孫 旭, 李代禧, 郭柏松

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093; 2.上海東富龍科技股份有限公司,上海 201108)

雙糖保護(hù)劑對(duì)胰島素活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

孫 旭1, 李代禧1, 郭柏松2

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093; 2.上海東富龍科技股份有限公司,上海 201108)

采用微量熱分析法并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬,研究了不同雙糖保護(hù)劑對(duì)胰島素的保護(hù)效果.結(jié)果表明,通過(guò)區(qū)域選擇性吸附,雙糖保護(hù)劑可以在胰島素表面產(chǎn)生保護(hù)作用,提高胰島素的熱穩(wěn)定性.在4種雙糖保護(hù)劑中,吸附作用越強(qiáng)的保護(hù)劑對(duì)胰島素?zé)岱€(wěn)定性的提升效果越好.隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,胰島素的熱穩(wěn)定性呈先增強(qiáng)后穩(wěn)定的趨勢(shì).進(jìn)一步分析了保護(hù)劑與水分子之間的相互作用,得出雙糖保護(hù)劑與胰島蛋白之間的直接相互作用可能是提高其熱穩(wěn)定性的主要原因.

雙糖; 胰島素; 熱穩(wěn)定性; 分子模擬; 微量熱

蛋白質(zhì)類(lèi)藥物具有藥理活性高、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用等特點(diǎn),但其在分離、純化、貯存及運(yùn)輸過(guò)程中極易變性失活[1].如何提高蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的穩(wěn)定性一直是生物制藥領(lǐng)域的重要研究課題.目前,提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常用方法是在藥物生產(chǎn)處方中添加有機(jī)小分子保護(hù)劑[2].海藻糖作為一種糖類(lèi)保護(hù)劑,化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定,它具有不同于其他雙糖的優(yōu)良特性,即海藻糖可以有效減弱一些外界因素對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的不利影響,起到保護(hù)蛋白質(zhì)藥物活性的作用,增強(qiáng)蛋白質(zhì)抵抗熱變性的能力[3].因此,海藻糖常作為蛋白質(zhì)藥物、酶等生物大分子的高效穩(wěn)定劑.

雖然海藻糖已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)保護(hù)研究領(lǐng)域,但相較于其他幾種常見(jiàn)的雙糖而言,海藻糖的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)及糖類(lèi)保護(hù)劑穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性結(jié)構(gòu)的作用機(jī)理仍在研究和探討之中.一種觀點(diǎn)認(rèn)為有機(jī)小分子可以“絡(luò)合”到大分子基團(tuán)上作為配體,產(chǎn)生直接相互作用,從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu).也有研究者認(rèn)為,有機(jī)分子的加入改變了水溶液的特性[4],間接保護(hù)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu).

為此,本文以熱敏性蛋白藥物胰島素[5]作為研究對(duì)象,選擇4種雙糖保護(hù)劑:海藻糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖,通過(guò)納瓦級(jí)高靈敏差示掃描量熱儀[6](differential scanning calorimeter,Nano-DSC)及分子動(dòng)力學(xué)模擬方法[7](molecular dynamics,MD),研究不同雙糖保護(hù)劑對(duì)蛋白質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用與規(guī)律,深入分析雙糖分子與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,從分子層面解析海藻糖作為一種優(yōu)良保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理,為蛋白藥物輔料配方的篩選及處方優(yōu)化提供一定的指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 實(shí) 驗(yàn)

1.1.1 試劑與儀器

試劑藥品:α-D-海藻糖(Trehalose),β-D-乳糖(Lactose),α-D-麥芽糖(Maltose)和α-D-蔗糖(Sucrose),均為分析純.

豬胰島素:批號(hào)為1506A04,徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司,白色結(jié)晶性干粉,為市售分析純.

