謝長(zhǎng)峰杜杰曾桂芳徐紹坤梁曉李嬋左叢林劉沐蕓胡祥

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)裸鼠的促瘤和致瘤性研究

謝長(zhǎng)峰1杜杰2曾桂芳1徐紹坤1梁曉1李嬋1左叢林2劉沐蕓1胡祥1

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）對(duì)動(dòng)物是否具有促瘤性，以及不同代次是否有致瘤性，為其臨床應(yīng)用提供安全性依據(jù)。方法 分別用人淋巴瘤細(xì)胞Raji接種于CB-17 SCID小鼠皮下、用人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr接種于BALB/c裸鼠皮下，建立皮下移植瘤模型，WiDr成模動(dòng)物用完全隨機(jī)法分為4組（n = 8）：模型對(duì)照組、hUCMSCs低、中、高劑量組；Raji成模動(dòng)物用完全隨機(jī)法分為5組（n = 7）：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、hUCMSCs低、中、高劑量組。hUCMSCs均靜脈注射給藥，觀察hUCMSCs對(duì)皮下移植瘤的增殖是否有影響。另外，觀察不同代次的hUCMSCs是否有致瘤性，NOD/SCID小鼠分別皮下接種hUCMSCs的第2、6、10代的細(xì)胞，注射后3周，16周對(duì)動(dòng)物剖檢，觀察hUCMSCs皮下結(jié)節(jié)的形成及是否有腫瘤轉(zhuǎn)化的傾向。對(duì)照組和hUCMSCs組的瘤體積及瘤重采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算hUCMSCs組相比對(duì)照組的相對(duì)腫瘤抑制率T/C％。結(jié)果 WiDr腫瘤模型中，第43天hUCMSCs中、高劑量組的瘤體積均顯著低于模型對(duì)照組，分別為（586.7±274.4）mm3、（689.5±114.8）mm3vs（945.9±234.0）mm3，P ＜ 0.05，但T/C％值＞ 40％；第51天hUCMSCs低、中高劑量組瘤體積均顯著低于模型對(duì)照組，分別為（777.8±346.7）mm3、（793.1±358.6）mm3、（800.7±116.5）mm3vs（1300.0±356.8）mm3，P均＜0.05，但T/C％值均＞ 40％；表明hUCMSCs在3個(gè)劑量下均未對(duì)WiDr腫瘤的生長(zhǎng)有影響，無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。Raji腫瘤模型中，hUCMSCs治療組瘤體積與對(duì)照組相比在所有時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），顯示hUCMSCs在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒有明顯的抑制和促進(jìn)作用。兩個(gè)模型的病理檢測(cè)均未見對(duì)腫瘤增殖有明顯影響。3個(gè)不同代次的hUCMSCs注射到NOD/SCID后16周對(duì)動(dòng)物剖檢，也沒有觀察到腫瘤轉(zhuǎn)化的傾向。結(jié)論 hUCMSCs對(duì)裸鼠WiDr和Raji移植瘤模型的腫瘤增殖無(wú)促進(jìn)作用，不同代次的hUCMSCs在NOD/SCID裸鼠體內(nèi)移植也不具有致瘤性。

臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； 致瘤性； 促瘤性

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有多向分化潛能的間葉組織來源干細(xì)胞，可從胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪等多種組織獲得，是一群多潛能細(xì)胞，可以向多種組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)細(xì)胞增殖分化[1]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordderived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）作為理想的MSCs來源越來越受到人們的重視，關(guān)于hUCMSCs的研究報(bào)導(dǎo)也越來越多。hUCMSCs具有特殊的免疫學(xué)表型，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子和共同刺激分子，不會(huì)引起同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[2]。移植入宿主體內(nèi)的MSCs可避免宿主的免疫排斥反應(yīng)，通過細(xì)胞間的相互作用及旁分泌作用等機(jī)制抑制過度活躍的T細(xì)胞的增殖及其過度免疫反應(yīng)[3]，從而發(fā)揮免疫重建的功能，進(jìn)而有可能在自身免疫疾病方面取得較好的療效[2]。以上特點(diǎn)為hUCMSCs在臨床上應(yīng)用于自身免疫性疾病提供了理論依據(jù)，但會(huì)不會(huì)因?yàn)槠涿庖咭种铺匦远T發(fā)業(yè)內(nèi)最為關(guān)注的干細(xì)胞致瘤性問題，已有研究認(rèn)為骨髓來源的MSCs在體內(nèi)外均有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[4-5]。那么臍帶來源的MSCs是否也有同樣的作用，之前已經(jīng)通過軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)及共培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)，揭示了hUCMSCs體外不具有致瘤性[6]，本文旨在進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究hUCMSCs是否在動(dòng)物體內(nèi)具有致瘤性及促瘤性，為其臨床使用提供安全性數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、材料

hUCMSCs（深圳市北科生物科技有限公司生產(chǎn)）；人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr、人淋巴瘤細(xì)胞Raji均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心；SPF級(jí)雌性BALB/C裸小鼠，動(dòng)物周齡約4 ～ 5周，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：0157988；雌性CB-17 SCID小鼠，動(dòng)物周齡約4 ～ 5周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：0196881、0199950；SPF級(jí)NOD/ SCID小鼠，動(dòng)物周齡為4 ～ 5周，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：0157641；動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中的IVC籠內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物的使用均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ACU-09-227。

二、方法

1.促瘤實(shí)驗(yàn)：體內(nèi)促瘤試驗(yàn)采用實(shí)體瘤WiDr和血液系統(tǒng)腫瘤Raji各1株，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr細(xì)胞或人淋巴瘤細(xì)胞Raji濃度調(diào)整為5×107個(gè)/ml，以BALB/c裸鼠皮下注射WiDr細(xì)胞0.2 ml及CB-17 SCID小鼠皮下注射Raji細(xì)胞0.2 ml造F0代荷瘤小鼠，待腫瘤生長(zhǎng)至400 mm3，選擇腫瘤生長(zhǎng)及健康狀況良好的荷瘤動(dòng)物，無(wú)菌條件下取瘤，制備成3 mm3左右組織塊，分別接種于動(dòng)物右側(cè)腋窩皮下制備BALB/c裸鼠人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr腫瘤模型和CB-17 SCID小鼠人淋巴瘤細(xì)胞Raji腫瘤模型。成模動(dòng)物隨機(jī)分為4組：模型對(duì)照組、hUCMSCs低、中、高劑量組，每組7 ～ 8只動(dòng)物，Raji模型另設(shè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射給藥，隔14天1次，共2次分別給予P2代hUCMSCs 2×105個(gè)細(xì)胞/只、6×105個(gè)細(xì)胞/只、2×106個(gè)細(xì)胞/只，給藥體積為0.5 ml，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的溶媒。每天進(jìn)行一般臨床觀察，每周1次詳細(xì)臨床觀察，每周2次稱量體質(zhì)量并測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積、相對(duì)腫瘤體積（RTV）和相對(duì)腫瘤增殖率T/C％，如果140％＞T/C％＞ 40％，為無(wú)影響；如果T/C％≤40％或≥140％，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P ＜0.05為有影響[7]。兩個(gè)模型試驗(yàn)的動(dòng)物安樂死后均剝離腫瘤結(jié)節(jié)、稱重，計(jì)算腫瘤抑制率，抑制率≥60％且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P ＜ 0.05時(shí)為對(duì)腫瘤增殖有抑制作用，抑制率＜ -40％且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P ＜ 0.05時(shí)為對(duì)腫瘤增殖有促進(jìn)作用[8]；同時(shí)進(jìn)行大體解剖觀察，取材心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腫瘤結(jié)節(jié)用10％中性福爾馬林作常規(guī)固定，石蠟包埋、切片、HE染色、顯微鏡下觀察。

