丁海霞 王富軍 黃曉偉 劉貝 杜亞萍 齊會(huì)卿

·論著·

不同途徑移植臍帶血干細(xì)胞對(duì)兔2型糖尿病的療效觀察

丁海霞 王富軍 黃曉偉 劉貝 杜亞萍 齊會(huì)卿

目的 觀察不同途徑移植臍帶血干細(xì)胞對(duì)兔2型糖尿病的治療效果。方法 30只新西蘭白兔，雌雄各半，制備2型糖尿病模型，隨機(jī)分成5組，其中6只在兔的胰腺內(nèi)注射臍帶血干細(xì)胞5×105個(gè)（A組），6只向胰腺背動(dòng)脈內(nèi)注入臍帶血干細(xì)胞5×105個(gè)（B組），6只經(jīng)耳緣靜脈輸注臍帶血干細(xì)胞5×105個(gè)（C組），6只在腹腔內(nèi)多處注入臍帶血干細(xì)胞5×105個(gè)（D組），其余6只向腹腔內(nèi)注射相同體積的PBS液作為對(duì)照組（E組）。HE染色觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化。以上5組白兔均培養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測(cè)白兔血糖，每周測(cè)血漿胰島素水平，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)對(duì)血糖值及胰島素水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 A組及B組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖降至（6.80±0.64）mmol/L和（6.78±0.57）mmol/L，胰島素水平逐漸回到正常分別為（25.60±1.47）mU/L和（25.55±1.52）mU/L，與E組（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。而C組血糖較前下降，至第4周末血糖及胰島素均未回正常水平，分別為（9.97±1.19）mmol/L和（15.82±1.05）mU/L，D組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖水平為（21.00±1.99）mmol/L，胰島素水平無(wú)明顯變化（3.77±0.31）mU/L，與E組（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。移植后4周A、B兩組胰腺組織形態(tài)得到明顯改善，C組部分改善，D組無(wú)明顯改善。結(jié)論 將臍帶血干細(xì)胞在胰腺、胰腺背動(dòng)脈注射及耳緣靜脈輸注進(jìn)行移植，可以明顯降低血糖，增加胰島素分泌量，其中，胰腺和胰腺背動(dòng)脈注射效果優(yōu)于耳緣靜脈輸注，腹腔內(nèi)移植無(wú)明顯效果。

臍血干細(xì)胞移植； 糖尿病，2型； 治療結(jié)果

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，需要長(zhǎng)期口服藥物或注射胰島素控制血糖，而人臍帶血干細(xì)胞因其可分化為胰島β細(xì)胞分泌胰島素[1]使得其在糖尿病治療中的效果備受關(guān)注，目前已有25 000多例臨床移植成功的案例[2]。與骨髓干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞相比，臍帶血干細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、免疫源性低、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)[3-4]，因此已廣泛應(yīng)用于臨床治療糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及其它少見(jiàn)疾病，均取得了良好的治療效果[5]。

目前臨床上臍帶血干細(xì)胞移植途徑主要有靜脈輸注、胰腺背動(dòng)脈注射或兩種方法聯(lián)合移植，而腹腔注射、胰腺實(shí)質(zhì)注射目前臨床尚無(wú)應(yīng)用，究竟哪種移植途徑效果更好，文獻(xiàn)少有報(bào)道。徐谷根等[6]報(bào)道了臍帶血干細(xì)胞胰腺實(shí)質(zhì)及胰腺背動(dòng)脈注射的效果比較，但缺乏靜脈輸注法的效果觀察。

本文對(duì)上述不同移植方法進(jìn)行了療效對(duì)比，試圖尋找一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效的移植方法，為臨床臍帶血干細(xì)胞移植治療糖尿病提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料及試劑

4周齡新西蘭健康大白兔30只（雌雄各半，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量（2.3± 0.5）kg。淋巴細(xì)胞分離液由天津顥陽(yáng)公司（密度為1.077 g/m1）提供，血糖測(cè)定試劑盒由保定長(zhǎng)城臨床試劑公司提供，血糖監(jiān)測(cè)采用羅氏血糖儀，胰島素ELISA試劑盒由Mercodia公司提供，蘇木素一伊紅購(gòu)自北京中杉金橋公司。

