張海月，康元環(huán)，孫武文，陳龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，單曉楓，錢愛(ài)東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的生物學(xué)活性分析

張海月，康元環(huán)，孫武文，陳龍，張冬星，安鼎杰，田佳鑫，單曉楓*，錢愛(ài)東*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

為研究維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物在烏鱧感染中的致病作用以及維氏氣單胞菌的致病機(jī)理，以烏鱧源維氏氣單胞菌WL161為研究對(duì)象，提取其胞外產(chǎn)物，采用打孔法測(cè)定其胞外產(chǎn)物的酶活性，并對(duì)與毒力密切相關(guān)的溶血活性進(jìn)行進(jìn)一步的溶血譜研究，同時(shí)分析其致病性。應(yīng)用LC-MSMS方法對(duì)其胞外產(chǎn)物蛋白成分進(jìn)行鑒定，利用Gene Ontology(GO)對(duì)已鑒定蛋白進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分的分類分析。結(jié)果表明，WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性；ECP對(duì)其他多種動(dòng)物紅細(xì)胞均有溶血活性，對(duì)魚(yú)類紅細(xì)胞溶血性較強(qiáng)，但對(duì)雞紅細(xì)胞無(wú)溶血活性。其胞外產(chǎn)物共檢測(cè)出118種蛋白，共參與40種生物學(xué)過(guò)程，主要涉及碳水化合物代謝過(guò)程、幾丁質(zhì)分解代謝過(guò)程、DNA結(jié)合等；69種分子功能主要涉及ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、碳水化合物結(jié)合等；19種細(xì)胞組分主要包括胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外膜等。

維氏氣單胞菌；胞外產(chǎn)物；酶活；GO分類分析

維氏氣單胞菌是一種人獸魚(yú)共患病原菌[1]，該菌對(duì)多種不良環(huán)境具有耐受能力，可在4 ℃條件下緩慢生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒力因子[2-3]，其毒力有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)毒菌株可能感染宿主使之發(fā)病，或者通過(guò)一定的傳播途徑感染其他動(dòng)物，患病動(dòng)物以出血性敗血癥和腸炎等為主要臨床表征[4]。胞外產(chǎn)物(ECP)是致病菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中釋放出的代謝產(chǎn)物，是侵染機(jī)體的主要成分之一[5]。ECP可以抵抗宿主免疫因子的作用，分解破壞宿主機(jī)體的組織成分，有利于其他病原的進(jìn)一步侵染；還可以破壞機(jī)體血淋巴中凝血系統(tǒng)的酶活性，破壞血細(xì)胞，并導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生等等，因此ECP成為決定病原菌毒力的重要因素之一[6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物為研究材料，對(duì)其主要蛋白酶活性、致病性及蛋白成分進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌種 烏鱧源維氏氣單胞菌WL161，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定[7]并保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用斑馬魚(yú)購(gòu)自長(zhǎng)春市某花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，體重0.3～0.4 g，體長(zhǎng)3.0～3.5 cm，暫養(yǎng)觀察2周無(wú)異常后進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前禁食24 h。