2.致瘤性實(shí)驗(yàn)：為驗(yàn)證多次傳代后hUCMSCs是否具有致瘤性，采用兩條臍帶不同代次（分別為P2、P6、P10）的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以Hela細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，以MRC-5細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每組分別按照1×107個(gè)細(xì)胞/只的劑量腋窩皮下注射于10只NOD/SCID小鼠，雌雄各半，連續(xù)觀察16周，主要觀察指標(biāo)為小鼠皮下是否出現(xiàn)結(jié)節(jié)以及出現(xiàn)結(jié)節(jié)的病理類型，以判斷hUCMSCs是否存在體內(nèi)致瘤的傾向。判斷標(biāo)準(zhǔn)為在陰性和陽(yáng)性對(duì)照成立的前提下，待檢細(xì)胞皮下接種NOD/SCID小鼠后無(wú)腫物生長(zhǎng)或雖有隆突狀腫物生長(zhǎng)但卻是非腫瘤的，證明該細(xì)胞無(wú)致瘤性，判為陰性（－）；若有隆突狀腫物生長(zhǎng)，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)觀察、腫瘤鑒定證實(shí)確為腫瘤的，則判為陽(yáng)性（＋）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組別動(dòng)物的瘤體積或瘤重?cái)?shù)據(jù)以± s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、促瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）一般臨床觀察

WiDr腫瘤模型實(shí)驗(yàn)過程中，模型對(duì)照組、中劑量組和高劑量組均有動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少、消瘦和死亡，推測(cè)與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，非干細(xì)胞作用。Raji腫瘤模型對(duì)照組和低劑量組有動(dòng)物出現(xiàn)消瘦、精神不振和死亡，各組均有動(dòng)物出現(xiàn)腫瘤破潰現(xiàn)象，空白對(duì)照組動(dòng)物皮下無(wú)結(jié)節(jié)形成。腫瘤的破潰考慮是由于淋巴瘤細(xì)胞自身的異質(zhì)性程度較高和易轉(zhuǎn)移性所致，非干細(xì)胞作用。

兩個(gè)模型中，各劑量組在整個(gè)試驗(yàn)過程中的平均體質(zhì)量和對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，各劑量組的平均體質(zhì)量與對(duì)照組相比均差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（二）對(duì)移植瘤生長(zhǎng)情況的影響

WiDr腫瘤模型中，首次給藥后每周2次測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積Vt。結(jié)果可見：給藥后第43天中、高劑量組和給藥后第51天的低、中、高劑量組的Vt值均顯著低于模型對(duì)照組（P ＜0.05），但T/C％值均＞ 40％；其他時(shí)間點(diǎn)各劑量組T/C％值均＞ 40％，Vt值與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，判定供試品在3個(gè)劑量下均未對(duì)WiDr腫瘤的生長(zhǎng)有影響，無(wú)顯著促進(jìn)或抑制作用。

表1 hUCMSCs對(duì)小鼠WiDr模型腫瘤體積的影響（mm3，± s）

表1 hUCMSCs對(duì)小鼠WiDr模型腫瘤體積的影響（mm3，± s）

注：hUCMSCs為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，與模型對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05

組別例數(shù)第1天第13天第28天第43天第51天模型對(duì)照組832.3±11.6286.5± 72.5544.8±160.3945.9±234.01300.0±356.8低劑量組831.9± 9.0208.3±105.9461.8±243.5680.8±304.5 777.8±346.7a中劑量組832.7±10.2164.2± 70.9362.9±159.8 586.7±274.4a793.1±358.6a高劑量組832.9±20.7190.3±117.7435.4±117.0 689.5±114.8a800.7±116.5aF值0.0082.5101.4533.2165.336 P值0.9990.0790.2490.0380.005

Raji模型腫瘤中，給藥后每周2次測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積Vt。結(jié)果可見：高、中、低劑量組Vt值與對(duì)照組相比在所有時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05，表2），顯示供試品在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒有明顯的抑制和促進(jìn)作用。