二、研究方法

1.人臍帶血干細(xì)胞混懸液的制備：臍血由石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院提供，來(lái)源于足月分娩的健康產(chǎn)婦，乙肝、艾滋、梅毒等檢測(cè)均呈陰性，產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。取新鮮臍血（6 h內(nèi)用畢），用PBS液（phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液，Nacl 8 g，Na2HPO41.44 g，Kcl 0.2 g，KH2PO40.24 g，溶于1 000 ml去離子水中，高壓滅菌，保存于4℃的冰箱備用，pH值7.40）等倍稀釋后置于50 ml離心管中，按1∶1比例加入人淋巴細(xì)胞分離液上，4℃，離心半徑5 cm，2 000 r/min，離心20 min后，臍血分5層，中間白膜層即為單個(gè)核細(xì)胞。用移液器小心吸取富含單個(gè)核細(xì)胞的混懸液放入另一離心管內(nèi)，4℃，離心半徑5 cm，1 000 r/min離心15 min，PBS洗滌3次。用低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為5× 105/ml。人臍帶血干細(xì)胞混懸液制備成功。

2.兔2型糖尿病模型的制備：30只新西蘭白兔基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼料配方：37％蔗糖、5％豬油、53％基礎(chǔ)飼料。第9周所有動(dòng)物禁食16 h（不禁水），經(jīng)耳緣靜脈1次快速注射鏈脲佐菌素[（streptozocin，STZ）Sigma公司]，與0.1 mmol/L、pH值4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成濃度為2％的STZ溶液）60 mg/kg，于STZ造模后第1周、第2周分別空腹采血1次。采血后及時(shí)分離血清，測(cè)定空腹血糖，以空腹血糖≥11.0 mmol/L為2型糖尿病造模成功。

3.臍帶血干細(xì)胞移植術(shù)：30只2型糖尿病白兔隨機(jī)分成5組，其中6只在兔的胰腺內(nèi)注射臍帶血干細(xì)胞懸液1 ml，濃度為5×105個(gè)/ml（A組），6只向胰腺背動(dòng)脈內(nèi)注入臍帶血干細(xì)胞懸液1 ml，濃度為5×105個(gè)/ml（B組），6只經(jīng)耳緣靜脈輸注臍帶血干細(xì)胞懸液1 ml，濃度為5×105個(gè)/ml（C組），6只在腹腔內(nèi)多處注入臍帶血干細(xì)胞懸液1 ml，濃度為5×105個(gè)/ml（D組），其余6只向腹腔內(nèi)注射相同體積的PBS液作為對(duì)照組（E組）。以上5組白兔均培養(yǎng)觀察4周，每天監(jiān)測(cè)白兔血糖，每周測(cè)血漿胰島素水平，采血及血糖監(jiān)測(cè)時(shí)間均為夜間空腹10 h后次日晨8點(diǎn)。

4.組織形態(tài)學(xué)觀察：采血結(jié)束后將白兔處死留取胰腺組織，經(jīng)固定、沖洗、脫水、浸染、包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察各組白兔胰腺組織形態(tài)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，血糖和胰島素水平用± s描述，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組白兔移植前后血糖及胰島素水平的動(dòng)態(tài)比較

A組及B組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖和胰島素水平逐漸降到正常，與E組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。而C組血糖較前下降，胰島素水平較前升高，但至第4周末血糖及胰島素均未回復(fù)正常水平，D組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖和胰島素水平較前無(wú)明顯變化，與E組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05，表1、2）。

二、各組白兔移植后4周胰腺組織HE染色形態(tài)比較

分組治療4周后取白兔胰腺組織顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，A組及B組胰腺組織形態(tài)較清晰，結(jié)構(gòu)比較完整，較多的胰島細(xì)胞團(tuán)，無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；C組與上述兩組比較形態(tài)偏紊亂，較少的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；D組與E組比較形態(tài)無(wú)明顯差異，可見(jiàn)胰腺組織胰島結(jié)構(gòu)萎縮，形態(tài)紊亂，僅見(jiàn)少許胰島細(xì)胞團(tuán)，并伴淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