1.3 維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物(ECP)的制備 在無(wú)菌條件下，用鉑耳在TSA平板上挑取單菌落接種于不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后收集培養(yǎng)物，4 ℃，12000 r/min離心30 min，收集上清液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，加入固體硫酸銨至75%的飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜。4 ℃，12000 r/min 離心30 min，棄上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1 (pH 7.4)緩沖液將沉淀重懸，經(jīng)透析，聚乙二醇(PEG)10000濃縮，得到胞外產(chǎn)物，然后涂于TSA固體平板，確定無(wú)菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.4 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性分析 用打孔法測(cè)定維氏氣單胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明膠酶酶活性以及溶血活性。分別配置含可溶性淀粉(2%)、吐溫80 (1%)、脫脂牛奶 (8%)、明膠(4%)和兔鮮血(7%)的TSA平板。用直徑為6 mm打孔器在平板上打孔并用酒精燈火焰稍微加熱封底。向孔內(nèi)加入50 μL胞外產(chǎn)物以50 μL TSA液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1.5 胞外產(chǎn)物溶血譜測(cè)定 參照Sahu I等[8]的方法略有改進(jìn)，測(cè)定胞外產(chǎn)物對(duì)鯽魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)、鰱魚(yú)、雞、兔、小白鼠等動(dòng)物紅細(xì)胞的溶血價(jià)。胞外產(chǎn)物用無(wú)菌生理鹽水在96孔板上倍比稀釋，然后加入等量的2%紅細(xì)胞，輕輕混勻，37 ℃溫箱放置1 h，然后4 ℃冰箱過(guò)夜，以50%的紅細(xì)胞溶解的ECP最高稀釋度為溶血價(jià)。設(shè)2個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組A為不加任何物質(zhì)的紅細(xì)胞稀釋液，對(duì)照組B為100%溶血的紅細(xì)胞懸液。1.6 胞外產(chǎn)物致病性的測(cè)定 將200尾健康斑馬魚(yú)隨機(jī)分成4組，試驗(yàn)Ⅰ組將維氏氣單胞菌離心取沉淀，并用PBS反復(fù)洗滌3次，以去除ECP，并用無(wú)菌PBS十倍遞進(jìn)稀釋至2.8×108、2.8×107、2.8×106、2.8×105、2.8×104、2.8×103CFU/mL，每個(gè)濃度注射10尾；試驗(yàn)Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物，ECP濃度為0.48 mg/mL，用無(wú)菌PBS倍比稀釋至0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 mg/mL，每個(gè)濃度注射10尾；試驗(yàn)Ⅲ組注射處理后的維氏氣單胞菌菌體與胞外產(chǎn)物的混合物，具體情況見(jiàn)表2；對(duì)照組20尾注射無(wú)菌PBS，每尾斑馬魚(yú)腹腔注射10 μL。感染后觀察7 d，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量。

1.7 胞外產(chǎn)物蛋白成分鑒定及GO功能分析 純化WL161胞外產(chǎn)物，采用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合的方法(LC-MSMS)對(duì)胞外產(chǎn)物蛋白成分進(jìn)行鑒定。通過(guò)Blast檢索序列相似的模式生物蛋白，對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO功能分析(生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分)，信息來(lái)自 UNIPROT (http://www.uniprot.org)網(wǎng)站。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外產(chǎn)物的酶活性及溶血性 維氏氣單胞菌WL161的胞外產(chǎn)物在各平板上30 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，淀粉平板加入盧戈氏碘液后加樣孔周圍出現(xiàn)透明環(huán)；吐溫80平板加樣孔周圍出現(xiàn)了不透明的白色暈圈；脫脂牛奶平板加樣孔周圍出現(xiàn)了透明環(huán)；兔血培養(yǎng)基平板加樣孔周圍出現(xiàn)了無(wú)色透明環(huán)；明膠酶培養(yǎng)基平板加樣孔周圍無(wú)變化(圖1)。結(jié)果表明，維氏氣單胞菌WL161株胞外產(chǎn)物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明膠酶活性。

A.淀粉酶;B.脂肪酶;C.蛋白酶;D.溶血活性;E.明膠酶圖1 WL161胞外產(chǎn)物的酶活性

2.2 胞外產(chǎn)物溶血譜測(cè)定結(jié)果 WL161胞外產(chǎn)物對(duì)鯉魚(yú)的溶血價(jià)最高為26；其次為鯽魚(yú)和鰱魚(yú)25；

烏鱧和草魚(yú)溶血價(jià)均為24；對(duì)兔和小白鼠溶血價(jià)分別為23、22；對(duì)雞紅細(xì)胞無(wú)溶血作用(表1)。

表1 維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物溶血譜

注：-為無(wú)溶血活性

2.3 致病性 健康斑馬魚(yú)攻毒后都有不同程度的死亡現(xiàn)象產(chǎn)生，試驗(yàn)Ⅲ組注射處理后維氏氣單胞菌菌體與胞外產(chǎn)物混合物具有較強(qiáng)的致病性，2.8×107CFU/mL的菌液混有0.24 mg/mL胞外產(chǎn)物時(shí)死亡率達(dá)到100%，且攻毒后3 h即發(fā)生死亡，12 h時(shí)已死亡70%；試驗(yàn)Ⅱ組注射維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物，濃度0.48 mg/mL時(shí)死亡率為100%，攻毒后6 h即發(fā)生死亡；試驗(yàn)Ⅰ組注射處理后維氏氣單胞菌菌體，攻菌濃度為2.8×108CFU/mL時(shí)全部死亡；PBS對(duì)照組均未死亡(表2)。