儀器:分析天平(METTLER,XS205),納瓦級(jí)高靈敏差示掃描量熱儀(TA Instrument,USA).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將保護(hù)劑溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.000%的醋酸溶液中,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.000%保護(hù)劑溶液,通過(guò)二倍稀釋法,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%,1.250%,2.500%,5.000%的保護(hù)劑溶液.準(zhǔn)確稱(chēng)量一定量的豬胰島素粉末,溶解于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的保護(hù)劑溶液中,空白組是胰島素直接加入到20.000%醋酸溶液中,均配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mmol/L的胰島素單體溶液[8].熱分析前,保護(hù)劑溶液及胰島素溶液均在真空度大于-56.66 kPa條件下脫氣20 min.首先將參比池和樣品池中均注入保護(hù)劑溶液,掃描溫度范圍為25.00～100.00 ℃,升溫速率為1.00 ℃/min.掃描結(jié)束清洗后,再將參比池注入保護(hù)劑溶液,樣品池注入胰島素溶液,采用相同的條件進(jìn)行升溫掃描.所有的數(shù)據(jù)均用TA DSC Run軟件記錄,數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析處理采用TA Nano Analyze 3.4.0.軟件的數(shù)據(jù)分析模型two-state scaled model,分析熱變性溫度Tm[9]所選取的置信區(qū)間為95%.

1.2 模擬部分

本文中的胰島素分子結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取[10],其晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:3inc)由X射線衍射得到,分辨率為0.2 nm,如圖1所示.4種雙糖分子的初始結(jié)構(gòu)均取自于ChEBI數(shù)據(jù)庫(kù)[11],化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示(見(jiàn)下頁(yè)),并利用Gaussian 09軟件包進(jìn)行雙糖結(jié)構(gòu)優(yōu)化[12].

圖1 胰島素三維結(jié)構(gòu)

分子模擬均利用GROMACS 5.0.5分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件[13],胰島素采用Amber99sb-ildn全原子力場(chǎng)[14],保護(hù)劑分子采用Amber通用力場(chǎng)[15],選用Tip4p水分子模型[16].本次模擬中時(shí)間步長(zhǎng)設(shè)定為2 fs,范德華相互作用利用Lenard-Jones函數(shù)計(jì)算[17],截?cái)嘣O(shè)定為1.0 nm,用于范德華分子間相互作用長(zhǎng)程矯正的近鄰列表半徑設(shè)定為1.0,每10步更新一次近鄰列表.靜電相互作用的長(zhǎng)程矯正采用粒子網(wǎng)格埃瓦德統(tǒng)計(jì)方法(particle mesh ewald,PME)[18],靜電相互作用的截?cái)嘣O(shè)定為1.0 nm.壓力控制采用Berendsen法[19],壓力耦合常數(shù)為0.5 ps.Velocity Rescale方法[20]用于溫度控制,時(shí)間常數(shù)設(shè)為0.1 ps.

圖2 雙糖結(jié)構(gòu)式

將胰島素單體放在10 nm×10 nm×10 nm的周期性體系中心,然后按比例隨機(jī)添加一定量的雙糖分子及水分子,表1為模擬體系的詳細(xì)信息.首先采取最速下降法[21]和共軛梯度法[22]對(duì)體系進(jìn)行能量最小化,接著固定胰島素的結(jié)構(gòu)和坐標(biāo)位置,進(jìn)行10 ns的限制性動(dòng)力學(xué)計(jì)算,然后進(jìn)行40 ns的常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬.選取最后5 ns的模擬軌跡進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.所有MD模擬均在等溫等壓系綜下進(jìn)行,溫度為300 K,壓力為1.01×105Pa.Ф代表雙糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù);NP,NS,NW分別代表胰島素、雙糖和水分子的數(shù)目;Pr為預(yù)平衡時(shí)間;Eq為平衡時(shí)間.