討 論

表1 移植前后各組白兔血糖水平的變化（n = 6，mmol/L，± s）

表1 移植前后各組白兔血糖水平的變化（n = 6，mmol/L，± s）

注：A組為胰腺內(nèi)注射組,B組為胰腺背動(dòng)脈注射組,C組為耳緣靜脈輸注組,D組為腹腔注射組,E組為對(duì)照組。與A組相比aP ＜ 0.01，與B組相比bP ＜ 0.01, 與C組相比cP ＜ 0.01，與D組相比dP ＜ 0.01

分組移植前移植后1周移植后4周F值P值A(chǔ)組21.73±1.65 11.45±1.97 6.80±0.64 149.953＜ 0.01 B組21.55±1.78 11.50±1.88 6.78±0.57 145.181＜ 0.01 C組21.43±2.16 14.02±1.13abd9.97±1.19abd82.488＜ 0.01 D組21.03±2.01 21.03±2.03abc21.00±1.99abc0.001＞ 0.05 E組21.72±2.76 21.72±2.75abc21.77±2.70abc0.001＞ 0.05 F值 0.110 37.861 127.289 P值0.978 0.000 0.000

表2 移植前后各組白兔胰島素水平的變化（n = 6，mU/L，± s）

表2 移植前后各組白兔胰島素水平的變化（n = 6，mU/L，± s）

注：A組為胰腺內(nèi)注射組,B組為胰腺背動(dòng)脈注射組,C組為耳緣靜脈輸注組,D組為腹腔注射組,E組為對(duì)照組。與A組相比aP ＜ 0.01，與B組相比bP ＜ 0.01，與C組相比cP ＜ 0.01，與D組相比dP ＜ 0.01

分組移植前移植后1周移植后4周F值P值A(chǔ) 組3.67±0.41 18.02±1.92 25.60±1.47 372.478＜ 0.01 B組3.65±0.39 18.12±1.94 25.55±1.52 357.783＜ 0.01 C組3.77±0.33 10.96±1.28abd15.82±1.05abd232.092＜ 0.01 D組3.83±0.36 3.83±0.34abc3.77±0.31abc0.078＞ 0.05 E組3.70±0.39 3.76±0.34abc3.80±0.41abc0.107＞ 0.05 F值0.241 163.669 613.361 P值0.912 0.000 0.000

臍帶血是指胎兒娩出后殘留在臍帶和胎盤(pán)中的血液。新生兒臍帶血中含有豐富的造血干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血干細(xì)胞可以促進(jìn)1型糖尿病卒中小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[7]，移植后小鼠胰島中有10％ ～20％的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞可檢測(cè)出造血干細(xì)胞標(biāo)志物，說(shuō)明造血干細(xì)胞與胰島β細(xì)胞再生存在密切的關(guān)系[8]。而糖尿病是由于患者體內(nèi)胰島素缺乏所致，因此有學(xué)者利用臍帶血干細(xì)胞移植來(lái)治療糖尿病，取得了不錯(cuò)的療效[9-10]，移植臍帶血干細(xì)胞治療2型糖尿病的機(jī)制可能有如下幾種：（1）使臍帶血干細(xì)胞到達(dá)胰腺微環(huán)境，受到定向的誘導(dǎo)從而分化為胰島β細(xì)胞，增加其數(shù)量，最大限度的恢復(fù)和挽救胰島功能；（2）改善胰島微環(huán)境，促進(jìn)胰島細(xì)胞的再生；（3）使糖尿病并發(fā)癥得到有效改善和控制[11]，陳頻等[12]的研究顯示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多次足量序貫輸注干預(yù)模式對(duì)2型糖尿病大鼠糖代謝和胰島分泌功能具有良好的改善作用，其機(jī)制可能與其下調(diào)TLR4/NF-kB炎癥通路抑制胰島β細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用更勝于其促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖[13]，但文獻(xiàn)報(bào)道移植途徑各有不同，缺乏對(duì)不同移植途徑的對(duì)比，因此尋找一種方便快速、創(chuàng)傷小、效果好的方法成為眾多醫(yī)生奮斗的目標(biāo)。

本研究采用兔制作糖尿病模型，因?yàn)橥檬且环N體型適中的動(dòng)物，在給藥、取血、抗病性等方面明顯優(yōu)于大鼠，便于開(kāi)展糖尿病病理、治療及相關(guān)研究。而高脂高糖喂養(yǎng)加注射小劑量STZ能復(fù)制出具有胰島素抵抗、高血糖、高血脂等接近2型糖尿病臨床特點(diǎn)的兔動(dòng)物模型[14]，利于后續(xù)試驗(yàn)的開(kāi)展。