（三）對(duì)腫瘤重量的影響

WiDr腫瘤模型中，高劑量組的平均瘤重低于模型對(duì)照組[（1.21±0.27）g vs（1.73±0.44）g，P ＜ 0.05]，低、中劑量沒有明顯差異[分別為（1.73± 0.44）g和 （1.37±0.68）g]。低、中、高劑量組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別為21％、31％和30％，但均未達(dá)到40％，提示供試品三個(gè)劑量對(duì)腫瘤重量均無(wú)明顯影響。

Raji腫瘤模型中，模型組和低、中、高劑量組平均瘤重分別為（1.4±0.3）g、（1.8±0.6）g、（1.9±0.5）g和（1.6±0.7）g。供試品各劑量組與模型對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示供試品3個(gè)劑量對(duì)腫瘤重量均無(wú)顯著影響。

（四）病理檢測(cè)

WiDr腫瘤模型病理切片可見：各組樣本的腫瘤結(jié)節(jié)在中央或一側(cè)出現(xiàn)單發(fā)或多發(fā)的灶狀大面積壞死，有的形成空腔，周圍腫瘤組織排列成不規(guī)則腺體狀，細(xì)胞呈有核分裂相，見圖1。各組樣本腫瘤結(jié)節(jié)均為皮下接種人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr所致。由此推論hUCMSCs對(duì)裸鼠實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用。

Raji腫瘤模型組及給藥低、中、高劑量組動(dòng)物，均可見右側(cè)前肢的腋窩處有腫瘤結(jié)節(jié)，生長(zhǎng)良好，未見破潰等明顯異常。腫瘤結(jié)節(jié)鏡檢結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞聚集成較大團(tuán)塊，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不整，團(tuán)塊中央大片不規(guī)則壞死并伴有出血，多見病理性核分裂相見圖2。剖檢各臟器內(nèi)均未見腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。由此推論hUCMSCs對(duì)裸鼠血液系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用。

二、致瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陰性對(duì)照組（MRC-5）在細(xì)胞接種后，本組10只動(dòng)物的接種部位均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)。部分動(dòng)物（6/10）于第4周實(shí)施安樂死，剩余動(dòng)物繼續(xù)觀察至16周實(shí)施安樂死。安樂死動(dòng)物的接種部位及周圍均未見結(jié)節(jié)生長(zhǎng)（表3），大體解剖觀察亦未見各臟器或組織有異?，F(xiàn)象。

表2 hUCMSCs對(duì)小鼠Raji模型腫瘤體積的影響（mm3，± s）

表2 hUCMSCs對(duì)小鼠Raji模型腫瘤體積的影響（mm3，± s）

注：hUCMSCs為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

組別例數(shù)第1天第7天第13天第28天第31天模型對(duì)照組7117.0±64.9284.9±160.5543.1±294.52013.2±617.72493.9±1013.1低劑量組7132.6±83.7315.3±189.6595.6±242.02088.2±748.42957.4±1032.2中劑量組7121.7±68.2313.4±147.6546.5±190.92199.3±501.62864.5± 643.8高劑量組7117.0±65.0252.2±181.0506.9±305.12107.3±967.92474.5± 139.0 F值0.0750.2120.1350.0770.690 P值0.9730.8880.9380.9720.567

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察WiDr模型各組腫瘤結(jié)節(jié) （HE染色×100）

表3 不同代次的hUCMSCs動(dòng)物體內(nèi)的致瘤情況

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察Raji模型各組腫瘤結(jié)節(jié) （HE染色×100）