表1 模擬體系的組成

2 結(jié)果與討論

2.1 胰島素在不同體系中的穩(wěn)定性

Nano DSC可以測(cè)定蛋白質(zhì)藥物的Tm值,分析其在不同體系中的熱穩(wěn)定性[9].Tm越高,表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好.圖3描述了不同體系內(nèi)胰島素的Tm,從圖中可以看出,與未添加保護(hù)劑的體系相比,溶液中加入雙糖保護(hù)劑確實(shí)能夠提升胰島素的Tm.說(shuō)明雙糖類(lèi)保護(hù)劑能在一定程度上提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性.對(duì)比4種雙糖保護(hù)劑溶液中胰島素的Tm發(fā)現(xiàn),對(duì)胰島素的保護(hù)效果從強(qiáng)到弱依次是海藻糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖.從圖3中還可以看出,隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加,胰島素的Tm呈現(xiàn)先升高后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),說(shuō)明雙糖保護(hù)劑達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù),即臨界質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),保護(hù)劑對(duì)蛋白藥物熱穩(wěn)定性的提升作用不再明顯.

圖3 不同雙糖保護(hù)劑中胰島素的變性溫度值

2.2 保護(hù)劑分子在胰島素表面的吸附作用

經(jīng)過(guò)40 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,胰島素雙糖保護(hù)劑混合體系達(dá)到平衡狀態(tài),此時(shí),雙糖分子會(huì)吸附到胰島素表面,發(fā)揮其保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能[23].由于分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算過(guò)程中靜電相互作用和范德華相互作用的截?cái)喟霃骄O(shè)為1.0 nm,因此,統(tǒng)計(jì)了各個(gè)體系中距離胰島素表面1.0 nm范圍內(nèi)的保護(hù)劑分子數(shù)目,結(jié)果如圖4所示.

圖4 胰島素表面1.0 nm范圍內(nèi)吸附的保護(hù)劑個(gè)數(shù)

從圖4中可以看出,在厚度為1.0 nm保護(hù)層內(nèi)的保護(hù)劑分子數(shù)目隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后穩(wěn)定的趨勢(shì),說(shuō)明胰島素周?chē)?.0 nm范圍內(nèi)吸附的特定保護(hù)劑個(gè)數(shù)是有限的.相比較其他3種雙糖保護(hù)劑而言,胰島素表面1.0 nm范圍內(nèi)吸附的海藻糖數(shù)目更多,這可能是海藻糖保護(hù)效果優(yōu)于其他3種雙糖保護(hù)劑的原因.

因?yàn)?不同雙糖保護(hù)劑的吸附狀態(tài)類(lèi)似,只在吸附量上有差異,所以,圖5中僅列出了海藻糖在胰島素表面的吸附情況.從圖5中可以看出,海藻糖可以直接或間接地吸附在胰島素表面.隨著海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,保護(hù)劑在胰島素表面的吸附面積會(huì)不斷增加(圖5(a)～5(d)),當(dāng)添加的保護(hù)劑較多時(shí),海藻糖分子會(huì)在蛋白質(zhì)部分表面產(chǎn)生聚集,并不會(huì)完全覆蓋整個(gè)表面(圖5(d)和5(e)),說(shuō)明雙糖保護(hù)劑在蛋白質(zhì)表面的吸附作用是有區(qū)域選擇性的.

圖5 海藻糖在胰島素表面的區(qū)域選擇性吸附

圖5中的綠色部分代表海藻糖.為了更清楚地展示胰島素與海藻糖之間的相互作用情況,移除了體系中的水分子.

為了進(jìn)一步闡明雙糖保護(hù)劑種類(lèi)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性之間的關(guān)系,分析了胰島素與雙糖保護(hù)劑分子之間的非鍵相互作用,結(jié)果如圖6所示(見(jiàn)下頁(yè)).