2.4 質(zhì)譜鑒定與蛋白功能分析 運(yùn)用LC-MSMS方法分析維氏氣單胞菌WL161胞外產(chǎn)物，共檢測(cè)出118種蛋白，其中有27種為功能未知蛋白，43種假定蛋白，其余蛋白分別為蛋白酶S8、外膜血紅素受體、麥芽糖孔蛋白、菌毛蛋白、鞭毛鉤蛋白FlgE、分泌蛋白等等。其中具有絲氨酸內(nèi)肽酶活性的蛋白酶S8為可信度最高蛋白，其次為具有受體活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性的外膜血紅素受體和具有相同功能的一種假定蛋白，可信度同樣較高的蛋白還有：位于胞外區(qū)參與幾丁質(zhì)分解代謝過(guò)程和碳水化合物代謝過(guò)程的幾丁質(zhì)酶、胞外區(qū)的氣溶素、具有膜孔蛋白活性的外膜蛋白Aha1等。

表2 WL161菌株及其胞外產(chǎn)物致病性分析結(jié)果

續(xù)表

根據(jù)所鑒定蛋白的GO注釋信息，對(duì)其進(jìn)行GO分類：其中參與生物學(xué)過(guò)程的蛋白有40種，這些生物學(xué)過(guò)程主要包括碳水化合物代謝過(guò)程、幾丁質(zhì)分解代謝過(guò)程和DNA結(jié)合等；參與分子功能的蛋白共有69種，其中具有ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、碳水化合物結(jié)合功能的蛋白較多；參與細(xì)胞組分的蛋白共有19種，這些蛋白主要位于胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外膜等。

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)對(duì)烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的酶活性進(jìn)行了初步分析。與目前已報(bào)道的維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物酶活性存在差異[7-9]，具體原因可能與分離魚(yú)的種類、菌株致病性不同等有關(guān)。由于淀粉酶具有分解糖原的作用，脂肪酶分解脂類，蛋白酶能分解膠原等蛋白成分，溶血活性導(dǎo)致各組織出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。所以當(dāng)維氏氣單胞菌感染烏鱧時(shí)，分泌的ECP的酶活性與溶血活性致使烏鱧的肌肉組織、結(jié)締組織、上皮組織等溶解，從而為細(xì)菌提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌增殖，胞外產(chǎn)物中的酶量也隨即增多，對(duì)烏鱧皮膚、肌肉的破壞程度也不斷增加，從而引起烏鱧出血和潰瘍。

維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物能溶解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，但對(duì)不同動(dòng)物的紅細(xì)胞的敏感性存在差異。胞外產(chǎn)物對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用與動(dòng)物種類有很大關(guān)系，不同動(dòng)物溶血價(jià)不同。本試驗(yàn)中胞外產(chǎn)物對(duì)魚(yú)類紅細(xì)胞的溶血價(jià)比其它動(dòng)物要高。鄔向東[10]等發(fā)現(xiàn)鱔魚(yú)源嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物、楊賀[9]等發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)鮰源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物對(duì)魚(yú)類紅細(xì)胞溶血價(jià)比對(duì)其他動(dòng)物高，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