陽(yáng)性對(duì)照組（Hela細(xì)胞）在接種后的第8天，有2只動(dòng)物出現(xiàn)結(jié)節(jié)，體積約為23.1 mm3和11.7 mm3。隨后，動(dòng)物陸續(xù)出現(xiàn)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為進(jìn)行性生長(zhǎng)。至觀察期第8周時(shí)結(jié)節(jié)的平均長(zhǎng)徑達(dá)1.4 cm，短徑達(dá)1.1 cm，全部動(dòng)物實(shí)施安樂死，大體解剖觀察見9/10只動(dòng)物有結(jié)節(jié)形成（表3），病理組織學(xué)切片檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),結(jié)節(jié)中間大面積壞死灶，周圍腫瘤細(xì)胞成簇分布，并可見核分裂相，細(xì)胞增殖活躍（圖3）。

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察 hUCMSCs致瘤性實(shí)驗(yàn)各組接種部位 （HE染色×100）

hUCMSCs P2組細(xì)胞接種后有動(dòng)物出現(xiàn)較明顯結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為退行性生長(zhǎng)狀態(tài)，至接種后第17天結(jié)節(jié)全部消失，持續(xù)時(shí)間為7 ～ 9 d，之后觀察至16周終止實(shí)驗(yàn)，均無(wú)結(jié)節(jié)再次出現(xiàn)。hUCMSCs P6組接種細(xì)胞第5天，有動(dòng)物出現(xiàn)較明顯結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為退行性生長(zhǎng)狀態(tài)，至接種后第14天結(jié)節(jié)全部消失，持續(xù)時(shí)間為6 ～ 9 d，之后觀察至16周終止實(shí)驗(yàn)，均無(wú)結(jié)節(jié)再次出現(xiàn)。hUCMSCs P10組接種細(xì)胞第5天，本組有動(dòng)物出現(xiàn)較明顯結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為退行性生長(zhǎng)狀態(tài)，繼續(xù)觀察，至接種后第11天結(jié)節(jié)全部消失，持續(xù)時(shí)間為5 ～ 6 d，之后觀察至16周終止實(shí)驗(yàn)，均無(wú)結(jié)節(jié)再次出現(xiàn)。以上3組安樂死后動(dòng)物大體解剖及組織病理學(xué)檢測(cè)見注射部位皮膚及皮下組織未見明顯異常（圖3，表3）。

討 論

hUCMSCs具有免疫抑制和免疫豁免特性，這與其免疫調(diào)節(jié)因子（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白介素-6）、協(xié)同刺激表面抗原（CD40、CD80和CD86）和HLA-G6的表達(dá)有關(guān)[9]。hUCMSCs本身免疫原性低，表達(dá)中等水平的MHC-I類分子，不表達(dá)MHC-II類分子，可以通過分泌可溶性細(xì)胞因子誘導(dǎo)T細(xì)胞活化受阻，從而改變T細(xì)胞和DC表型，并在體外抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖[9]。孫凌云等[10-16]即利用此特性進(jìn)行了hUCMSCs治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUCMSCs治療安全、耐受性良好，臨床療效顯著而持久。

采用華通氏膠組織塊貼壁法培養(yǎng)得到hUCMSCs，其形態(tài)、表面標(biāo)志物及誘導(dǎo)分化能力符合ISCT關(guān)于MSCs的標(biāo)準(zhǔn)[17]；軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外培養(yǎng)時(shí)hUCMSCs無(wú)致瘤性；與人白血病細(xì)胞K562和人結(jié)腸癌Colo-205細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外hUCMSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖沒有影響[6]。

BABL/c裸小鼠先天胸腺發(fā)育不良，不能產(chǎn)生胸腺依賴型T細(xì)胞，NOD/SCID和CB-17 SCID裸小鼠均存在聯(lián)合免疫缺陷并有T細(xì)胞和B細(xì)胞缺乏[18]，因此比較適合用于致瘤性評(píng)價(jià)。本次采用裸小鼠進(jìn)行體內(nèi)致瘤性和促瘤性實(shí)驗(yàn)，以全面考察hUCMSCs的致瘤性。