觀察圖6(a)可知,隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,雙糖分子與胰島素之間的氫鍵數(shù)目不斷增大,當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到臨界質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),兩者之間的氫鍵個(gè)數(shù)并沒(méi)有隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的持續(xù)增加而大幅度增多.這是因?yàn)楸Ｗo(hù)劑分子在蛋白質(zhì)表面的吸附作用是具有區(qū)域選擇性的(如圖5所示),持續(xù)加入的雙糖分子并沒(méi)有全部吸附在胰島素表面并與其形成氫鍵.對(duì)比分析不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的4種雙糖保護(hù)劑溶液中保護(hù)劑分子與胰島素之間的氫鍵數(shù)目(圖6(a))及相互作用能(圖6(b))發(fā)現(xiàn),在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下,胰島素與雙糖保護(hù)劑之間的非鍵相互作用能由強(qiáng)到弱的順序?yàn)楹Ｔ逄?、乳糖、麥芽糖、蔗?表明保護(hù)劑與胰島素之間氫鍵數(shù)目越多,范德華及庫(kù)倫相互作用能亦越大.結(jié)合微量熱分析結(jié)果,說(shuō)明與胰島素之間相互作用越強(qiáng)的保護(hù)劑分子對(duì)胰島素的熱穩(wěn)定性提升效果越明顯.

圖6 不同體系中胰島素與雙糖保護(hù)劑之間的非鍵相互作用

綜上所述,雙糖分子可以通過(guò)非鍵相互作用吸附在胰島素表面,從而達(dá)到穩(wěn)定胰島素活性結(jié)構(gòu)的目的.蛋白質(zhì)表面吸附保護(hù)劑分子數(shù)目越多,兩者之間的相互作用亦越強(qiáng),保護(hù)劑對(duì)胰島素的熱穩(wěn)定性的提升效果也越明顯.雖然保護(hù)劑與胰島素之間的吸附作用是一種非特異性的結(jié)合方式,但是,這種結(jié)合作用是有區(qū)域選擇性的,并不會(huì)隨著保護(hù)劑的增多而不斷地增強(qiáng).這可能是雙糖保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)臨界值時(shí),胰島素的熱穩(wěn)定性并不隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著增強(qiáng)的原因.

2.3 水分子與胰島素之間的相互作用

水分子在穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能方面具有關(guān)鍵作用[24].然而,蛋白質(zhì)周?chē)梢云鸬椒€(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的水分子層非常薄,厚度只有1～3個(gè)分子層,所能起到的穩(wěn)定作用非常有限[25].相比較水分子而言,保護(hù)劑穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)的能力相對(duì)較強(qiáng),可以替代一部分水分子與生物大分子之間產(chǎn)生相互作用,從而增強(qiáng)生物大分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.

為了分析在保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加的體系中水分子和胰島素之間的氫鍵相互作用與胰島素穩(wěn)定性之間的關(guān)系,統(tǒng)計(jì)了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)雙糖體系中,胰島素內(nèi)部氫鍵數(shù)目及胰島素與水分子之間的氫鍵數(shù)目,結(jié)果如圖7所示.

隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加,胰島素內(nèi)部氫鍵數(shù)目呈升高趨勢(shì)(圖7(a));相反地,胰島素與水分子之間的氫鍵數(shù)目明顯降低(圖7(b)).這說(shuō)明保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí),主要是水分子在發(fā)揮穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,但是,這種穩(wěn)定作用很弱.雙糖保護(hù)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高后,保護(hù)劑分子會(huì)吸附在胰島素表面,減少了胰島素與水分子之間的氫鍵數(shù)目,說(shuō)明保護(hù)劑分子替換掉一部分與胰島素之間產(chǎn)生相互作用的水分子,增強(qiáng)胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,使得體系平衡時(shí)胰島素內(nèi)部氫鍵可以維持在一個(gè)較高的水平.但當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到臨界值時(shí),隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,雙糖保護(hù)劑替換蛋白質(zhì)表面水分子的數(shù)目不再增加,胰島素內(nèi)部的氫鍵個(gè)數(shù)也不再發(fā)生明顯變化,此時(shí)胰島素的結(jié)構(gòu)處于一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),這與保護(hù)劑在胰島素表面吸附作用的結(jié)果相吻合.