在本研究中發(fā)現(xiàn)胰腺內(nèi)注射組及胰腺背動(dòng)脈注射組在移植后血糖逐漸下降，胰島素水平逐漸上升，第4周末，血糖和胰島素水平逐漸降到正常。而經(jīng)耳緣靜脈輸注組血糖較前下降，胰島素水平較前升高，但至第4周末血糖及胰島素均未回復(fù)正常水平，經(jīng)腹腔注射組仍維持高血糖狀態(tài)，血糖和胰島素水平較前無(wú)明顯變化，上述結(jié)果提示，靜脈輸注有效，與胰島及胰腺背動(dòng)脈局部應(yīng)用相比效果較差，這與白兔胰腺組織HE染色結(jié)果相一致，如果延長(zhǎng)觀察時(shí)間或者多次輸注或者與胰島局部注射聯(lián)合效果可能更好，但尚待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)中應(yīng)用的有效量為5×105個(gè)，在今后的研究中將對(duì)不同劑量干細(xì)胞注射效果進(jìn)行對(duì)比觀察。

綜上所述，本文對(duì)比了臍帶血干細(xì)胞不同移植途徑對(duì)白兔糖尿病的治療作用，胰腺注射及胰腺背動(dòng)脈注射效果最佳，但若應(yīng)用于人創(chuàng)傷大、費(fèi)用高，而靜脈注射法簡(jiǎn)單、有效，可通過(guò)多次注射、延長(zhǎng)治療時(shí)間增強(qiáng)治療效果，腹腔內(nèi)注射無(wú)明顯效果，為臨床臍帶血干細(xì)胞移植提供了理論依據(jù)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察各組白兔移植后4周胰腺組織形態(tài) （HE染色×200）

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Effects of different route of umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of rabbits with type 2 diabetes mellitus

Ding Haixia, Wang Fujun, Huang Xiaowei, Liu Bei, Du Yaping, Qi Huiqing. Department of Endocrinology, the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China

Wang Fujun, Email:wangfujun139@126.com

Objective To evaluate the therapeutic effects of different routes of umbilical cord blood stem cell (UCSCs) transplantation on type 2 diabetes mellitus in rabbits. Methods Thirty New Zealand white rabbits with type 2 diabetes were randomly divided into five groups. In the treatment groups, 5×105UCSCs were given via different routes∶ in pancreas in Group A, via dorsal pancreatic artery in Group B, via ear marginal vein in Group C, and in abdominal cavity in Group D. In Group E, the same volume of PBS was given via intraperitoneal injectionf ana served as control. The five groups were evaluated for 4 weeks, and the blood glucose was monitored every day, plasma insulin levels were measured every week. Pancreatic tissues were evaluated. Results In Group A and Group B, the blood glucose levels were decreased gradually, and the levels of insulin increased gradually, they returned to normal in the fourth week, as（6.80±0.64）mmol/L and (6.78±0.57)mmol/L, (25.60±1.47) mU/L and (25.55±1.52) mU/L, compared with the control group (21.77±2.70) mmol/L and (3.80±0.41) mU/L (P ＜ 0.01). The blood glucose and insulin levels were changed in Group C,and the levels of bood glucose and insulin were not returned to normal level at fourth weeks, the number were(9.97±1.19) mmol/L and (15.82±1.05) mU/L. The blood glucose level and insulin level were not significantly changed in Group D and Group E(P ＞ 0.05). The islet architecture was improved and cell unite numbers were significantly increased in A and B group, but no changes were fond in D group. Conclusions Transplantation of umbilical cord blood stem cells in the pancreas, pancreatic dorsal artery and ear vein infusion can significantly reduce blood glucose, increase insulin secretion, better than the abdominal cavity transplantation.

Umbilical cord blood stem cell； Transplantation； Diabetes mellitus, Type 2 ； Treatment outcome

2016-06-15）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.002

河北省衛(wèi)生廳課題（20150760）

050011 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)分泌科

王富軍，Email：wangfujun139@126.com

丁海霞，王富軍，黃曉偉，等. 臍帶血干細(xì)胞不同途徑移植對(duì)兔2型糖尿病的療效觀察[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶334-338.