在體內(nèi)促瘤性實(shí)驗(yàn)中，WiDr模型對(duì)照組在第51天時(shí)腫瘤結(jié)節(jié)直徑超過20 mm，Raji模型在第31天時(shí)所有模型動(dòng)物均出現(xiàn)腫瘤破潰現(xiàn)象，根據(jù)人道終點(diǎn)的原則分別定為兩個(gè)腫瘤模型的終止點(diǎn)。WiDr模型中，給藥后第43天中、高劑量組和給藥后第51天低、中、高劑量組的Vt值均顯著低于模型對(duì)照組（P ＜ 0.05），但T/C％均大于40％，以腫瘤體積計(jì)算的腫瘤相對(duì)抑制率均未達(dá)到40％的標(biāo)準(zhǔn)[7]，認(rèn)為供試品不抑制腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤重量數(shù)據(jù)顯示，供試品低、中、高劑量組平均瘤重均低于模型對(duì)照組且高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，抑制率依次為21％、31％和30％），但抑制率均小于40％，未達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)[8]，雖然如此，這些異常結(jié)果仍然提示hUCMSCs與腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系非常復(fù)雜，需要進(jìn)一步的深入研究。病理檢測(cè)提示，陽(yáng)性對(duì)照組及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組腫瘤結(jié)節(jié)形態(tài)在鏡下觀察無(wú)明顯差異，結(jié)節(jié)內(nèi)部存在壞死灶，細(xì)胞形態(tài)多樣，雜亂無(wú)章，多處核分裂像，符合增生活躍的結(jié)腸癌腫瘤形態(tài)。Raji模型，3個(gè)劑量組Vt值與對(duì)照組相比在所有時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。腫瘤重量數(shù)據(jù)顯示，低、中、高劑量組平均瘤重均高于模型對(duì)照組，依次為134％、138％、118％，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），因此hUCMSCs靜脈注射對(duì)Raji模型淋巴細(xì)胞瘤的增殖沒有明顯影響，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。Raji模型實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，所有動(dòng)物皮下結(jié)節(jié)均有破潰現(xiàn)象，病理檢查為惡性生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞相，局部有壞死灶，符合增生活躍的淋巴瘤形態(tài)。經(jīng)過實(shí)體瘤WiDr模型和血液系統(tǒng)腫瘤Raji模型的皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，從腫瘤的體積、重量、病理形態(tài)三個(gè)方面綜合分析，認(rèn)為hUCMSCs對(duì)兩種來源的腫瘤增殖沒有抑制或促進(jìn)作用。該結(jié)果與之前體外研究結(jié)果一致[6]。

為較全面研究hUCMSCs體外多次傳代后其致瘤性會(huì)否發(fā)生改變，選用了兩個(gè)不同來源的臍帶的P2、P6和P10代次細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)。hUCMSCs3個(gè)代次細(xì)胞接種于BABL/c裸小鼠皮下，各組均有部分動(dòng)物接種部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，經(jīng)過病理切片檢查證實(shí)為非腫瘤性纖維組織增生。分析其原因可能是：hUCMSCs接種于小鼠皮下后，因人類細(xì)胞體積較大且一次性局部接種細(xì)胞量多而不能被動(dòng)物機(jī)體完全吸收或清除，對(duì)注射部位及其周圍組織產(chǎn)生刺激，引起局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨結(jié)締組織增生，形成體表可見的結(jié)節(jié)，但因?yàn)閔UCMSCs本身不具有致瘤性，在動(dòng)物體內(nèi)非無(wú)限制增殖，早期炎癥反應(yīng)隨時(shí)間逐步減退，結(jié)節(jié)隨之縮小，呈退行性生長(zhǎng)表現(xiàn)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中接種hUCMSCs的動(dòng)物在接種的幾天后出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，隨著機(jī)體的組織修復(fù)，炎癥反應(yīng)減退，壞死的組織細(xì)胞被巨噬細(xì)胞清除，結(jié)節(jié)逐漸減少至消失。本實(shí)驗(yàn)中6個(gè)hUCMSCs實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在注射后結(jié)節(jié)形成和消失的趨勢(shì)一致，表明因?yàn)檠装Y反應(yīng)產(chǎn)生皮下局部結(jié)節(jié)的推測(cè)是可信的；并且其生長(zhǎng)模式和陽(yáng)性對(duì)照組Hela細(xì)胞皮下接種后形成的結(jié)節(jié)呈進(jìn)行性增長(zhǎng)模式不同，在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組全部動(dòng)物注射部位局部已經(jīng)完全沒有結(jié)節(jié)的痕跡，而陽(yáng)性對(duì)照組，存在肉眼可見的皮下結(jié)節(jié)，且對(duì)結(jié)節(jié)進(jìn)行病理切片觀察，可以看到符合腫瘤細(xì)胞活躍增殖的核分裂像，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示，無(wú)論hUCMSCs體外傳代擴(kuò)增至第2代、第6代還是第10代，移植至動(dòng)物體內(nèi)均不具有致瘤性，與許鍵煒等[20]第4代hUCMSCs體內(nèi)致瘤性研究結(jié)果一致。