圖7 不同體系中的氫鍵數(shù)目

2.4 保護(hù)劑與水分子之間的相互作用

為了分析保護(hù)劑與水分子之間的相互作用與胰島素穩(wěn)定性之間的聯(lián)系,計(jì)算了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系中保護(hù)劑與水分子之間的氫鍵個(gè)數(shù)及兩者之間的相互作用能(圖8).從圖8中可以看出,隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加,雙糖保護(hù)劑與水分子之間的氫鍵個(gè)數(shù)不斷增多,相互作用能也不斷增強(qiáng).但通過(guò)胰島素的Tm值測(cè)定結(jié)果可知,胰島素的熱穩(wěn)定性并不是隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而不斷增強(qiáng),表明保護(hù)劑分子對(duì)水溶液特性的改變并不是影響胰島素?zé)岱€(wěn)定性變化的主要因素,結(jié)合上述胰島素與雙糖保護(hù)劑之間相互作用的討論可知,胰島素與雙糖保護(hù)劑之間相互作用的變化趨勢(shì)與胰島素?zé)岱€(wěn)定性的變化趨勢(shì)一致,說(shuō)明雙糖保護(hù)劑對(duì)胰島素?zé)岱€(wěn)定性的提升效果可能主要來(lái)源于保護(hù)劑與胰島素之間的直接相互作用.

圖8 不同體系中保護(hù)劑與水分子之間非鍵相互作用

3 結(jié) 論

利用微量熱分析法考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雙糖保護(hù)劑對(duì)胰島素?zé)岱€(wěn)定性的影響,并通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算分析雙糖保護(hù)劑與胰島素之間的相互作用.結(jié)果表明,雙糖保護(hù)劑均能提高胰島素的熱穩(wěn)定性,但4種雙糖對(duì)胰島素?zé)岱€(wěn)定性的提升能力之間存在差異,在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下,胰島素表面吸附的保護(hù)劑數(shù)目越多,保護(hù)劑與胰島素之間的非鍵相互作用越強(qiáng),對(duì)胰島素?zé)岱€(wěn)定性的提升作用亦越明顯.隨著保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,保護(hù)劑與蛋白質(zhì)之間的相互作用不斷增強(qiáng),但當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)臨界質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),兩者之間的相互作用強(qiáng)度不再顯著增加,而保護(hù)劑與水分子之間的相互作用仍大幅度增強(qiáng),表明雙糖保護(hù)劑與胰島素之間的直接相互作用可能是提高其熱穩(wěn)定性的主要原因.

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(編輯:石 瑛)

Bioactive Structural Stability of Insulin in Disaccharides Solutions

SUN Xu1, LI Daixi1, GUO Baisong2

(1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China; 2.ShanghaiTofflonScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Shanghai201108,China)

The approaches of microcalorimetry and molecular dynamic simulation were adopted to investigate the protective effect caused by adding protectants.The results indicate that disaccharide protectants are able to maintain the molecular structure of insulin and contribute to the thermal stability of insulin due to the regional selective adsorption of protectants on the surface of insulin.Among four disaccharide protectants,the protectant with stronger adsorption ability conducts better performance in stabilizing the molecular structure of protein.With increasing the concentration of protectants,the thermal stability of insulin changes from increasing to gradually stable state.A further analysis upon the interaction between protectants and water reflects that increasing the thermal stability of insulin is attributed mainly to the interaction between insulin and disaccharides.

disaccharides;insulin;thermalstability;molecularsimulation;microcalorimetry

1007-6735(2016)06-0598-07

10.13255/j.cnki.jusst.2016.06.016

2016-10-10

上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(T0503,P0502);上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(12ZR1420400);上海市“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”國(guó)際科技合作項(xiàng)目(12430702000);上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目(11XSY23)

孫 旭(1991-),男,碩士研究生.研究方向:計(jì)算生物學(xué).E-mail:sunxujiayou@126.com

李代禧(1975-),男,副教授.研究方向:計(jì)算生物學(xué).E-mail:dxli75@126.com

O 6-39

A