通過(guò)對(duì)致病性的分析發(fā)現(xiàn)，菌體與胞外產(chǎn)物混合感染斑馬魚(yú)時(shí)，短時(shí)間內(nèi)即發(fā)生死亡，同等濃度時(shí)毒力較單獨(dú)攻菌體或胞外產(chǎn)物有所增強(qiáng)；單獨(dú)感染胞外產(chǎn)物即可導(dǎo)致斑馬魚(yú)的發(fā)病和死亡，死亡率也較高，且致病性較單獨(dú)感染菌體稍強(qiáng)；感染維氏氣單胞菌菌體時(shí)，死亡數(shù)量開(kāi)始較少，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡數(shù)量逐漸增多，呈遞增趨勢(shì)，究其原因，該組注射的病原菌不含有ECP，對(duì)魚(yú)的致死性依賴于細(xì)菌在體內(nèi)的增值。

經(jīng)過(guò)GO分類分析發(fā)現(xiàn)，蛋白具有較為廣泛的生物學(xué)功能覆蓋范圍，從生物學(xué)過(guò)程中可以看出胞外產(chǎn)物參與調(diào)控的蛋白多是參與能量代謝相關(guān)途徑，如碳水化合物代謝、幾丁質(zhì)分解代謝等。細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白更多定位于生命活動(dòng)的主要場(chǎng)所細(xì)胞質(zhì)、胞外區(qū)和細(xì)胞外膜。分子功能分析表明這些蛋白的功能集中在ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、碳水化合物結(jié)合及水解酶活性等。

[1] 單曉楓, 康元環(huán), 夏京津, 等. 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌生物學(xué)特性比較研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2015，(3): 82-85.

[2] González-Rodríguez, M N，Sanz，J J Santos,etal.Foodborne pathogenic bacteria in prepackaged fresh retail portions of farmed rainbow trout and salmon stored at 3℃[J].International Journal of Food Microbiology, 2002, 76:135-141.

[3] Castro-Escarpulli G，F(xiàn)igueras M J，Aguilera-Arreola,etal.Characterisation ofAeromonasspp. isolated from frozen fish intended for human consumption in Mexico[J].International journal of food microbiology,2003,84(1)： 41-49.

[4] 孟彥, 肖漢兵, 張林, 等. 施氏鱘出血性敗血癥病原菌的分離和鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 26(6): 822-826.

[5] 耿毅, 汪開(kāi)毓, 肖丹, 等. 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外產(chǎn)物對(duì)斑點(diǎn)叉尾損傷的病理學(xué)研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2010, 34(2): 345-352.

[6] 華麗. 斑點(diǎn)叉尾鮰源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物生物特性分析及致病性研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[7] 康元環(huán), 孟慶峰, 夏京津, 等. 烏鱧致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 35(5): 40-43.

[8] Sahu I, Das B K, Marhual N,etal. Toxicity of crude extracellular products of Aeromonas hydrophila on rohu, Labeo rohita (Ham.)[J]. Indian journal of microbiology，2011, 51(4): 515-520.

[9] 賀揚(yáng), 華麗, 汪開(kāi)毓, 等. 高致病性維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物對(duì)斑點(diǎn)鲖的致病性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2016, 40(3): 457-467.

[10]鄔向東, 何后軍, 周秋白, 等. 鱔魚(yú)嗜水氣單胞菌外毒素的分離純化及活性研究[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2008, 12(1): 38-41.

(編輯：侯向輝)

Bioactivity Analysis of Extracellular Products ofAeromonasveroniiStrain Isolated from Channa Argus
ZHANG Hai-yue，KANG Yuan-huan，SUN Wu-wen，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，
AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，SHAN Xiao-feng*，QIAN Ai-dong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveronii，this study extracted the extracellular products fromAeromonasveroniiWL161.The enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by punch method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analysed biological process,molecular function and cellular components,respectively.The results showed that WL161 had amylase and lipase activity, protease and hemolytic activity,without gelatinase activity.ECP of most animals have a hemolytic activity, and the hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte, while no hemolytic activity to chicken erythrocyte.118 kinds of proteins were detected by the extracellular products.These proteins involved in 40 kinds of biological processes,especially carbohydrate metabolism process,chitin catabolic process and DNA binding;69 kinds of molecular functions,mainly involved ATP binding,metal ion binding,carbohydrate binding;19 kinds of celelular components, including extracellular region,cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; GO classification analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201927)；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204065NY)

2016-08-29

A

1002-1280 (2016) 10-0006-04

S852.61