然而，鑒于MSCs與腫瘤細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用，尚需要更多、更深入的研究才能更全面地揭示hUCMSCs臨床應(yīng)用的致瘤和促瘤風(fēng)險(xiǎn)。

hUCMSCs對(duì)裸鼠WiDr和Raji移植瘤模型的腫瘤增殖無(wú)促進(jìn)作用，同時(shí)不同代次的hUCMSCs在NOD/SCID裸鼠體內(nèi)移植也不具有致瘤性。

1 Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells∶characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy[J]. J Cell Mol Med, 2004, 8(3)∶301-316.

2 吳世凱, 丁長(zhǎng)才, 柏蕓, 等. 成體干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 10(14)∶2763-2767.

3 Van Pham P, Truong NC, Le PT, et al. Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications [J]. Cell Tissue Bank, 2016, 17(2)∶289-302.

4 Fierro FA, Sierralta WD, Epu?an MJ, et al. Marrow-derived mesenchymal stem cells∶ Role in epithelial tumor cell determination[J]. Clin Exp Metastasis, 2004, 21(4)∶313-319.

5 Zhu W, Xu W, Jiang R, et al. Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo[J]. Exp Mol Pathol, 2006, 80(3)∶267-274.

6 曾桂芳, 謝長(zhǎng)峰, 杜杰, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2015, 5(4)∶21-28.

7 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心. 細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物非臨床評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則[G]. 北京∶ 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心, 2006∶3-7

8 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編[G].北京∶ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政司, 1993∶ 137～139.

9 李翠. 王甦.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞研究中的若干問題[J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2010, 13(6)∶470-473.

10 Liang J, Zhang HY, Hua BZ, et al. Allogenic mesenchymal stem cells transplantation in refractory systemic lupus erythematosus∶a pilot clinical study[J]. Ann Rheum Dis, 2010, 69(8)∶1423-1429.

11 Liang J, Gu F, Wang H, et al. Mesenchymal stem cell transplantation for diffuse alveolar hemorrhage in SLE[J]. Nat Rev Rheumatol, 2010, 6(8)∶486-489.

12 Sun L, Wang D, Liang J, et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis Rheum, 2010, 62(8)∶2467-2475.

13 Shi D, Wang D, Li X, et al. Allogeneic transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for diffuse alveolar hemorrhage in systemic lupus erythematosus[J]. Clin Rheumatol, 2012, 31(5)∶841-846.

14 Dandan Wang, Kentaro Akiyama, Huayong Zhang, etc. Double aloogenic mesenchymal stem cells transplantations could not enchance therapeutic effect compared with single transplantation in systemic lupus erhthematosus. Clinical and Developmental Immunology.2012, 2012∶273291. doi∶ 10.1155/2012/273291. Epub 2012 Jul 9.

