉欄”[5]。菘藍(lán)根的顯微研究表明，“金井玉欄”與木質(zhì)部和韌皮部的形態(tài)特征相對(duì)應(yīng)。“金井”是因木質(zhì)部顯黃色，推

測(cè)可能含有黃酮類(lèi)成分，有待于進(jìn)一步研究；“玉欄”指韌皮部為白色，“金井玉欄”是板藍(lán)根藥材的斷面外觀(guān)性狀的特點(diǎn)。菘藍(lán)根同一產(chǎn)地、相同生長(zhǎng)年限的樣品木質(zhì)部與韌皮部寬度比例(木皮比) 差異較大。研究表明[6]，木皮比不同的板藍(lán)根藥材質(zhì)量存在差異，皮部是其活性的主要體現(xiàn)者。對(duì)菘藍(lán)根中表告依春含量的研究[7]表明 ，表告依春主要存在于根的韌皮部，表告依春含量的多少與板藍(lán)根藥材中的木皮比成反比。本研究表明，菘藍(lán)根中生物堿類(lèi)物質(zhì)主要分布在韌皮部，因此木皮比越小，韌皮部面積越大，生物堿分布就越多，因此板藍(lán)根藥材的質(zhì)量就越好。本研究從組織化學(xué)方面證實(shí)木皮比與板藍(lán)根藥材質(zhì)量的內(nèi)在聯(lián)系，為板藍(lán)根藥材的質(zhì)量鑒別提供了一項(xiàng)依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，采自菘藍(lán)第1年的根的板藍(lán)根藥材，橫切面上韌皮部面積大，淀粉多，粉性大，質(zhì)脆，生物堿含量高。而收集種子后采收的板藍(lán)根藥材, 質(zhì)硬, 橫切面上木質(zhì)部面積大,占半徑的6/7～7/8，且薄壁組織中無(wú)淀粉粒，生物堿含量低，質(zhì)量不好，不宜藥用，這與有關(guān)研究結(jié)果[8]相符 。本研究的結(jié)論對(duì)于菘藍(lán)新品種的培育及其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)有一定的理論指導(dǎo)價(jià)值。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：20-21，191-192.

[2] 肖珊珊，金郁，孫毓慶．板藍(lán)根化學(xué)成分、藥理及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(6): 455-459.

[3] Dickison W C.Integrative plant anatomy[M].San Diego:Harcourt/Academic Press,2000:45-64.

[4] Rost T L,Barbour M G,Stocking C R,etal.Plant biology[M].2nd edition.Canda:Thomson Brooks/Cole,2006: 71-74.

[5] 張貴君.中藥鑒定學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2009:27.

[6] 鄢丹，韓玉梅，駱驕陽(yáng)，等.板藍(lán)根木皮比與藥效及化學(xué)成分的相關(guān)性分析[J].中藥材，2011,34(1): 43-46.

[7] 劉倩倩，王康才，羅春紅，等.不同品種類(lèi)型菘藍(lán)根中表告依春累積規(guī)律研究[J].中藥材,2013,36(2): 199-201.

[8] 馮毓秀，夏光成，秦秀芹.板藍(lán)根與馬藍(lán)根的形態(tài)組織特征[J].基層中藥雜志,1993,7(1):1-3.

Anatomy and Histochemical Localization of Alkaloids in the Leaf and Root ofIsatisindigoticaFort.

LUO Xiaozheng,DAI Liping,LIU Mengqi*,CHEN Suiqing

(School of Pharmacy,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,China)

Microscopic characters and locality of alkaloids in the leaf and root ofIsatisindigoticawere studied by normal microscopy and histochemical methods.The results showed that trichomes were not found on both adaxial and abaxial leaf surface ofI.indigotica.Anomocytic stomata were distributed on both surfaces.Stomatal density of abaxial surface was obviously higher than that of adaxial surface.The mesophyll consisted of palisade parenchyma and spongy parenchyma.Palisade parenchyma was arranged in two layers of parenchyma cell.The root developed an obvious ring of cambium between xylem and phloem. A great number of starch grains were found in parenchyma cells of phloem.Distribution of alkaloids was observed in palisade parenchyma cells and spongy parenchyma cells in the leaves ofI.indigotica. Alkaloids were mainly distributed in parenchyma cells of phloem in the root.From these results, it could be deduced that the root ofI.indigoticawith a broader phloem in a cross section should be of better quality.

Isatisindigotica; anatomy; alkaloid; histochemical localization

2016-06-04

河南中醫(yī)學(xué)院苗圃工程項(xiàng)目(MP2012-04)；2014年度河南中醫(yī)學(xué)院省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2014KYYWF-ZZCX3-03)；國(guó)家中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專(zhuān)項(xiàng)(財(cái)社[201176]號(hào))

羅曉錚(1973-)，女，河南新野人，副教授，碩士，主要從事藥用植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。 E-mail:luoxiaozheng@sina.com

*通訊作者：劉孟奇(1971-)，男，河南偃師人，副教授，博士，主要從事藥用植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。 E-mail:2009liumq@163.com

S567.2

A

1004-3268(2016)10-0119-04