閆曉霞，劉歡歡，曾夢(mèng)穎，高洪，嚴(yán)玉霖

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

PRRSV體外感染PAMs對(duì)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

閆曉霞，劉歡歡，曾夢(mèng)穎，高洪，嚴(yán)玉霖*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

為探討豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)對(duì)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響,選用PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭，無菌分離PAMs，隨機(jī)將其分為對(duì)照組、PRRSV感染組(PRRSV組)、PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組，分別在培養(yǎng)6、12、24、48和60 h收集PAMs。運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ和PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量在感染PAMs后6～24 h逐漸升高，在48 h有所下調(diào)，在60 h再次升高，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，24、48 h顯著高于對(duì)照組，而到60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平；與同時(shí)間點(diǎn)的PRRSV組相比，PRRSV+PHA組中PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量有所下調(diào)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量有所上調(diào)；而RRRSV+Dex組PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量有所上調(diào)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量所下調(diào)。結(jié)果表明，IFN-γ 在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖，IFN-γ的抑制可能是PRRSV導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；肺泡巨噬細(xì)胞；干擾素-γ

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒[1-2]。根據(jù)基因組及致病性的差異，PRRSV可分為2個(gè)型，即歐洲型(LV株為代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株為代表株)[3]。PRRSV主要侵害肺泡巨噬細(xì)胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAMs)，從而導(dǎo)致彌散性間質(zhì)性肺炎，損害機(jī)體免疫機(jī)能，進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成繼發(fā)性感染[4]，給世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。干擾素(interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子,主要由活化的T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，促進(jìn)抗病毒免疫[6-7]。 國內(nèi)外對(duì)PRRSV感染PAMs的研究主要局限在I型干擾素。鑒于此，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)PRRSV 感染PAMs不同時(shí)期IFN-γmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行檢測(cè)，從而了解IFN-γ與PRRSV 抗感染之間的關(guān)系，為PRRSV的防控提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 PRRSV云南株YN-2011(登錄號(hào)：JX857698)由本實(shí)驗(yàn)室分離純化保存，其TCID50為1 mL 105.06。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)ELISA 和RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭。

1.1.3 主要儀器與試劑 XDS-2倒置顯微鏡購自重慶光電儀器總公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo scientific公司；BIO-RAD-CFX熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；PHA-L購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser、SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程( 大連) 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺泡巨噬細(xì)胞的制備 將試驗(yàn)豬置于無菌室解剖臺(tái)上，頸靜脈放血致死，剖開胸腔，結(jié)扎氣管后連同心臟取出完整的肺，用0.01 g/L pH 7.4的PBS充分漂洗肺表面，清除血塊，從氣管往肺注入0.01 g/L pH 7.4的PBS 50～100 mL,輕輕拍打肺表面1～2 min后回收灌洗液，用單層無菌過濾篩過濾，收集全部灌洗液，1500 r/min離心5 min，最后用含有雙抗的 PBS洗滌PAMs兩次，1500 r/min離心5 min，即為所得PAM。RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL-1，以每孔2 mL鋪在6孔細(xì)胞板于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，當(dāng)PAMs貼壁后，棄上清,待用。

1.2.2 試驗(yàn)分組與處理 將生長在6 孔板上的PAMs 細(xì)胞分為4 組。正常對(duì)照組；PRRSV感染組；PRRSV+PHA組：在經(jīng)過PRRSV感染后的PAMs中加入5 μg/mL的PHA-L進(jìn)行處理[8]；RRRSV+Dex組：在經(jīng)過PRRSV感染后的PAMs中加入0.1 mg/mL的Dex進(jìn)行處理[9]。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。各組加入的病毒量為100 μL，對(duì)照組接種等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別于感染后6、12、24、48和60 h收集PAMs，-80 ℃保存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV和IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平 使用Trizol提取總RNA，應(yīng)用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20 ℃保存。Realtime-PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)12.5 μL， 上、下游引物(表1)各1.0 μL，cDNA 2 μL，dH20 8.5 μL。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，Tm 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.4 IFN-γ與PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析 根據(jù)各試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)IFN-γ與PRRSV mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，以PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平為縱坐標(biāo)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平為橫坐標(biāo)，做轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞中IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)Ct值，用2-△△Ct計(jì)算不同組IFN-γ mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。IFN-γ mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平如圖1。PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，6 h顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，24和48 h顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而到60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平；PRRSV+PHA組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組及PRRSV組；RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在6、12、24和60 h顯著低于對(duì)照組和PRRSV組(P<0.01或P<0.05)。

圖1 IFN-γ mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

圖2 PRRSV mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 細(xì)胞中PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)Ct值，用2-△△Ct計(jì)算不同組PRRSV mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。由圖2可以看出，PRRSV組PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量在感染后6～24 h逐漸升高，48 h有所下調(diào)，60 h再次升高；PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV組中PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量相比顯著下調(diào)(P<0.01或P<0.05)；RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV感染組相比有所上調(diào)，在12、24 h差異顯著(P<0.01或P<0.05)。