15 Wang D, Zhang H, Liang J, et al. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in severe and refractory systemic lupus erythematosus∶4 years of experience [J]. Cell Transplant, 2013, 22(12)∶2267-2277.

16 Wang D, Li J, Zhang Y, et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus∶ a multicenter clinical study[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(2)∶R79.

17 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stem cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006, 8(4)∶315-317.

18 許文靜, 郭建光, 吳艷秋, 等. SPF級(jí)SCID-BG小鼠與BALB/c裸小鼠、SCID小鼠部分免疫指標(biāo)的測(cè)定與比較[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2013, 33(2)∶153-156.

19 龐一琳, 張斌, 陳虎. 間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用∶促進(jìn)還是抑制[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2013, 3(1)∶31-38.

20 許鍵煒, 何志旭, 舒莉萍, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤性試驗(yàn)[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 40(1)∶17-19.

Experimental investigation on tumorigenicity of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in nude mice

Xie Changfeng1, Du Jie2, Zeng Guifang1, Xu Shaokun1, Liang Xiao1, Li Chan1, Zuo Conglin2, Liu Muyun1, Hu Xiang1.1Shenzhen Beike Bio-Technology Company Limited, Shenzhen 518062, China;2Joinn Laboratories Company Limited, Beijing 100176, China

Liu Muyun, Email:muyun@beike.cc

Objective To study whether human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUCMSCs) has tumor enhancement effect and tumoroginicity in nude mice, and to provide safety evidence for clinical use. Method hUCMSCs were intravenously injected into colo-205 bearing BALB/c nude mice and Raji bearing CB-17 SCID mice to evaluate its effects on tumor growth. WiDr animals were randomized into 4 groups (n = 8 for each group)∶ model group, hUCMSCs low, median and high dose groups. Raji animals were randomized into 5 groups (n = 7 for each group)∶ control group, model group, hUCMSCs low, median and high dose groups. P2, P6and P10 hUCMSCs were subcutaneously injected into NOD/SCID mice and animals were sacrificed at 3rd and 12th week respectivelyto observe the formation of tumors to evaluate tumorigenicity of hUCMSCs. t-test was used to compare tumor volumes and tumor weights. The relative tumor inhabitation rate, T/C％, was also calculated. Results The tumor volumes of median and high dose groups were smaller than the control group in WiDr tests at day 43（586.7±274.4）mm3,（689.5±114.8）mm3vs（945.9±234.0）mm3，P ＜ 0.05, but their T/C％ was greater than 40％; the tumor volumes of low-, median- and high-dose groups were smaller than the control group at day 51（777.8±346.7）mm3,（793.1±358.6）mm3,（800.7±116.5）mm3vs（1300.0± 356.8）mm3, P ＜ 0.05, but their T/C％ were greater than 40％; the study indicated that 3 doses of hUCMSCs have no effect on growth of WiDr tumor. The tumor volumes in all doses of hUCMSCs has no significant difference in all the time points compared to the control group in Raji tests (P ＞0.05), indicated that hUCMSCs did not affect tumor growth. Pathological examination showed the same results. No tumor transformation tendency was observed in gross and pathological examination in NOD/SCID mice when hUCMSCs groups of three different passages and MRC-5 negative control group were intravenously injected into NOD/SCID mice. Conclusion The study indicated that the hUCMSCs do not affect growth of WiDr or Raji tumor in nude mice, and hUCMSCs of different passages don't have tumorigenicity in NOD/SCID mice.

Umbilical cord; Mesenchymal stem cell; Tumorigenicity; Tumor enhancement

2016-06-11）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.006

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JSGG20130917151830203）

518062 深圳，北科生物科技有限公司1；100176 北京，昭衍新藥研究中心股份有限公司2

劉沐蕓，Email：muyun@beike.cc

前兩位作者對(duì)本文具有相同貢獻(xiàn)，同為第一作者

謝長(zhǎng)峰，杜杰，曾桂芳,等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)裸鼠的促瘤和致瘤性研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶356-362.