2.3 IFN-γ與PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析 不同試驗(yàn)組之間IFN-γ與PRRSV mRNA相關(guān)性分析見圖3。根據(jù)|R|∈[0.1,0.3)為弱相關(guān)，|R|∈[0.3,0.5)為中等相關(guān)，|R|∈[0.5,1.0]為強(qiáng)相關(guān)得出：PRRSV感染組R2=0.01728，R=0.13，弱相關(guān)；PRRSV+PHA組R2=0.0176，R=0.13，弱相關(guān)；RRRSV+Dex組R2=0.086，R=0.29，弱相關(guān)。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組 IFN-γ與PRRSV轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析

3 討論與小結(jié)

IFN-γ主要是由抗原、有絲分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞所分泌的一類可溶性糖蛋白，有較強(qiáng)的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用，如誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、星狀細(xì)胞等MHCⅡ類抗原的表達(dá)，使其參與抗原遞呈和特異性免疫的識(shí)別過程，促進(jìn)巨噬細(xì)胞 FcγR 表達(dá)，協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors, TNF )并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物[10]?？乖?、T細(xì)胞促分裂素(PHA)、細(xì)胞因子(IL-2、IL-12、IL-18)會(huì)誘導(dǎo)IFN-γ的合成，地塞米松、糖皮質(zhì)激素、IL-10對(duì)INF-γ的產(chǎn)生具有抑制作用[11]。因此選取PHA作為陽性對(duì)照，地塞米松作為陰性對(duì)照。本研究應(yīng)用q-PCR技術(shù)對(duì)不同組中IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，說明PRRSV可以刺激PAMs分泌IFN-γ。而6 、12 h低于對(duì)照組，說明該時(shí)期可能處于病毒感染的初期，刺激PAMs分泌IFN-γ的能力較弱，而到了60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平是因?yàn)椴《驹赑AMs中的增殖，大量的PAMs已脫落、凋亡。以上結(jié)果與夏九鮮等人的研究結(jié)果相類似[12]。而PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別高于和低于同時(shí)間點(diǎn)的PRRSV組，這一結(jié)果與T細(xì)胞促分裂素(PHA)會(huì)誘導(dǎo)IFN-γ的合成，地塞米松對(duì)INF-γ的產(chǎn)生具有抑制作用的研究相符[11]。

已有研究表明IFN-γ可以抑制PRRSV 在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖。本研究應(yīng)用q-PCR技術(shù)對(duì)不同組中PRRSV的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV組中PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量相比顯著下調(diào)，這一結(jié)果與利用IL-12處理PAMs刺激其分泌IFN-γ最終可以降低PRRSV在PAMs中的增殖的結(jié)果相類似[8]。RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV感染組相比有所上調(diào)，這與佟杰[13]等研究地塞米松可以加強(qiáng)PRRSV在體內(nèi)的復(fù)制，從而使病毒感染造成的損傷加重的結(jié)果相類似。另外，本研究結(jié)果顯示PRRSV組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平與PRRSV轉(zhuǎn)錄水平存在弱負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明PRRSV在PAMs細(xì)胞內(nèi)的增殖復(fù)制抑制了IFN-γ的產(chǎn)生，這也是PRRSV導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的機(jī)制之一。

研究結(jié)果對(duì)于臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義，結(jié)果表明PRRSV感染后可用PHA等藥物或促進(jìn)劑刺激干擾素的產(chǎn)生，對(duì)PRRSV的復(fù)制增殖具有一定的抑制作用，這與臨床中用干擾素治療PRRSV豬只的研究類似[14]；DEX是糖皮質(zhì)激素類藥物，雖具有抗炎、抗過敏和抗毒作用，但本研究結(jié)果顯示DEX抑制IFN-γ的產(chǎn)生，從而促進(jìn)了PRRSV的增殖復(fù)制，因此PRRSV感染后不建議使用DEX，這與佟杰等[13]連續(xù)7 d低劑量注射DEX會(huì)造成仔豬機(jī)體免疫抑制，增加其死亡率的結(jié)果一致。

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(編輯：侯向輝)

The Effects of PRRSV Infected PAMs on Transcription Levels of IFN-γinVitro

YAN Xiao-xia, LIU Huan-huan, ZENG Meng-ying, GAO Hong, YAN Yu-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming, 650201,China)

To explore the effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infected pulmonary alveolar macrophage (PAMs) on transcription levels of IFN-γinvitro，three four weeks old piglet free of PRRSV was used in this experiment. The PAMs were isolated aseptically and divided into control group, PRRSV infection group (PRRSV group),PRRSV+PHA group，PRRSV+Dex group and culturedinvitro. The PAMs were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post infection. The mRNA transcription of IFN-γ and PRRSV were analyzed by Real-Time PCR. The results shows that the mRNA levels of PRRSV in PRRSV group were gradually increased at 6～24 h and were decreased at 48 h ; the transcription of IFN-γ were gradually increased at 6～48 and significantly higher at 24 and 48 h than control group. PRRSV+PHA group the mRNA levels of PRRSV were slightly lower and the IFN-γ is higher than PRRSV group; RRRSV+Dex group the mRNA transcription of PRRSV were higher but the IFN-γ is lower.The results indicated IFN-γ can inhibit the proliferation of PRRSV in PAMs，the inhibition of IFN -γ is probably one of the mechanisms that PRRSV cause cellular damage.

PRRSV；PAMs；IFN-γ

2016-07-07

A

1002-1280 (2016) 10-0001-05

S852.65

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160496，31360599)；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)2015年研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015ykc4)